细胞增殖和活力
细胞增殖及细胞活力检测方法
细胞增殖及细胞活力检测方法1.细胞计数法细胞计数法是最常用的细胞增殖检测方法之一、该方法通过显微镜观察细胞密度和数量来判断细胞的增殖情况。
首先，将培养皿中的细胞样本取出，使用显微镜观察细胞的形态和数量，然后用显微镜同时观察已知数量的细胞，计算出单位面积或体积中的细胞数量，最后通过比较细胞数量的变化来评估细胞的增殖情况。
2.三(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑盐(MTT)法MTT法是一种常用的细胞活力检测方法。
MTT是一种黄色噻唑盐，可以通过还原作用转化为紫色的甲氧基-4-硝基苯胺（formazan），这个转化过程是仅在活细胞中发生的。
首先，将MTT溶液加入细胞培养皿中，细胞内的活细胞色素（还原酶）可以将MTT转化为紫色的formazan。
然后，用溶剂将formazan溶解，测量溶液的吸光度，就可以通过测量吸光度的变化来评估细胞的活力。
3.荧光素酶体积法（ATP法）ATP法是一种用于检测细胞的能量代谢水平的方法。
ATP是细胞内的能量分子，在细胞进行代谢活动时会不断产生。
将细胞样品加入含有高能底物的反应溶液中，ATP酶将底物中的ATP转化为体积比较大的荧光素酶（luciferin）。
接下来，荧光素酶与荧光素生成一个反应产生的发光，发光强度与ATP浓度成正比。
通过测量发光强度来评估细胞的活力。
4.分子探针染色法分子探针是一种与特定分子结合的荧光标记物质，可以通过显微镜观察细胞中特定分子的分布和浓度。
常用的分子探针有细胞核染色剂（如DAPI），线粒体染色剂（如JC-1），胞质钙染色剂（如Fluo-3）等。
将细胞与特定分子探针共同孵育，根据分子探针的荧光强度和分布情况，可以评估细胞内特定分子的含量和活动水平，从而间接评估细胞的增殖和活力。
5.流式细胞术流式细胞术是一种基于细胞的物理和化学性质，通过细胞悬浮液在液体流动中的传递和分析的技术。
通过染色、抗体标记、荧光探针等方法，可以区分和分析细胞的不同类型和状态。
细胞增殖相关基因的表达变化及其对生长发育的影响
细胞增殖相关基因的表达变化及其对生长发育的影响细胞增殖是人体生长发育、组织修复和癌细胞繁殖的基础。
而生物体内细胞增殖相关基因的表达变化决定了细胞增殖活力的高低和细胞命运的走向。
本文将探讨细胞增殖相关基因的表达变化及其对生长发育的影响。
一、细胞增殖相关基因的表达变化1.增殖相关基因的分类增殖相关基因主要包括促增殖因子（如胰岛素样增生因子1-1、表皮生长因子、神经生长因子等）、细胞周期调控基因（如Cyclin、CDKs等）、转录因子（如MYC、FOS等）和凋亡抑制基因（如BCL-2、Survivin等）等。
2.细胞增殖相关基因的表达变化在胚胎发育和组织修复时，增殖相关基因的表达呈现出高水平，而在成熟组织中则表达水平较低。
此外，体内外环境的改变也会导致增殖相关基因的表达发生变化。
例如，缺氧、营养不良、创伤和感染等外界刺激会刺激增殖相关基因的表达；而DNA损伤、细胞周期的调整和凋亡也会影响增殖相关基因的表达。
二、细胞增殖相关基因对生长发育的影响1.细胞增殖与生长发育细胞增殖与生长发育密切相关。
细胞增殖能够增加组织和器官的细胞数，从而使生命体积增大，细胞的分裂与生长紧密结合。
2.细胞增殖相关基因对生长发育的影响增殖相关基因的表达水平变化对生长发育有着至关重要的影响。
例如，缺氧和营养不良会抑制胰岛素样增生因子1-1的表达，从而影响生长激素的合成，导致生长发育受到抑制。
而MYC基因则是促进细胞增殖的核心转录因子，过高表达可以导致恶性肿瘤的发展；相反，对MYC基因的敲除或抑制会导致胚胎的发育和组织的修复能力下降。
3.细胞增殖在器官特化和功能分化中的作用细胞增殖在生命体的器官特化和功能分化中也扮演着重要的角色。
例如，不同生命阶段心肌细胞增殖能力的差异，导致心肌细胞分化和再生能力的不同。
总之，细胞增殖相关基因的表达变化与生长发育密切相关。
在人体发育、组织修复和癌细胞进展中都起着不可替代的作用。
随着对这些机制的深入研究，相信细胞增殖相关基因调控的神秘面纱也会逐渐揭开。
细胞生物学细胞计数法和MTT法
实验题目：细胞增殖和活力的检测方法一、摘要：细胞增殖是生物体生长和繁殖的基础，当细胞增殖发生异常时往往会导致疾病的发生，比如肿瘤的发生就是细胞增殖失控的结果。
掌握细胞增殖和活力的检测是从事细胞生物学研究的一个重要方面。
针对细胞增殖和活力的检测方法有很多，这些方法除了能用于细胞本身增殖特性的研究、还能应用于药物毒副性检测，生长因子对细胞增殖和活力的影响等。
二、实验原理：〔1〕细胞计数法：最简单直接的方法：传统细胞计数的方法是用血球计数板，原理：将一定量的细胞悬液载入固定体积的玻片夹层中，在显微镜下数出细胞数量，然后换算出原始的细胞悬液浓度。
使用自动化细胞计数器，它通过拍下计数界面照片，利用软件程序设定去识别细胞，实现自动化计数。
好处:这种方法能兼容台盼蓝染色，染上蓝色的细胞视为死细胞，直接观察就能大致判断细胞的活力状态，计数后能定量分析细胞存活率。
缺点:①它的灵敏度低②线性范围太窄，细胞浓度低于 10 万个/ml 则计数不准确。
〔2〕 MTT 法MTT 称为噻唑蓝，是一种黄颜色染料。
定义：MTT 比色法是一种通过检测细胞代谢活性间接反映细胞增殖的方法。
原理：活细胞线粒体里的酶能够将外源性 MTT 还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒(Formazan)并沉积在细胞中，活细胞数量越多，形成的有色沉淀越多，通过测定颜色的深浅也就是吸光值来反映细胞代谢活性的强弱，而细胞代谢活性与细胞数量呈正比，从而反映细胞数量的多少。
缺点： MTT被还原形成的有色沉淀需要溶解后才能比色，检测用时较长，检测结果会受到沉淀溶解效果的影响。
