转基因植物技术的鉴定(精选)
转基因植物的检测鉴定方法、遗传转化技术及新技术
PCR检测
• PCR是在体外快速特异地扩增目的基因DNA片段 的有效方法。能在几小时内使pg水平的起始物达 到ng水平,扩增产物经琼脂糖凝胶电泳,溴化乙锭 染色后很容易观察,不通过杂交分析就可以鉴定出 基因组中的一些顺序。
• 但由于PCR扩增十分灵敏，有时会出现假阳性扩 增，因而对外源基因是否整合需要进行扩增产物 的Southern杂交。
＊已获得专利许可
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Site-specific recombinasemediated transgene excision
loxP
Cre
Transgene
loxP
loxP
Cre
Transgene
llooxP
loxP
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外源基因去除（Gene-deletor)
• “外源基因去除”技术的要点之一是在目标植 物中加入了受DNA调空片段启动子控制的特殊基 因，该基因在启动子的作用下，可根据科学家的 意愿，在需要的时间和部位将外源基因和自身从 转基因植物中切掉，从而使转基因作物的花粉、 种子、果实不再含有外来基因，或将外来基因从 人们所需食用的部分（如植物的茎、叶、块茎） 彻底清除掉，达到用转基因作物生产出非转基因 食品的目的，从根本上解决了长期困扰人们的转 基因植物基因扩散问题和转基因食品的安全性问 题。
ATP
dsRNA
siRNA
蛋白复合物
RISC
靶 正义链
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mRNA
3、无选择标记转化
• 可消除选择标记基因对转基因作物安全性 方面的影响
• 可消除选择标记基因对重复多基因转化叠 加所带来的困难
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marker-free转基因植株
• 共转化法＊(基因枪与农杆菌转化) • 转座元法 • 重组酶法＊ • MAT(Multi-auto transformation)法＊ • 替代法＊
转基因植物的筛选与鉴定
转基因植物的筛选与鉴定随着植物转基因技术的不断进步，它对于分子遗传学研究和植物改良都具有特别重要的意义。
转基因植株的筛选在转基因技术中起着关键性的作用。
将含有35S启动子的基因载体PMDC150经农杆菌介导，利用农杆菌侵染拟南芥花序的方法转入拟南芥后得到T1代种子。
文章通过组织培养来筛选含有Kan抗性的转基因植株。
标签：拟南芥；转基因植物；筛选1 文献综述1.1 转基因植物的研究进展植物的遗传转化是指利用重组DNA，细胞组织培养等方法，将外源基因导入到植物的组织或细胞中，获得转基因植物的技术[1]。
从转基因植株成功之后，转基因技术飞速发展，如今，植物在抗病、抗虫和抗药等方面都有了转基因植株。
这种技术对改进农作物品质、提高产量等方面都有非常大的帮助。
1.2 基因转化技术随着人们对基因转化技术不断地深入研究和探索，现已发现多种基因转化的方法，例如农杆菌介导的基因转化、花粉管通道法等。
相比较其他植物基因的转化方法，农杆菌介导法有着减少成本、容易操作等优点，但对宿主细胞有着严格的要求。
每种方法都有其优缺点，所以根据植物的不同种类，我们要选择合理的转化方法，达到理想的转化效果。
1.3 本论文的目的和意义植物的转基因技术日新月异迅速发展，已经成为许多国家重点发展的新目标新领域，它所产生的巨大的社会和经济效益促使各个国家对其进行更加深入的研究，由其产生的巨大的生产潜能一定会推动社会的进步，改善人类现有的生产、生活质量以及健康水平。
本文以拟南芥为主要研究对象，通过转化后的农杆菌侵染拟南芥花序的方法及组织培养的方法进行了轉基因植物的筛选。
借由本次实验研究，可深入了解基因工程等相关领域的理论，可熟练掌握相关技术例如无菌操作技术、植物转基因技术、植物组织培养技术等等。
2 转基因植物的筛选与鉴定2.1 实验材料2.1.1 植物材料拟南芥2.1.2 载体与菌株重组表达载体PMDC150-35S（由实验室提供）、农杆菌菌株GV31012.1.3 主要试剂75%酒精、84消毒液、侵染缓冲液、限制性内切酶、卡那霉素、壮观霉素（重组表达载体含有的抗性）、利福平2.1.4 培养基LB培养基：5g/L酵母提取物，10g/L蛋白胨，10g/L NaCl，15g/L琼脂（只固体培养基添加）1/2MS培养基2.2 实验方法2.2.1 拟南芥种植：将种子放在浸过水的滤纸上，放在4℃的冰箱中，不见光培养24小时，然后取出种子种在营养土里，在光照强度8000Lux，温度25℃的培养箱中经过光照16小时/黑暗8小时培养[2]。
