细胞增殖和活力

6. CCK8检测法


是一种基于WST‐8的广泛应用于细胞增殖和细胞毒性的 快速高灵敏度检测方法。CCK‐8细胞活性检测试剂中含 有WST‐8：2‐(2‐甲氧基‐4‐硝基苯基)‐3‐(4‐硝基苯 基)‐5‐(2,4‐二磺酸苯)‐2H‐四唑单钠盐]。 WST‐8是一种 类似于MTT的化合物，在电子耦合试剂存在的情况下， 可以被线粒体内的一些脱氢酶还原生成橙黄色的甲瓒产 物formazan。细胞增殖越多越快，则颜色越深；细胞毒 性越大，则颜色越浅。对于同样的细胞，颜色的深浅和 细胞数目呈线性关系。 用酶联免疫检测仪在450nm波长处测定其光吸收值，可 间接反映活细胞数量。该方法已被广泛用于一些生物活 性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞增 殖试验、细胞毒性试验以及药敏试验等。
细胞增殖和细胞活力
中心实验室 李娜
检测细胞增殖能力的方法

一种是直接的方法，通过直接测定进行分裂的细胞数来 评价细胞的增殖能力。 一种是间接的方法，即细胞活力（cell viability）检测 方法，通过检测样品中健康细胞的数目来评价细胞的增 殖能力。 细胞活力检测法并不能最终证明检测样品中的细胞是否 在增殖。如细胞在某一培养条件下会自发启动凋亡程序， 但药物的干扰可抑制凋亡的发生；这时若采用细胞活力 检测法，显然可以区分两种条件下的细胞数量，但我们 并不能从药物干扰组细胞数大于对照组的事实说明药物 可促进细胞增殖的结论。所以最直接的证据应该采用方 法一。
注意事项-避免血清干扰
用含15%胎牛血清培养液培养细胞时，高的血
清物质会影响试验孔的光吸收值。由于试验本 底增加，会试验敏感性。 一般选小于10%胎牛血清的培养液进行。在呈 色后，尽量吸净培养孔内残余培养液。
谢谢！
细胞计数
计算板四大格细胞总数，压线细胞只计左侧和上方的。然 后按公式计算：细胞数/mL=四大格细胞总数/4×104
选择策略
怎样选择最适合的检测方法，主要依赖于使用
的细胞类型和具体研究方案，还取决于实验者 在细胞增殖中期望得到的信息。 假如希望了解细胞增殖中的代谢活性变化，可 以使用四唑盐和比色法检测；如果关注重点在 于对DNA合成的改变，可以选择用BrdU或EdU 标记，再通过比色法、化学发光或荧光检测进 行分析；若研究的是单个细胞，也可以用BrdU 或EdU标记来检测DNA合成，将其与荧光标记 的相应抗体结合，就可以通过流式细胞仪来进 行流式分选。
5. 羟基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂 (CFSE)检测法
CFSE能够轻易穿透细胞膜，在活细胞内聚积并
与胞内蛋白共价结合，水解后的CFSE释放出荧 光物质，这些共价结合的荧光物分子很少从细 胞内脱落。CFSE标记后的细胞用于体内观察可 以长达数周。 因此，CFSE常被用来做活细胞检测试验和用荧 光电镜观察细胞长期活动的试验。 利用流式细胞仪在488nm激发光和荧光检测通 道可对其进行分析。 CFSE标记的细胞的激发和发射波长分别为500 nm和520 nm
注意事项-设置调零孔
实验时应设臵调零孔，对照孔，加药孔。 调零孔加培养基、MTT、二甲基亚砜。 对照孔和加药孔都要加细胞、培养液、MTT、
二甲基亚砜 不同的是对照孔加溶解药物的介质 加药组加入不同浓度的药物。 每组设定3复孔 设空白对照：与试验平行不加细胞只加培养液 的空白对照。其他试验步骤保持一致，最后比 色以空白调零。
4.5-乙炔基-2’脱氧尿嘧啶核苷 （EdU）
也是一种胸腺嘧啶核苷类似物。它也能够在细
胞增殖时期代替胸腺嘧啶（T）渗入正在复制 的DNA分子，通过基于EdU与Apollo荧光染料的 特异性反应检测DNA复制活性，通过检测EdU 标记便能准确地反映细胞的增殖情况。EdU检 测染料只有BrdU抗体大小的1/500，在细胞内 很容易扩散，无需DNA变性（酸解、热解、酶 解等）即可有效检测，可有效避免样品损伤， 在细胞和组织水平能更准确地反映细胞增殖等 现象。
数目进行比较。 优点： 简单：不需要特定的试剂和仪器 准确 缺点： 不适合样品数量多的情况 不适合评估特定的亚群
台盼蓝
细胞损伤或死亡时，台盼蓝可穿透变性的细胞
膜，与解体的DNA 结合，使其着色。而活细胞 能阻止染料进入细胞内。故可以鉴别死细胞与 活细胞。
2.胸腺嘧啶核苷(3H-TdR)渗入法
选择策略
应该注意，测定细胞增殖很多时候单一方法都
是有缺陷的，四唑盐—MTT法不够精确；最直 接的指标是活细胞数量的变化，结果比较准确， 但细胞直接计数法所需细胞量较多，操作繁琐 费时；而3H掺入法麻烦且不安全。所以，建议 最好用两种以上的方法进行测定，这样做主要 是可以有一个用于辅助修正的数据。
注意事项-药物浓度的设定
一定要多看文献，参考别人的结果再定个比较
大的范围先初筛。根据自己初筛的结果缩小浓 度和时间范围再细筛。 切记！ 否则，可能你用的时间和浓度根本不是药物的 有效浓度和时间。
注意事项-时间点的设定
在不同时间点的测定OD值，输入excel表，最
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后得到不同时间点的抑制率变化情况，画出变 化的曲线，曲线什么时候变得平坦了（到了平 台期）那个时间点应该就是最好的时间点（因 为这个时候的细胞增殖抑制表现的最明显）。