三、实验材料和用品：细胞计数法：待测细胞悬液、细胞计数板、盖玻片、普通光学显微镜、微量移液器及枪头、酒精棉球、吸水纸、台盼蓝染液MTT法：贴壁细胞（A549 肺癌细胞株）酶标仪、酶标板振荡器、超净工作台，倒置显微镜，CO2培养箱、96 孔培养板，EP 管及管架，微量移液器及枪头、5mg/ml MTT 溶液，DMSO 溶液，1640 完全培养液四、实验操作（细胞计数法）：实验过程分为四个环节：（首先）清洁细胞计数板及盖玻片—（然后）镜检计数室—（接着）细胞加样—（最后）细胞计数具体操作细节如下：1、清洁细胞计数板及盖玻片：用 75%酒精棉球仔细擦拭细胞计数板的计数室区域，接着擦拭盖玻片，放置吸水纸上自然晾干；2、镜检计数室：1）细胞计数板和盖玻片干燥后，将盖玻片覆盖到细胞计数板的计数室部位；2）在显微镜下观察擦拭效果，确定计数室区域已擦拭干净、能清晰看到计数室的大方格及中方格3）直接平行移出计数板，平放在实验台上；3、待测细胞加样：1）将待测细胞悬液混匀后，吸取 10ul 细胞悬液加入 EP 管，然后再吸取10ul台盼蓝染液加入 EP，混匀，染色静置 2 分钟。
细胞活力研究检测指标
细胞活力研究检测指标细胞活力研究通常涉及多种检测指标，以评估细胞的生理状态、代谢活性和功能。
以下是一些常见的检测指标：1. 细胞增殖能力：1)MTT（3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四氮唑溴化物）试验：通过测量活细胞中线粒体脱氢酶的活性来评估细胞增殖。
2)CCK-8（Cell Counting Kit-8）试验：类似于MTT，但使用水溶性四唑盐WST-8，减少了实验步骤。
3)BrdU（5-溴脱氧尿苷）掺入试验：通过检测BrdU在DNA合成期的掺入来评估细胞增殖。
2. 细胞存活率：1)细胞计数：直接使用血球计数板或自动细胞计数器计算活细胞数量。
2)台盼蓝染色：排除法，活细胞不会吸收台盼蓝，死细胞会被染成蓝色。
3. 细胞凋亡检测：1)Annexin V/PI染色：通过流式细胞仪检测细胞膜磷脂酰丝氨酸外翻和细胞膜完整性来识别早期和晚期凋亡细胞。
2)TUNEL（末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口标记）试验：检测DNA断裂，是细胞凋亡的标志。
4. 细胞周期分析：流式细胞仪：使用PI或Hoechst染料对DNA进行染色，分析细胞周期分布。
5. 细胞代谢活性：1)ATP含量测定：ATP是细胞能量代谢的重要指标。
2)乳酸脱氢酶（LDH）释放：衡量细胞膜完整性和细胞损伤程度。
6. 氧化应激指标：1)ROS（活性氧物种）检测：使用荧光探针如DCFH-DA进行检测。
2)抗氧化酶活性：如超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）等。
7. 蛋白质和基因表达：1)Western blot：检测特定蛋白质的表达水平。
2)qPCR（实时定量聚合酶链反应）：检测特定基因的mRNA表达水平。
8. 细胞信号通路活性：磷酸化蛋白检测：通过Western blot检测特定蛋白的磷酸化状态来评估信号通路的激活。
9. 细胞粘附和迁移能力：1)划痕试验：评估细胞迁移能力。
2)侵袭和迁移试验：使用Transwell小室评估细胞的侵袭和迁移能力。
细胞功能检测
细胞功能检测细胞功能检测是指对生物样品中的细胞进行测试和分析，以评估其功能状态和活性水平。
这种检测可以用于研究细胞生理学、疾病诊断和治疗等领域。
下面介绍几种常见的细胞功能检测方法。
1. 细胞生存和增殖检测：这种检测方法可以评估细胞的生存能力和增殖速度。
常见的方法包括细胞计数、细胞活力和增殖指标的测定。
细胞计数可以用显微镜观察和细胞计数仪进行，细胞活力可以通过测定细胞色素c释放量、ATP产量等指标来评估，增殖指标包括细胞周期、有丝分裂指数等的测定。
2. 细胞凋亡检测：细胞凋亡是正常的细胞死亡过程，对维持组织结构和功能起着重要作用。
细胞凋亡的检测可以使用多种方法，如细胞凋亡标记物的染色、DNA片段化检测和细胞凋亡相关蛋白的测定等。
常用的染色方法有TUNEL法、AnnexinV染色法等，可以直接或间接地检测细胞凋亡的存在和程度。
3. 细胞分化检测：细胞分化是未分化细胞向特定细胞类型发育和成熟的过程。
细胞分化的检测可以通过测定特定分化标记物的表达来评估。
例如，神经细胞的分化可以通过检测神经元特异性标记物如神经元特异性聚糖、神经元特异性酶等的表达来判断。
4. 细胞迁移和侵袭检测：细胞迁移和侵袭是细胞在体内的基本生理过程，在肿瘤的发生和转移中具有重要的作用。
细胞迁移和侵袭能力的检测可以使用Transwell迁移实验、划痕愈合实验等方法，通过观察细胞通过细胞孔隙和划痕进入下一层细胞的能力来评估。
5. 细胞代谢功能检测：细胞代谢是维持细胞生命活动所必需的重要过程之一，包括能量代谢、蛋白质合成和降解、核酸代谢等。
细胞代谢功能的检测可以通过测定细胞中某些代谢产物的含量、酶活性的测定、氧化还原能力的测定等来评估。
细胞功能检测是实验生物学研究和临床医学诊断的重要手段之一。
通过细胞功能检测，人们可以了解细胞在不同条件下的功能状态和活性水平，从而更好地研究细胞生理学机制、发现新的疾病标记物和药物靶点，为疾病的诊断和治疗提供新的线索和方法。
细胞增殖活力检测的原理
细胞增殖活力检测的原理细胞增殖活力检测是一种常用的方法，用于评估细胞的生长和繁殖能力。
这种检测方法可以通过定量测量细胞数量、代谢活性或DNA合成来评估细胞增殖的程度。
细胞增殖活力检测的原理涉及多种方法和技术，以下将介绍其中几种常用的原理。
1. 细胞数量测定：这是最常见的一种细胞增殖活力检测方法。
通常使用荧光显微镜或细胞计数仪来直接计数细胞数量。
具体步骤包括将培养皿中的细胞进行洗涤和染色，然后使用显微镜或细胞计数仪进行计数。
这种方法不仅简单方便，而且能够定量评估细胞增殖情况。
2. ATP检测：ATP是细胞内重要的能量分子，以细胞数量为基础，通过检测ATP的含量来评估细胞增殖活力。
这种方法利用荧光或化学反应测定ATP的含量，进而推测细胞增殖状况。
由于ATP的含量与细胞的代谢活性密切相关，因此可以通过ATP 的测量来评估细胞增殖活力。
3. MTT法：MTT（3-(4,5-二甲基-2-噻唑唑基)-2,5-二苯基-2H-三唑-酮）是一种常用的细胞增殖活性染色剂，主要基于细胞色素P450的还原作用。
MTT可以通过还原为可溶性产物能反映细胞增殖活性。
具体操作步骤是将MTT加入含有试验组和对照组的培养皿中，经过一段时间后，MTT会转化为紫色的晶体形式，然后通过溶解晶体来定量测定MTT的相对含量，进而评估细胞的增殖活力。
4. 荧光素酶法：荧光素酶（Luciferase）是一种广泛应用于生物发光检测的方法。