转基因植物
载体介导法
➢ T-DNA区可高效整合到植物受体细胞的 染色体上并得到表达。利用这一特点， 将目的基因转入Ti质粒的T-DNA区构建 根瘤农杆菌的转化载体。
一、转基因植物
通过植物基因工程获得转基因植物在农 业生产发展及植物分子生物学研究中有 十分重要的意义，已获得的有重大经济 价值的转基因植物已经很多。
一、转基因植物
基因工程： 就是重组DNA技术，指在体 外将不同来源的DNA进行剪切和重组， 形成杂合DNA或成嵌合DNA分子，然后将 其导入特定的宿主细胞从而得到大量扩 增和表达，使宿主细胞获得新的遗传特 性，产生新的基因产物。
载体介导法
Vir区（virulence region）： ➢ 该区段上的基因能激活T-DNA转移，
使农杆菌表现出毒性，故称之为 毒性区。T-DNA区与Vir区在质粒 DNA上彼此相邻，合起来约占Ti质 粒DNA的三分之一。
Ti质粒的基因位点及其功能区域
➢ T-DNA区（transferred-DNA regions）：
产生白化苗，且由于 PEG法对原生质体活力 有害，转化率低。
应用这种方法已成功的获得大麦、柑桔、胡
椒等植物的转基因植株。
一、转基因植物
载体介导法 具体方法有农杆菌介导法、病毒介导法。 农杆菌介导可采用“共培养法”，(见
书本图10-1 B)，有根癌农杆菌和发根农 杆菌两种载体系统。
载体介导法
以野生型根癌农杆菌载体系统为例： ➢ 野生型根癌农杆菌Ti质粒大小约200-
植物转基因技术的原理和方法
植物转基因技术的原理和方法
1、植物转基因技术的原理
植物转基因技术是指将外源DNA片段插入到植物细胞的过程，从而改变植物的表型特征。
在植物转基因技术中，将外源DNA插入到植物细胞的过程包括以下几个步骤：
(1) DNA片段的生产和收集：DNA片段的生产和收集是通过一系列的生物技术手段来实现的，比如PCR扩增技术、染色体复制，等等。
(2)特異性克隆：特異性克隆是一种利用抗原受体系统的分子生物学技术，主要是通过聚合酶链反应的方法，将无菌的DNA片段植入到宿主细胞中，从而使改变细胞表型性状的抗原受体获得潜在的克隆特异来源。
(3) 载体特异性转染：载体特异性转染是将DNA片段植入到宿主细胞中的过程，它通常是利用哺乳动物质粒等载体将外源DNA片段植入到宿主细胞中。
(4) 转化：转化是植物细胞在受到DNA片段植入后，能够形成含有外源基因的植物的过程。
2、植物转基因技术的方法
(1) 诱导细胞抗性：植物转基因技术可以利用一些诱导剂，如多聚糖、双链RNA等，通过诱导植物细胞的自然抗性，让其增加免疫反应及抗外源性抗原的能力，从而提高转基因植物的转化效率。
(2) 共价结合技术：共价结合技术是一种利用化学方法将外源DNA植入植物细胞的技术，它通常利用某种活性稀释剂将DNA片段与
植物细胞表面形成稳定的共价结合，从而使外源DNA片段能够植入宿主细胞。
(3) 转化抗性：转化抗性是一种利用抗生素来抑制植物细胞的自然抗性，从而促进植物细胞内部外源DNA的转化。
一般常用的抗生素有青霉素和环丙沙星。
(4) 小麦内含体技术：小麦内含体技术是一种利用小麦内含体将外源DNA植入植物细胞的技术，它通常利用小麦内含体外质壁偶联（ECC）促进外源DNA的转化。
植物转化及转基因的检测
复杂
复杂
简单
昂贵
昂贵
便宜
低
高
低
可行
广泛
广泛
Agrobacterium tumefaciens
Ti plasmid with the new gene
+
cell’s DNA
Agrobacterium
Plant cell
Transformation
The new gene
Tr2a0n20s/6g/20enic plant
Calli are placed in vacuum chamber, Helium pressure shot DNA into cells
Gene gun
vacuum chamber
Calli remain on the high osmotic media for 2020h2o0u/6r/s20 following shooting.