8. ATP检测
细胞内的ATP含量受到了严格调控，检测ATP也
可以得到细胞增殖的信息。死亡细胞或即将死 亡的细胞几乎不含ATP，在细胞溶解物或提取 物中测得的ATP浓度与细胞数之间存在严格的 线性关系。 利用荧光素酶luciferase及其底物荧光素 luciferin的ATP检测以生物发光为基础，能够提 供非常灵敏的结果。如果有ATP存在荧光素酶 就会发光，而且其发光强度与ATP浓度成正比， 用能读取发光信号的光度计和酶标仪都可以方 便的进行检测。这种方法非常适用于高通量细 胞增殖检测和筛选。
胸腺嘧啶核苷（TdR）是DNA特有的碱基，也
是DNA合成的必需物质。用同位素H标记TdR即 H-TdR作为DNA合成的前体能掺入DNA合成代谢 过程，通过测定细胞 DNA链内标记核苷酸的量 的放射性强度，可以反映细胞DNA的代谢及细 胞增殖情况。 优点：3H-TdR掺入法敏感性高，客观性强，重复 性好。 缺点：但需一定设备条件，同时还存在放射性核 素污染问题。
3. 5-溴脱氧尿嘧啶核苷(Brdu)检测法
Brdu是胸腺嘧啶的衍生物，可代替胸腺嘧啶在
DNA合成期（S期），活体注射或细胞培养加入 ，而后利用Brdu专一性抗体，显示增殖细胞。 同时结合其它细胞标记物，双重染色，可判断 增殖细胞的种类，增殖速度，对研究细胞动力 学有重要意义。 BrdU标记很适合免疫组化IHC、免疫细胞化学 IC、细胞内ELISA、流式细胞分析和高通量筛选。 优点：不仅能用于体外实验，还能用于活体实 验， 缺点： 就是需要变性DNA后才能与抗体结合， 但这就破坏了DNA双链结构，影响了其他染料 的结合染色，导致染色弥散，准确性降低等问 题
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5. 羟基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂 (CFSE)检测法
羟基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂（CFSE）是
一种可穿透细胞膜的荧光染料，具有与细胞特 异性结合的琥珀酰亚胺脂基团和具有非酶促水 解作用的羟基荧光素二醋酸盐基团，使CFSE成 为一种良好的细胞标记物。 CFSE进入细胞后可以不可逆地与细胞内的氨基 结合偶联到细胞蛋白质上。当细胞分裂时， CFSE标记荧光可平均分配至两个子代细胞中， 因此其荧光强度是亲代细胞的一半。这样，在 一个增殖的细胞群中，各连续代细胞的荧光强 度呈对递减，利用流式细胞仪在488nm激发光 和荧光检测通道可对其进行分析。


细胞增殖检测技术
直接计数 胸腺嘧啶核苷(3H‐TdR)渗入法 5.5-溴脱氧尿嘧啶核苷(Brdu)检测法 5-乙炔基-2’脱氧尿嘧啶核苷（EdU） 羟基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂(CFSE)
检测法 CCK8 MTT检测法 ATP检测
1.直接计数
利用计数板或计数仪得出细胞的数目，然后对
注意事项-选择适当得细胞接种浓度。
一般情况下，96孔培养板的一内贴壁细胞长满
时约有105个细胞。但由于不同细胞贴壁后面 积差异很大，因此，在进行MTT试验前，要进 行预实验检测其贴壁率、倍增时间以及不同接 种细胞数条件下的生长曲线，确定试验中每孔 的接种细胞数和培养时间，以保证培养终止致 细胞过满。这样，才能保证MTT结晶形成酌量 与细胞数呈的线性关系。否则细胞数太多敏感 性降低，太少观察不到差异。
7. MTT检测法
MTT检测法主要反映细胞的能量代谢，是检测
细胞增殖活力的一种简便准确的方法。其原理 是在活细胞生长和增殖过程中，线粒体内的脱 氢酶可将黄色的MTT分解成兰紫色的水不溶性 的甲瓒(Formazan)，并沉积在细胞中，死细胞 无此功能。
活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为 水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒并沉积在细胞中，而死细胞 无此功能。二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的甲瓒， 用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值，可 间接反映活细胞数量。 在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数和细胞 活力成正比。MTT方法用于判断药物、外源性基因、小 RNA、蛋白、抗体、细胞因子、血清等对于细胞的作用， 以明确上述因子对于细胞生物学行为的影响（如细胞活 力、增殖、凋亡等方面）。
注意事项-培养时间
200ul的培养液对于10的4~5次方的增殖期细胞
来说，很难维持68h，如果营养不够的话，细 胞会由增殖期渐渐趋向G0期而趋于静止，影响 结果，我们是在48h换液的。
注意事项
MTT法只能测定细胞相对数和相对活力，不能
测定细胞绝对数。做MTT时，尽量无菌操作， 因为细菌也可以导致MTT比色OD值的升高。 理论未必都是对的。要根据自己的实际情况调 整。