当细胞中含有Luciferase酶的基因时，可以通过加入荧光素底物来检测荧光素酶的活性。
这种方法能够定量评估细胞的代谢活性，进而评估细胞增殖活力。
5. DNA合成测定：DNA是细胞的遗传物质，细胞增殖的过程中DNA会合成。
通过测定DNA合成的程度，可以评估细胞的增殖活力。
常用的DNA合成测定方法包括放射性同位素标记法和二硫苯酚法。
放射性同位素标记法通过标记细胞的DNA，然后测量标记DNA的数量来评估细胞增殖活性。
细胞增殖及细胞活力检测方法1
细胞增殖及细胞活力检测方法1细胞增殖及细胞活力检测方法1细胞增殖是指细胞数量的增加，是生物体生长和发育的基础过程。
细胞活力是指细胞代谢水平和功能状态的综合体现。
细胞增殖和细胞活力的检测方法在细胞生物学和生物医学研究中非常重要。
本文将介绍一些常用的细胞增殖和细胞活力检测方法。
一、细胞增殖检测方法1.平板计数法：平板计数法是一种直接计数方法，通过显微镜观察计数细胞数量。
首先，将细胞悬液均匀地涂布在显微镜滑片上。
然后，使用显微镜对细胞进行计数。
这种方法简单直接，但在大量细胞计数时比较耗时。
2.显微镜观察法：显微镜观察法是另一种直接计数方法。
通过显微镜观察细胞在培养皿中的覆盖度，以评估细胞增殖。
这种方法可以快速获得细胞增殖信息，但由于操作主观性较强，结果可能存在一定的误差。
3. MTT法：MTT法是一种间接计数方法，通过测定细胞代谢能力来估计细胞增殖。
首先，将MTT试剂加入细胞培养皿中，MTT会被活细胞还原成紫色的甲基化四氮唑盐（formazan）。
然后，通过比色法测定培养基中的甲基化四氮唑盐含量，从而间接反映细胞的增殖情况。
MTT法具有操作简便、结果可重复性好的优点。
4.WST-1法：WST-1法也是一种间接计数方法，通过测定细胞膜透过性来估计细胞增殖。
首先，将WST-1试剂加入细胞培养皿中，WST-1会被细胞色素P450酶一氧化还原成形成可溶性产物。
然后，通过光密度测定产生的产物浓度，从而间接反映细胞的增殖情况。
WST-1法灵敏度高，操作简单。
二、细胞活力检测方法1.ATP酶联反应法：ATP酶联反应法是一种直接测定细胞活力的方法。
ATP是细胞内的能量分子，可以反映细胞代谢水平。
通过酶联反应，将ATP转化为发光物质，然后使用发光仪测定发光强度，间接反映细胞活力。
这种方法灵敏度高，但样品处理复杂。
2.细胞膜透过性检测法：细胞膜透过性检测法是一种间接测定细胞活力的方法。
细胞在不同状态下，细胞膜透过性会发生变化。
cck8法检测细胞活力的基本原理和步骤
文章标题：深度探讨CCK-8法检测细胞活力的基本原理和步骤一、引言CCK-8法是一种常用的细胞活力检测方法，广泛应用于细胞生物学、药理学和医学研究领域。
本文将从CCK-8法的基本原理和步骤入手，深入探讨这一检测方法的应用和意义。
二、CCK-8法的基本原理1. CCK-8试剂的组成和作用机制CCK-8试剂主要由WST-8和辅酶Ⅰ组成。
WST-8可被还原成橙色的水溶性甲烷化产物，其还原程度与细胞代谢活性成正比。
辅酶Ⅰ促进WST-8的还原反应，增强反应敏感度。
2. 检测原理细胞内代谢活跃时，能还原WST-8为橙色产物，其光密度与细胞数量和代谢活性成正比。
通过测定产物的吸光度，可以反映细胞的活力水平。
三、CCK-8法的操作步骤1. 细胞预处理将生长的细胞悬浮液均匀分配至不同的孔板中，使每个孔内细胞数大致相等，保证实验结果的准确性。
2. 添加CCK-8试剂向各孔内加入CCK-8试剂，使其充分接触到细胞。
待反应一定时间后，测定吸光度。
3. 数据处理和分析根据吸光度值计算细胞活力指数，进一步分析实验结果，获取所需数据。
四、CCK-8法在细胞生物学研究中的应用1. 细胞增殖实验CCK-8法可用于评估细胞增殖速率和抑制剂对细胞生长的影响，为细胞生长调控机制的研究提供重要数据支持。
2. 细胞毒性评价通过CCK-8法可以快速、准确地评估药物对细胞的毒性，为药物筛选和临床用药提供重要参考依据。
五、个人观点和总结CCK-8法作为一种快速、灵敏度高的细胞活力检测方法，对于细胞生物学和药理学研究具有重要的应用价值。
通过本文的探讨，我们对CCK-8法的基本原理和操作步骤有了更深入的理解，相信它将在未来的研究中发挥越来越重要的作用。
结语本文通过对CCK-8法的基本原理和操作步骤的深入探讨，希望能帮助读者更加全面、深入地理解这一重要的细胞活力检测方法。
我们期待更多的学者和研究人员能够运用CCK-8法，推动细胞生物学和药理学研究的发展。
实验报告细胞活力
一、实验目的1. 了解细胞活力的概念和测定方法。
2. 掌握MTT法和CCK-8法测定细胞活力的原理和操作步骤。
3. 通过实验验证细胞活力测定方法的有效性。
二、实验原理细胞活力是指细胞生长、增殖和代谢的能力。
细胞活力测定是细胞生物学和分子生物学实验中常用的技术，用于评估细胞增殖和细胞毒性。
常用的细胞活力测定方法有MTT法、CCK-8法等。
1. MTT法：MTT法是一种通过检测细胞代谢产物（如NADH）还原MTT（3-(4,5-二甲基噻唑-2-yl)-2,5-二苯基四唑溴化物）生成甲紫（Formazan）的量来间接反映细胞活力的一种方法。
在一定条件下，活细胞内的脱氢酶可以将MTT还原成甲紫，甲紫呈紫色，其颜色的深浅与细胞活力成正比。
2. CCK-8法：CCK-8法是一种基于细胞代谢产生乳酸脱氢酶（LDH）的原理，通过检测LDH将CCK-8还原成水溶性甲偶氮盐的量来反映细胞活力的一种方法。
在一定条件下，活细胞内的LDH可以将CCK-8还原成甲偶氮盐，甲偶氮盐呈黄色，其颜色的深浅与细胞活力成正比。
三、实验材料1. 细胞：待测细胞系2. MTT试剂：3-(4,5-二甲基噻唑-2-yl)-2,5-二苯基四唑溴化物3. DMSO（二甲基亚砜）：用于溶解MTT4. CCK-8试剂：2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二硫唑基)-2H-四唑5. 96孔板：用于细胞培养和实验操作6. 细胞培养试剂：RPMI-1640培养基、胎牛血清、青霉素、链霉素7. 其他：移液器、吸头、酶标仪、水浴锅、恒温培养箱、超净工作台等四、实验方法1. 细胞培养：将待测细胞系按照一定密度接种于96孔板中，置于恒温培养箱中培养至细胞贴壁生长。