• 早衰
生长期缩短、早孕早穗等
• 对环境敏感
对水、肥、温度、光照敏感
Transformation is performed by gene gun meia prepare calli for transfomation
2020/6/20
福建省农业遗传工程重点实验室
DNA with desired gene and antibiotic resistance is coated onto the surface of gold particles.
借助标记基因和报告基因的快速筛选和纯合
抗生素抗性基因
新霉素磷酸转移酶基因（nptII）——Kanr，G418r
双氢叶酸脱氢酶基因 潮霉素磷酸转移酶基因(hpt)——hygr 氯霉素乙酰转移酶基因（cat）——Cre
植物转基因技术原理及要点
通过将与生物燃料生产相关的基因导入植物中，使植物能够生产生物燃料。例如，转基因生物燃料甘蔗和藻类。
THANKS
谢谢
基因枪法
通过物理手段将目的基因 导入植物细胞，常用金粉 或钨粉作为载体。
微管注射法
将目的基因直接注射到植 物细胞内，再通过植物细 胞培养再生出转基因植株。
转基因植物的安全性评价
生态安全评价
评估转基响、基因漂移等。
食品安全评价
评估转基因植物对人类健 康的潜在影响，如食品中 营养成分的改变、毒理学 安全性等。
产量高
转基因技术可以增加植物的光合作用 效率，提高产量，有助于解决全球粮 食安全问题。
品质优良
转基因技术可以改善植物的品质，如 增加营养价值、改善口感等。
转基因植物的缺点
生态风险
转基因植物可能对非目标生物产生影响，破 坏生态平衡。
过敏反应
转基因植物可能产生新的过敏原，引发过敏 反应。
食品安全问题
关于转基因食品的安全性存在争议，长期食 用可能对人体健康产生影响。
高产优质转基因植物
高油酸转基因植物
通过将高油酸相关基因导入植物中，提高植物油中的油酸含量，从而提高油的品质和稳定性。例如， 转基因高油酸油菜和花生。
高纤维转基因植物
通过将高纤维相关基因导入植物中，提高植物纤维的产量和品质。例如，转基因高纤维亚麻和大麻。
其他应用领域的转基因植物
荧光转基因植物
通过将荧光蛋白基因导入植物中，使植物在黑暗中发出荧光，具有观赏价值。例如，转基因荧光烟草和紫茉莉。
植物转基因技术要点
目的基因的选择与获取
目的基因选择
选择对植物生长、产量、抗性等有积 极影响的基因作为目的基因，以提高 转基因植物的性状。
转基因植物的筛选与鉴定
2017年24期Technology Innovation and Application方法创新转基因植物的筛选与鉴定王迪(聊城大学东昌学院，山东聊城252000)摘要：随着植物转基因技术的不断进步，它对于分子遗传学研究和植物改良都具有特别重要的意义。
转基因植株的筛选在转基因技术中起着关键性的作用。
将含有35S启动子的基因载体PMDC150经农杆菌介导，利用农杆菌侵染拟南芥花序的方法转入拟南芥后得到T i代种 子。
文章通过组织培养来筛选含有Kan抗性的转基因植株。
关键词：拟南芥;转基因植物；筛选中图分类号:Q943 文献标志码:A文章编号:2095-2945(2017)24-0087-021文献综述1.1转基因植物的研究进展植物的遗传转化是指利用重组DNA，细胞组织培养等方 法，将外源基因导入到植物的组织或细胞中，获得转基因植物 的技术[1]。
从转基因植株成功之后，转基因技术飞速发展，如 今，植物在抗病、抗虫和抗药等方面都有了转基因植株。
这种 技术对改进农作物品质、提高产量等方面都有非常大的帮助。
1.2基因转化技术随着人们对基因转化技术不断地深入研究和探索，现已 发现多种基因转化的方法，例如农杆菌介导的基因转化、花粉 管通道法等。
相比较其他植物基因的转化方法，农杆菌介导法 有着减少成本、容易操作等优点，但对宿主细胞有着严格的要 求。
每种方法都有其优缺点，所以根据植物的不同种类，我们 要选择合理的转化方法，达到理想的转化效果。
1.3本论文的目的和意义植物的转基因技术日新月异迅速发展，已经成为许多国 家重点发展的新目标新领域，它所产生的巨大的社会和经济 效益促使各个国家对其进行更加深入的研究，由其产生的巨 大的生产潜能一定会推动社会的进步，改善人类现有的生产、生活质量以及健康水平。
本文以拟南芥为主要研究对象，通过转化后的农杆菌侵 染拟南芥花序的方法及组织培养的方法进行了转基因植物的 筛选。
借由本次实验研究，可深入了解基因工程等相关领域的 理论，可熟练掌握相关技术例如无菌操作技术、植物转基因技 术、植物组织培养技术等等。
转基因植物分子检测技术转基因植物检测
转基因植物分子检测技术转基因植物检测转基因植物分子检测专利技术姜桐桐,2，黄凤兰1,2*，陈晓凤1,2，赵永1,2，李佳会1,2，周婷婷1，常旭丰1，刘佳琪1（1.内蒙古民族大学生物化学生命科学学院.内蒙古通辽 028000；2.内蒙古自治区高校产业技术研究中心.内蒙古通辽 0280003内蒙古自治区高校蓖麻育种重点重点麻省理工学院.内蒙古通辽028000）摘要：和植物基因工程技术不断发展，转基因关键技术分子检测技术也博得不断发展，本文转述了外源基因整合抗原的检测技术和外源基因表达的检测技术，细致的描述了每种检测技术的原理和优缺点。
关键词：分子检测技术；转基因植物；原理Transgenic plant molecular detection technologyTongtong jiang1.2 Fenglang Huang1.2 * xiaofeng chen1.2 Yong Zhao1.2 Jiahui Li1.2Tingting Zhou1 Xufeng Chang1 Jiaqi Liu1(1.College of Life Science, Inner Mongolia University for the Nationalities, Tongliao city，028000；2.Inner Mongolia RegionIndustrial Engineering Research Center of Universities for Castor, Tongliao city，028000；3 The Inner Mongolia auts region castor peeding, key laboratory of colleges and universities, Tongliao city，028000）Abstract:With the continuous development of molecular biology and plant gene engineering and transgenic moleculardetection technology development, this paper introduces the foreign gene integration testing technology and exogenousgene expression detection technology, detailed describes the principle and advantages and disadvantages for each testing technology.Keywords:molecular detection technology; The transgenic plants; The principle of1近年来，转基因专利技术花粉检测技术日趋成熟，多维度多角度的多方面的检测方向分别从DNA、RNA、蛋白质来对基因工程植物进行检测，无论基因从木糖基因整合的方向，还是外源基因表达的方向，都能检测出正确的结果。
植物转化及转基因的检测
※从重组子中，提取DNA，进一步分析鉴定转化子。
表达载体构建
※将目的基因克隆到表达载体上，使之在新的遗传背景下实现功能表达。
植物基因工程的主要步骤
植物遗传转化
※ 用生物或物理方法将目的基因转入植物受体中
转基因植物的鉴定
※ 分子水平、个体水平、群体水平检测目的基因的遗传、表达及其稳定性
转基因作物的育种利用
从处于分蘖中期的供试转基因抗虫水稻植株上，随 机取三个粗壮分蘖剪取3-4cm长的叶片一片。将叶片 移置长玻璃管6.5cm×1.5cm）内经0.1g/l苯骈咪唑保 鲜液浸渍过的滤纸片上，每管分别接入5头刚孵化的蚁 螟，管口塞紧脱脂棉。自开始接虫后，第二、四、六、 八天分别考察或测定幼虫死亡率。期间向管内增添新 鲜的叶片。
对照
直链淀粉含量 %
9.7 10.9 9.6 9.9 9.2 9.3 9.6 10.4 8.9 8.9 10.8 9.2 12.8
比对照降幅 %
24.51 14.96 25.26 22.66 28.12 27.70 24.65 18.50 30.31 30.31 15.83 28.20
转基因株系的遗传分析及纯合
植物转化及转基因的检测
2021/4/8
福建省农业遗传工程重点实验室
基因工程的概念
利用DNA体外重组或PCR扩增技术从某种 生物基因组中分离感兴趣的基因，或是用人工 合成的方法获取基因，然后经过一系列切割， 加工修饰，连接反应形成重组DNA分子，再将 其转入适当的受体细胞，以期获得基因表达的 过程.