2. MTT法测定细胞活力：（1）将细胞培养至一定密度后，加入MTT试剂，置于恒温培养箱中继续培养；（2）待细胞代谢完成后，加入DMSO溶解甲紫；（3）使用酶标仪在490nm波长处检测吸光度值。
检测细胞增殖能力的方法
检测细胞增殖能力的方法细胞增殖能力是生物学和医学研究中极为重要的指标，它反映了细胞的生长、繁殖和生命活力。
本文将详细介绍几种常用的检测细胞增殖能力的方法，以供研究者参考。
一、MTT法MTT法（甲基噻唑基四唑法）是一种经典的检测细胞增殖的方法。
其原理是利用活细胞内的琥珀酸脱氢酶将MTT还原为蓝紫色的甲臜，甲臜的量与活细胞数成正比。
具体步骤如下：1.将细胞接种于96孔板中；2.加入MTT溶液，培养一定时间；3.弃去上清，加入DMSO溶解甲臜；4.使用酶标仪测定吸光度，判断细胞增殖能力。
二、CCK-8法CCK-8法（细胞计数试剂盒-8）与MTT法类似，但操作更简便，毒性更低。
CCK-8试剂在细胞内被还原后生成橙色的甲臜，通过测定吸光度可以评估细胞增殖能力。
三、EdU法EdU法（5-乙炯基-2"-脱氧尿嘧啶法）是一种新兴的细胞增殖检测方法。
EdU是胸腺嘧啶类似物，可以代替胸腺嘧啶插入到DNA中。
通过荧光显微镜或流式细胞仪检测EdU标记的DNA，可以评估细胞增殖情况。
四、Brdu法Brdu法（5-溴脱氧尿嘧啶法）与EdU法类似，也是一种检测细胞增殖的经典方法。
Brdu在细胞周期中代替胸腺嘧啶插入DNA，通过免疫荧光或免疫组化方法检测Brdu标记的DNA，从而评估细胞增殖能力。
五、细胞计数法细胞计数法是最直接的检测细胞增殖能力的方法。
通过细胞计数板或流式细胞仪对细胞进行计数，可以直接得到细胞数量，从而判断细胞增殖能力。
六、其他方法除了以上几种方法外，还有其他检测细胞增殖能力的方法，如：1.克隆形成实验：通过测定细胞克隆的形成数量来评估细胞增殖能力；2.细胞周期分析：利用流式细胞仪检测细胞周期各阶段的细胞比例，间接反映细胞增殖能力；3.报告基因法：通过构建带有报告基因的细胞株，检测报告基因的表达水平来评估细胞增殖能力。
综上所述，检测细胞增殖能力的方法多种多样，研究者可以根据实验需求和条件选择合适的方法。
细胞增殖及细胞活力检测方法
细胞增殖及细胞活力检测方法目前主要有两种用于检测细胞增殖能力的方法。
一种是直接的方法，通过直接测定进行分裂的细胞数来评价细胞的增殖能力。
另一种是间接的方法，即细胞活力（cell viability）检测方法，通过检测样品中健康细胞的数目来评价细胞的增殖能力。
显然，细胞活力检测法并不能最终证明检测样品中的细胞是否在增殖。
如细胞在某一培养条件下会自发启动凋亡程序，但药物的干扰可抑制凋亡的发生；这时若采用细胞活力检测法，显然可以区分两种条件下的细胞数量，但我们并不能从药物干扰组细胞数大于对照组的事实说明药物可促进细胞增殖的结论。
所以最直接的证据应该采用方法一。
用于检测细胞增殖能力最经典的方法是用氚标记的胸腺嘧啶核苷处理细胞，再检测DNA链中氚含量。
若细胞具有增殖能力，DNA合成过程中将会采用氚标记的胸腺嘧啶核苷作为合成原料，因此检测细胞DNA链内标记核苷酸的量可判断细胞是否进行DNA 的合成。
但更为常用的方法是BrdU检测法。
用BrdU预处理的细胞中，BrdU可代替胸腺嘧啶核苷插入复制的DNA双链中，而且这种置换可以稳定存在，并带到子代细胞中。
细胞经过固定和变性处理后，可用免疫学方法检测DNA中BrdU的含量（如采用鼠抗BrdU单克隆抗体特异识别BrdU,再采用辣根过氧化酶标记的山羊抗鼠IgG二抗标记，最后用比色法或荧光的方法进行定量测定），从而判断细胞的增殖能力。
Calbiochem/EMD公司提供一种BrdU检测试剂盒，以微孔板的形式，合并所有清洗、固定、变性的步骤以单一试剂当中。
比色检测在一抗二抗标记后在450nm下读数，所有操作在3小时内结束。
而且该试剂盒的灵敏度与市场上其他同类产品相比是最强的。
1000个细胞以上水平的检测只需用BrdU预孵育2小时，100个细胞则采用过夜预孵育，即可检测细胞的增殖能力。
BrdU法的一个缺点是需要固定和变性等破坏DNA的处理。
有些情况下，研究者可能希望在测定细胞增殖能力的同时检测细胞的总DNA含量，然而，在变性条件下，DNA 的双链结构将被破坏，DAPI和Hoechest 33342等核酸标记探针就不再能识别DNA，因而也无法估计DNA总量。
GSTO1抑制TGFβ诱导的大鼠心脏成纤维细胞增殖和活化
GSTO1抑制TGFβ诱导的大鼠心脏成纤维细胞增殖和活化*张彤， 谢赛阳， 邓伟， 唐其柱△（武汉大学人民医院心血管内科，代谢与相关慢病湖北重点实验室，湖北 武汉 430060）［摘要］ 目的：研究谷胱甘肽S -转移酶ω1（GSTO1）在转化生长因子β（TGFβ）诱导心脏成纤维细胞增殖与活化中的作用。
方法：分离乳大鼠心脏成纤维细胞并进行体外培养。
采用含绿色荧光蛋白（GFP ）的重组腺病毒质粒构建对照（Ad -GFP ）或GSTO1过表达（Ad -GSTO1）质粒并转染心脏成纤维细胞，再用大鼠TGFβ（rTGFβ）刺激细胞24 h ，实验分为4组：Ad -GFP+PBS 、Ad -GFP+rTGFβ、Ad -GSTO1+PBS 和Ad -GSTO1+rTGFβ。
运用qPCR 和免疫荧光染色确定转染的有效性；Western blot 检测GSTO1蛋白表达；划痕实验和EdU 掺入实验评估细胞迁移和增殖；CCK -8实验评估细胞活力；Western blot 和细胞免疫荧光染色检测心脏成纤维细胞活化标志物α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA ）、I 型胶原（Col I ）和纤连蛋白（FN ）的表达水平，并检测心脏成纤维细胞内P38 MAPK 和Smad3信号通路相关蛋白水平。
结果：与Ad -GFP+rTGFβ组相比，GSTO1过表达抑制TGFβ诱导的心脏成纤维细胞增殖（P <0.05），降低TGFβ刺激后α-SMA 、Col I 和FN 的表达水平（P <0.05），抑制P38 MAPK/Smad3信号通路激活（P <0.05）。
结论：GSTO1过表达通过抑制P38 MAPK/Smad3信号通路而阻遏TGFβ诱导的大鼠心脏成纤维细胞增殖和活化。