Calli are placed in vacuum chamber, Helium pressure shot DNA into cells
Gene gun
简述转基因动植物的检测鉴定方法
简述转基因动植物的检测鉴定方法
一、转基因检测鉴定方法
1、理化检测法
（1）流式细胞术：利用流式细胞术技术，检测转基因植物DNA 核酸的含量，即采用荧光染料标记的 DNA 膜，以流速技术，测定和对比转基因动植物与其他植物的 DNA 含量。
（2）蛋白质印迹：利用蛋白质印迹法，它可以对植物蛋白质分子进行快速和准确的检测，包括转基因植物中特异性抗性蛋白。
2、分子生物学技术
（1）PCR 技术：通过荧光定量 PCR 技术，可实现对单个核酸分子的高灵敏度检测，其是转基因植物检测的常用技术。
（2） Southern 胺基酸印迹：利用 Southern 胺基酸印迹法，检测基因的等位基因进行检测和分析，如同位素标记 PCR，可以有效鉴定和分析转基因植物种群中不同基因的表达量及突变情况。
3、其他技术
（1）生物分子识别：通过生物分子识别，可以有效地检测出转基因植物特有的 DNA 序列，从而对转基因植物进行鉴定。
（2）生物免疫技术：利用生物免疫技术，可以以免疫试剂盒的形式，对转基因植物进行快速检测，从而达到鉴定的目的。
- 1 -。
鉴定转基因是否成功的方法
鉴定转基因是否成功的方法
转基因是一种重要的遗传工程技术，可以将外源基因导入到生物体内，从而改变其性状和功能。
但是，如何鉴定转基因是否成功呢？下面介绍几种方法。
1. PCR扩增法。
PCR是一种可以扩增DNA序列的技术，可以通过PCR扩增转基因序列和内部参考序列，然后对扩增产物进行电泳，观察是否存在目标大小的DNA条带，从而证明是否成功转基因。
2. Southern blotting。
Southern blotting是一种检测DNA序列的方法，可以将DNA片段转移到膜上，然后使用探针特异性检测转基因序列的存在。
3. Northern blotting。
与Southern blotting类似，但是是用来检测RNA序列的方法，可以检测目标RNA是否被表达。
4. Western blotting。
Western blotting是一种检测蛋白质的方法，可以检测目标蛋白质是否被表达。
5. 生理表型。
转基因生物的表型通常会发生明显的变化，如植物的生长速度、耐旱能力、抗病性等。
通过观察生理表型的变化，也可以鉴定转基因是否成功。
综上所述，以上方法可以用来鉴定转基因是否成功，研究人员可以根据需要选择合适的方法。
- 1 -。
转基因植物的检测与鉴定
转基因植物的检测与鉴定宫雪超于丽杰高金秋哈尔滨师范大学环境与生命科学院黑龙江哈尔滨摘要对植物转基因过程中报告基因的种类和应用范围转基因植物的检测和鉴定方法转基因植物检测和鉴定方法的评价进行了综述关键词转基因植物检测鉴定评价中图分类法文献标识码文章编号植物转基因实验因受体系统的限制外源基因的转化频率较低为了达到转化目的必然要获得大量的转化材料如何在数以千万计的转化植株或细胞中快速有效地检测出转基因阳性植株或细胞外源基因是否整合到植物染色体上整合的方式如何整合到染色体上的外源基因是否正确表达等问题就成为重要的研究课题根据外源基因表达的不同水平对外源基因的检测和鉴定可以分为三个水平进行整合水平转录水平和翻译水平本文从外源基因表达的不同水平阐述转基因植物的检测与鉴定外源基因整合水平的鉴定检测外源基因是否转化成功首先是对报告基因进行检测必要时再进行目的基因的检测检测目的基因需要采用分子杂交方法报告基因报告基因必须具有两大特点一是表达产物和产物的类似功能在未转化的植物细胞内并不存在二是便于检测目前植物基因工程中使用的报告基因一般是编码酶的基因大致分为两类抗性基因和编码催化人工底物产生颜色变化的酶基因现在常用的报告基因主要有基因基因冠瘿碱合成酶基因H基因基因基因荧光素酶基因二氢叶酸还原酶基因等近年来绿色荧光蛋白基因作为一种新型的报告基因在植物基因转化及基因表达调控中得到应用并显示出较其他几个报告基因更大的优越性基因的检测基因具有以下优点①适用于各种生物的基因转化②检测方法简便无需底物酶辅因子等物质只要有紫外