［关键词］ 心肌纤维化；谷胱甘肽S -转移酶ω1；心脏成纤维细胞；转化生长因子β；细胞增殖［中图分类号］ R542.2+3； R363.2 ［文献标志码］ Adoi ： 10.3969/j.issn.1000-4718.2023.04.010GSTO1 inhibits proliferation and activation of rat cardiac fibroblasts in⁃duced by TGFβZHANG Tong ， XIE Saiyang ， DENG Wei ， TANG Qizhu △（Department of Cardiology ， Renmin Hospital of Wuhan University ， Hubei Key Laboratory of Metabolic and Chronic Dis⁃ease ， Wuhan 430060， China. E -mail ： qztang@ ）［ABSTRACT ］ AIM ： To investigate the role of glutathione S -transferase omega 1 （GSTO1） in the proliferationand activation of cardiac fibroblasts induced by transforming growth factor β （TGFβ）. METHODS ： Cardiac fibroblasts from suckling rats were isolated and cultured in vitro . Adenovirus plasmid containing green fluorescent protein （GFP ） wasused to construct control （Ad -GFP ） or GSTO1 overexpression （Ad -GSTO1） plasmid ， and the cardiac fibroblasts transfected with adenovirus were stimulated by rat TGFβ （rTGFβ） for 24 h. Therefore ， the cells were divided into 4 groups ： Ad -GFP+PBS ， Ad -GFP+rTGFβ， Ad -GSTO1+PBS and Ad -GSTO1+rTGFβ. qPCR and immunofluorescence staining were used todetermine the effectiveness of transfection. The expression of GSTO1 protein was detected by Western blot. The migration and proliferation of cardiac fibroblasts were evaluated by wound healing test and EdU incorporation test. At the same time ，α-smooth muscle actin （α-SMA ） was detected by Western blot and immunofluorescence staining. The expression levels of collagen type I （Col I ）， fibronectin （FN ）， and P38 MAPK/Smad3 signaling pathway -related proteins in the cells were also detected. RESULTS ： Compared with Ad -GFP+rTGFβ group ， overexpression of GSTO1 attenuated the proliferation ofcardiac fibroblasts induced by TGFβ （P <0.05）， decreased the expression of α-SMA ， Col I and FN after TGFβ stimula‑tion （P <0.05）， and inhibited the activation of P38 MAPK/Smad3 signaling pathway （P <0.05）. CONCLUSION ： Over‑expression of GSTO1 attenuates TGFβ-induced proliferation and activation of rat cardiac fibroblasts by inhibiting P38MAPK/Smad3 signaling pathway.［KEY WORDS ］ myocardial fibrosis ； glutathione S -transferase omega 1； cardiac fibroblasts ； transforming growthfactor β； cell proliferation［文章编号］ 1000-4718（2023）04-0656-07［收稿日期］ 2022-11-03 ［修回日期］ 2023-02-21* ［基金项目］ 国家自然科学基金资助项目（No. 82170245； No. U22A20269）△通讯作者 Tel ：135****2218； E -mail ： qztang@··656心肌纤维化是响应于心肌损伤的反应性重构过程。
细胞增殖实验实验报告单
一、实验目的1. 掌握细胞增殖实验的基本原理和方法。
2. 学习使用MTT法和克隆形成实验法检测细胞增殖。
3. 了解细胞增殖在不同条件下的变化。
二、实验原理细胞增殖是生物体生长发育的基础，也是细胞生物学研究的重要内容。
细胞增殖实验主要包括MTT法和克隆形成实验法。
MTT法通过检测细胞线粒体中的脱氢酶活性，间接反映细胞增殖活力；克隆形成实验法则通过观察单个细胞分裂形成的克隆数量，评估细胞的增殖能力。
三、实验材料1. 细胞：HeLa细胞（人子宫颈癌上皮细胞）2. 试剂：MTT工作液、DMSO、胎牛血清、RPMI1640/DMEM培养液、0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA混合消化液、96孔培养板、酶联免疫检测仪、CO2培养箱、低速离心机3. 仪器：显微镜、细胞计数器、电子天平、移液器、超净工作台四、实验方法1. 细胞培养：将HeLa细胞接种于96孔培养板，每孔1000个细胞，加入200μl RPMI1640/DMEM培养液，置于37℃、5%CO2培养箱中培养。
2. MTT法：（1）培养细胞2-3天后，每孔加入20μl MTT工作液，继续培养4小时。
（2）小心吸弃孔内培养上清液，每孔加入150μl DMSO，振荡10分钟，使结晶物充分融解。
（3）在酶联免疫检测仪上测定各孔光吸收值，以时间为横坐标，吸光值为纵坐标绘制细胞生长曲线。
3. 克隆形成实验法：（1）将细胞接种于6孔板，每孔2000个细胞，加入200μl RPMI1640/DMEM培养液，置于37℃、5%CO2培养箱中培养。
（2）培养细胞至一定时间后，用0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA混合消化液消化细胞，制成细胞悬液。
（3）将细胞悬液稀释至适当浓度，接种于6孔板，每孔100μl。
（4）培养细胞至克隆形成，用显微镜观察并计数。
（5）计算克隆形成率。
五、实验结果1. MTT法：细胞生长曲线呈S形，细胞增殖活力随时间延长而增加。
2. 克隆形成实验法：克隆形成率随时间延长而增加，表明细胞增殖能力较强。
细胞增殖、活化、杀伤检测方法_解释说明以及概述
细胞增殖、活化、杀伤检测方法解释说明以及概述1. 引言1.1 概述细胞增殖、活化和杀伤是细胞生物学研究中的重要课题。
随着科技的不断进步，人们对细胞行为的了解也越来越深入。
在许多领域，如医学、生物工程和药物研发等，准确检测细胞的增殖、活化和杀伤情况至关重要。
细胞增殖是指细胞数量的增加过程，在生理和病理状态下都会发生。
了解细胞增殖速度不仅可以帮助我们了解细胞生长的规律，还可以评估某些疾病如癌症的发展程度。
因此，开发可靠且准确测量细胞增殖的方法是非常关键的。
细胞活化是指刺激后细胞内代谢水平的提高。
对于一些需要评估生物材料耐受性或测试新药剂对细胞外治疗效果时，准确测定细胞是否被有效激活至关重要。
细胞杀伤是通过某种方式使得部分或全部细胞死亡。
在免疫学、毒理学等领域中，准确检测细胞杀伤效果可以帮助我们评估药物或其他物质对细胞的影响程度。
为了解决这些问题，科学家们开发了多种方法来检测细胞的增殖、活化和杀伤情况。
本文的目的是对这些方法进行详细的解释说明，并概述它们各自的优势和局限性。
1.2 文章结构本文按照以下结构展开：首先是引言部分，介绍了文章涉及的主题和目的；接下来将分别详细介绍细胞增殖、活化和杀伤检测方法；最后对各种方法进行比较，总结研究结果并展望未来的研究方向。
1.3 目的本文的目的是提供一个全面而清晰的概述，使读者能够了解不同的细胞增殖、活化和杀伤检测方法。
通过详细讨论每种方法的原理、应用范围以及其优缺点，读者可以选择适合自己研究目标和实验条件的最佳技术。
此外，本文还将对未来的研究方向进行展望，以促进该领域更深入且有针对性的探索和发展。
2. 细胞增殖检测方法细胞增殖是指细胞通过分裂和繁殖产生新的细胞的过程。
在许多研究领域，如药物筛选、癌症治疗和组织工程等，准确评估细胞增殖能力至关重要。
本节将介绍几种常用的细胞增殖检测方法。
2.1 细胞计数法细胞计数法是最传统也是最常用的一种细胞增殖检测方法之一。
该方法通过显微镜下观察并手动计数已经增殖的细胞数量来评估细胞的增长情况。
细胞培养名词解释
细胞培养名词解释
细胞培养是指将细胞分离出来，在培养基中增殖繁殖，并进行活力测试的一种技术。
它是一种用于建立和维持多器官功能的实验室技术，可以用于研究细胞的生理特性，研究细胞相互之间的关系以及对外界环境反应之类的实验。
培养基：
培养基是一种可以提供养料和细胞适宜生存的发酵液，它的组分包括氮源、碳源、矿质营养物质、维生素、磷酸钠(NaH2PO4)、氯化钠(NaCl)、还原剂(Na2S2O3)等。
细胞定位：
细胞定位是指在细胞培养实验中，根据不同的实验要求，通过观察分析细胞分离后的培养基，将不同的细胞定位在不同的区域，以便进行下一步实验。
单细胞处理：
单细胞处理是指利用微量流体动力学的技术，将细胞在一个个微小的体系中进行分离和处理，以便学习细胞间的相互作用和调控、生物传感以及细胞内信号传导的过程。
细胞活性检测：
细胞活性检测是指在实验中鉴别细胞是否具有活性，主要包括细胞活性指数测定法和活性监测法。
前者主要是通过对受试细胞的增殖指数、膜通透性指数、激活指数、生长指数等进行测定，以测定细胞的有效性；后者主要是利用免疫法、荧光法等检测受试细胞内的活性
物质，以检测细胞的健康状态。
细胞活力计算公式
细胞活力计算公式细胞是构成生命体的基本单位，细胞的活力是维持生命的关键。
因此，研究细胞活力的计算公式对于生命科学的发展具有重要意义。
本文将介绍细胞活力计算公式的理论基础及其在实际应用中的意义。
细胞活力的理论基础细胞活力是指细胞在一定时间内所表现出的生命活动能力，包括细胞增殖、代谢、运动、分化等。
细胞活力的计算公式需要考虑多个因素，其中最重要的是细胞的能量来源。
细胞能量的来源主要有两种：有氧呼吸和无氧发酵。
有氧呼吸是指在氧气的存在下，葡萄糖被氧气氧化分解，产生能量和二氧化碳。
而无氧发酵则是指在缺氧的情况下，葡萄糖被分解成乳酸或酒精，产生少量能量和二氧化碳。
细胞能量的来源决定了细胞的代谢途径和能量产生效率，因此对于细胞活力的计算公式具有重要影响。
另外，细胞的生长环境也是细胞活力计算公式的重要因素之一。
细胞在不同的生长环境下，其代谢途径和能量产生效率都会有所不同，从而影响细胞的活力。
例如，在缺氧的环境下，细胞会通过无氧发酵产生能量，但是能量产生效率较低，因此细胞的活力会受到限制。
而在富氧的环境下，细胞能够通过有氧呼吸产生更多的能量，从而提高细胞的活力。
细胞活力的计算公式细胞活力的计算公式需要考虑多个因素，其中最重要的是细胞的能量来源和生长环境。
下面我们将介绍几种常用的细胞活力计算公式。
1. ATP产生率ATP是细胞内的能量储备分子，是维持细胞活力的重要物质。
ATP 的产生率可以用下式计算：ATP产生率 = 细胞内ATP浓度× ATP合成速率其中，ATP合成速率可以通过测量细胞内ATP合成酶的活性来确定。
ATP合成速率受到多种因素的影响，包括细胞的能量来源、生长环境、ATP酶的表达水平等。
2. 细胞增殖速率细胞增殖速率是指在一定时间内，细胞数量的增加量。
细胞增殖速率可以用下式计算：细胞增殖速率 = （细胞数2 - 细胞数1）/ 细胞数1 ×时间其中，细胞数1和细胞数2分别表示起始时间和结束时间的细胞数量。
细胞的增殖
细胞的增殖细胞的增殖是生物体内细胞数量增加的过程。
细胞增殖是细胞生命周期的一个重要阶段，对于生物的生长、发育以及组织修复具有至关重要的作用。
在生命体内，细胞增殖的调控是由多种生物学过程紧密协调进行的。
细胞增殖的基本过程细胞增殖包含有丝分裂和无丝分裂两种方式。
有丝分裂是指细胞在分裂过程中有明显的纺锤体形成，包括有丝分裂期（前期、中期、后期）和有丝分裂后期。
有丝分裂的过程中，细胞核准备、染色体复制、染色体对分离、细胞质分裂等步骤依次进行，最终形成两个功能和遗传物质相同的子细胞。
而无丝分裂是指细胞在分裂时没有明显的纺锤体形成，包括裂解期和质体分裂期两个阶段。
在无丝分裂过程中，细胞的质体逐渐收缩，最终形成两个独立的细胞。
细胞增殖的调控机制细胞增殖的调控受到复杂的信号通路和调控因子影响。
在正常生理状态下，细胞增殖受到生长因子、细胞周期调控蛋白、细胞凋亡调节等多种因素的调节。
当细胞接收到适当的生长因子刺激时，会启动细胞周期并促使细胞增殖。
而在组织修复或生长发育过程中，细胞增殖也需要受到精细的调控，以确保细胞数量和功能的平衡。
细胞增殖与疾病细胞增殖异常会导致一系列疾病的发生。
比如，癌症的发生往往是由于细胞增殖受到异常调控，导致细胞无限制地增殖和扩散。
因此，研究细胞增殖的调控机制对于理解疾病的发生和防治具有重要意义。
同时，许多药物的作用机制也是通过影响细胞增殖来发挥治疗作用。
总结细胞的增殖是生命体内一项重要的生物学过程，对于生物的生长、发育和组织修复具有重要作用。
了解细胞增殖的基本过程、调控机制以及与疾病的关系，有助于深入理解生命的奥秘，并为医学研究和临床治疗提供重要的参考。
以上是关于细胞的增殖的相关介绍，希望对您有所帮助。
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选择策略
应该注意，测定细胞增殖很多时候单一方法都
是有缺陷的，四唑盐—MTT法不够精确；最直 接的指标是活细胞数量的变化，结果比较准确， 但细胞直接计数法所需细胞量较多，操作繁琐 费时；而3H掺入法麻烦且不安全。所以，建议 最好用两种以上的方法进行测定，这样做主要 是可以有一个用于辅助修正的数据。
6. CCK8检测法
是一种基于WST‐8的广泛应用于细胞增殖和细胞毒性的 快速高灵敏度检测方法。CCK‐8细胞活性检测试剂中含 有WST‐8：2‐(2‐甲氧基‐4‐硝基苯基)‐3‐(4‐硝基苯 基)‐5‐(2,4‐二磺酸苯)‐2H‐四唑单钠盐]。 WST‐8是一种 类似于MTT的化合物，在电子耦合试剂存在的情况下， 可以被线粒体内的一些脱氢酶还原生成橙黄色的甲瓒产 物formazan。细胞增殖越多越快，则颜色越深；细胞毒 性越大，则颜色越浅。对于同样的细胞，颜色的深浅和 细胞数目呈线性关系。 用酶联免疫检测仪在450nm波长处测定其光吸收值，可 间接反映活细胞数量。该方法已被广泛用于一些生物活 性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞增 殖试验、细胞毒性试验以及药敏试验等。
3. 5-溴脱氧尿嘧啶核苷(Brdu)检测法
Brdu是胸腺嘧啶的衍生物，可代替胸腺嘧啶在
DNA合成期（S期），活体注射或细胞培养加入 ，而后利用Brdu专一性抗体，显示增殖细胞。 同时结合其它细胞标记物，双重染色，可判断 增殖细胞的种类，增殖速度，对研究细胞动力 学有重要意义。 BrdU标记很适合免疫组化IHC、免疫细胞化学 IC、细胞内ELISA、流式细胞分析和高通量筛选。 优点：不仅能用于体外实验，还能用于活体实 验， 缺点： 就是需要变性DNA后才能与抗体结合， 但这就破坏了DNA双链结构，影响了其他染料 的结合染色，导致染色弥散，准确性降低等问 题
数目进行比较。 优点： 简单：不需要特定的试剂和仪器 准确 缺点： 不适合样品数量多的情况 不适合评估特定的亚群
台盼蓝
细胞损伤或死亡时，台盼蓝可穿透变性的细胞
膜，与解体的DNA 结合，使其着色。而活细胞 能阻止染料进入细胞内。故可以鉴别死细胞与 活细胞。
2.胸腺嘧啶核苷(3H-TdR)渗入法
细胞计数
计算板四大格细胞总数，压线细胞只计左侧和上方的。然 后按公式计算：细胞数/mL=四大格细胞总数/4×104
选择策略
怎样选择最适合的检测方法，主要依赖于使用
的细胞类型和具体研究方案，还取决于实验者 在细胞增殖中期望得到的信息。 假如希望了解细胞增殖中的代谢活性变化，可 以使用四唑盐和比色法检测；如果关注重点在 于对DNA合成的改变，可以选择用BrdU或EdU 标记，再通过比色法、化学发光或荧光检测进 行分析；若研究的是单个细胞，也可以用BrdU 或EdU标记来检测DNA合成，将其与荧光标记 的相应抗体结合，就可以通过流式细胞仪来进 行流式分选。
注意事项-药物浓度的设定
一定要多看文献，参考别人的结果再定个比较
大的范围先初筛。根据自己初筛的结果缩小浓 度和时间范围再细筛。 切记！ 否则，可能你用的时间和浓度根本不是药物的 有效浓度和时间。
注意事项-时间点的设定
在不同时间点的测定OD值，输入excel表，最
后得到不同时间点的抑制率变化情况，画出变 化的曲线，曲线什么时候变得平坦了（到了平 台期）那个时间点应该就是最好的时间点（因 为这个时候的细胞增殖抑制表现的最明显）。
细胞增殖和细胞活力
中心实验室 李娜
检测细胞增殖能力的方法
一种是直接的方法，通过直接测定进行分裂的细胞数来 评价细胞的增殖能力。 一种是间接的方法，即细胞活力（cell viability）检测 方法，通过检测样品中健康细胞的数目来评价细胞的增 殖能力。 细胞活力检测法并不能最终证明检测样品中的细胞是否 在增殖。如细胞在某一培养条件下会自发启动凋亡程序， 但药物的干扰可抑制凋亡的发生；这时若采用细胞活力 检测法，显然可以区分两种条件下的细胞数量，但我们 并不能从药物干扰组细胞数大于对照组的事实说明药物 可促进细胞增殖的结论。所以最直接的证据应该采用方 法一。
细胞增殖检测技术
直接计数 胸腺嘧啶核苷(3H‐TdR)渗入法 5.5-溴脱氧尿嘧啶核苷(Brdu)检测法 5-乙炔基-2’脱氧尿嘧啶核苷（EdU） 羟基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂(CFSE)
检测法 CCK8 利用计数板或计数仪得出细胞的数目，然后对
8. ATP检测
细胞内的ATP含量受到了严格调控，检测ATP也
可以得到细胞增殖的信息。死亡细胞或即将死 亡的细胞几乎不含ATP，在细胞溶解物或提取 物中测得的ATP浓度与细胞数之间存在严格的 线性关系。 利用荧光素酶luciferase及其底物荧光素 luciferin的ATP检测以生物发光为基础，能够提 供非常灵敏的结果。如果有ATP存在荧光素酶 就会发光，而且其发光强度与ATP浓度成正比， 用能读取发光信号的光度计和酶标仪都可以方 便的进行检测。这种方法非常适用于高通量细 胞增殖检测和筛选。
注意事项-设置调零孔
实验时应设臵调零孔，对照孔，加药孔。 调零孔加培养基、MTT、二甲基亚砜。 对照孔和加药孔都要加细胞、培养液、MTT、
二甲基亚砜 不同的是对照孔加溶解药物的介质 加药组加入不同浓度的药物。 每组设定3复孔 设空白对照：与试验平行不加细胞只加培养液 的空白对照。其他试验步骤保持一致，最后比 色以空白调零。
4.5-乙炔基-2’脱氧尿嘧啶核苷 （EdU）
也是一种胸腺嘧啶核苷类似物。它也能够在细
胞增殖时期代替胸腺嘧啶（T）渗入正在复制 的DNA分子，通过基于EdU与Apollo荧光染料的 特异性反应检测DNA复制活性，通过检测EdU 标记便能准确地反映细胞的增殖情况。EdU检 测染料只有BrdU抗体大小的1/500，在细胞内 很容易扩散，无需DNA变性（酸解、热解、酶 解等）即可有效检测，可有效避免样品损伤， 在细胞和组织水平能更准确地反映细胞增殖等 现象。
胸腺嘧啶核苷（TdR）是DNA特有的碱基，也
是DNA合成的必需物质。用同位素H标记TdR即 H-TdR作为DNA合成的前体能掺入DNA合成代谢 过程，通过测定细胞 DNA链内标记核苷酸的量 的放射性强度，可以反映细胞DNA的代谢及细 胞增殖情况。 优点：3H-TdR掺入法敏感性高，客观性强，重复 性好。 缺点：但需一定设备条件，同时还存在放射性核 素污染问题。
注意事项-选择适当得细胞接种浓度。
一般情况下，96孔培养板的一内贴壁细胞长满
时约有105个细胞。但由于不同细胞贴壁后面 积差异很大，因此，在进行MTT试验前，要进 行预实验检测其贴壁率、倍增时间以及不同接 种细胞数条件下的生长曲线，确定试验中每孔 的接种细胞数和培养时间，以保证培养终止致 细胞过满。这样，才能保证MTT结晶形成酌量 与细胞数呈的线性关系。否则细胞数太多敏感 性降低，太少观察不到差异。
注意事项-避免血清干扰
用含15%胎牛血清培养液培养细胞时，高的血
清物质会影响试验孔的光吸收值。由于试验本 底增加，会试验敏感性。 一般选小于10%胎牛血清的培养液进行。在呈 色后，尽量吸净培养孔内残余培养液。
谢谢！
注意事项-培养时间
200ul的培养液对于10的4~5次方的增殖期细胞
来说，很难维持68h，如果营养不够的话，细 胞会由增殖期渐渐趋向G0期而趋于静止，影响 结果，我们是在48h换液的。
注意事项
MTT法只能测定细胞相对数和相对活力，不能
测定细胞绝对数。做MTT时，尽量无菌操作， 因为细菌也可以导致MTT比色OD值的升高。 理论未必都是对的。要根据自己的实际情况调 整。
5. 羟基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂 (CFSE)检测法
CFSE能够轻易穿透细胞膜，在活细胞内聚积并
与胞内蛋白共价结合，水解后的CFSE释放出荧 光物质，这些共价结合的荧光物分子很少从细 胞内脱落。CFSE标记后的细胞用于体内观察可 以长达数周。 因此，CFSE常被用来做活细胞检测试验和用荧 光电镜观察细胞长期活动的试验。 利用流式细胞仪在488nm激发光和荧光检测通 道可对其进行分析。 CFSE标记的细胞的激发和发射波长分别为500 nm和520 nm
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5. 羟基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂 (CFSE)检测法
羟基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂（CFSE）是
一种可穿透细胞膜的荧光染料，具有与细胞特 异性结合的琥珀酰亚胺脂基团和具有非酶促水 解作用的羟基荧光素二醋酸盐基团，使CFSE成 为一种良好的细胞标记物。 CFSE进入细胞后可以不可逆地与细胞内的氨基 结合偶联到细胞蛋白质上。当细胞分裂时， CFSE标记荧光可平均分配至两个子代细胞中， 因此其荧光强度是亲代细胞的一半。这样，在 一个增殖的细胞群中，各连续代细胞的荧光强 度呈对递减，利用流式细胞仪在488nm激发光 和荧光检测通道可对其进行分析。
7. MTT检测法
MTT检测法主要反映细胞的能量代谢，是检测
细胞增殖活力的一种简便准确的方法。其原理 是在活细胞生长和增殖过程中，线粒体内的脱 氢酶可将黄色的MTT分解成兰紫色的水不溶性 的甲瓒(Formazan)，并沉积在细胞中，死细胞 无此功能。
活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为 水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒并沉积在细胞中，而死细胞 无此功能。二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的甲瓒， 用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值，可 间接反映活细胞数量。 在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数和细胞 活力成正比。MTT方法用于判断药物、外源性基因、小 RNA、蛋白、抗体、细胞因子、血清等对于细胞的作用， 以明确上述因子对于细胞生物学行为的影响（如细胞活 力、增殖、凋亡等方面）。