光或蓝光照射其表达产物就可以发出绿色荧光这对转化细胞的检测极为有利③便于活体检测十分有利于活体内基因表达调控的研究④检测时可获得直观信息有利于转基因植物安全性问题的研究及防范若此报告基因通过自然杂交扩散到其他栽培植物或杂草中时很容易通过光照获得直观信息基因的检测基因也是广泛用作转基因植物细菌和真菌的报告基因尤其是在研究外源基因瞬时表达的转化试验中基因应用的最多基因端与其他结构形成的融合基因能正常表达所产生的融合蛋白仍具有活性这为研究外源基因表达的具体细胞部位及组织部位提供了条件这是它的一大优点但是需要注意的是有一些植物在胚胎状态时能产生内源活性在转基因和代的子叶花粉和胚珠中检测到活性随着组织的成熟衰老表达逐渐停止在实验过程中要设定严格的阴性对照活性的检测方法有很多包括组织化学法色谱法荧光法等其中植物切片组织化学定位分析是分辨组织中不同细胞个体和不同的细胞类型基因表达差异的一种有效方法转基因植株的检测聚合酶链式反应是首选的转基因产品检测方法技术能够有效地扩增低拷贝的靶片段可以检测到每克样品含有～的转化基因成分对转基因产品大分子量检测的灵敏度可以达到样品含量的因为的高度特异性及检测所需的模板量仅为以内所以为外源基因整合的检测提供了便利条件尤其是在转化材料少又需及早检测的时候现在已经利用该技术对欧美杨番茄辣椒葡萄豆瓣菜小麦等转基因植物进行鉴定是转基因植物鉴定中最简单最常用的方法检测具有用量少操作简单成本低耗时少不需要同位素等优点但检测也存在缺点由于扩增十分灵敏有时会出现假阳性扩增因此检测只能作为初步结果杂交证明外源基因在植物染色体上整合情况的最可靠方法是杂交只有经过分子杂交鉴定为阳性的植株才可以称为转基因植物年第期牡丹江师范学院学报自然科学版总第期收稿日期利用杂交~可以确定外源基因在植物中的组织结构和整合位置~拷贝数以及转基因植株世代外源基因的稳定性]分子杂交是进行核酸序列分析~重组子鉴定及检测外源基因整合表达的强有力手段~它具有灵敏性高~特异性强的特点~是当前鉴定外源基因整合及表达的权威方法杂交可以清除操作过程中的污染以及转化愈伤组织中质粒残留所引起的假阳性信号~准确度高~但杂交程序复杂~成本高~且对实验技术条件要求较高根据杂交时所用的方法~核酸分子杂交又可分为印迹杂交<>~斑点<>杂交或狭缝<>杂交和细胞原位<>杂交等现在已在水稻]~玉米~大白菜]~豆瓣菜]~马铃薯~杏~烟草等植物中得到广泛应用外源基因转录水平的鉴定转录水平上的检测方法主要就是杂交~它以和探针杂交的技术检测基因在转录水平上的表达杂交杂交和杂交相比~更接近性状表现~更具有现实意义~被广泛用于转基因植物的检测~]~现已用于杨树~豆瓣菜~马铃薯~草莓~烟草等转基因植物的检测中但提取条件严格~在材料内含量不如高~不适于大批量样品的检测检测<>也是检测外源在植物体内转录表达的一种方法如果从细胞总提取物中得到特异的扩增条带~则表明外源基因实现了转录此法简单~快速~但对外源基因转录的最后决定~还需与杂交的实验结果结合外源基因表达蛋白的检测外源基因编码的蛋白在转基因植物中能够正常表达并表现出应有的功能是植物基因工程的最终目的杂交杂交是集蛋白质电泳~印迹和免疫测定为一体的检测方法它具有很高的灵敏性~可以从植物细胞总蛋白中检出的特异蛋白质~若是提纯的蛋白质~可检出～杂交检测目的基因在翻译水平的表达结果~可得知被检植物细胞内目的蛋白是否表达~表达的浓度大小及大致的分子量能直接显示目的基因在转化体中是否经过转录~翻译最终合成蛋白而影响植株的性状表现一般来讲~杂交的结果与性状表现有直接关系~]检测<酶联免疫吸附法>是一种利用免疫学原理检测抗原~抗体的技术由于酶的放大作用~使测定的灵敏度极高~可检测出的目的物~同时酶反应还具有很强的特异性除了可溶性抗原<抗体>之外~还可以检测含表面抗原的细胞该方法已用于辣椒~水稻~烟草~番茄~]等转化植株的鉴定工作中的检测虽然很灵敏~但容易出现本底过高的问题~应予以充分的注意蛋白检测试纸蛋白检测试纸是一种基于的改进方法或者~用于转基因植物表达量的检测]先将特异性抗体吸附在膜上~将膜蘸入样品溶液~蛋白质随着液相扩散~遇到抗体~发生抗原抗体反应~通过阴性对照筛选阳性结果~给出转基因成分含量的大致范围此方法操作简单~费用低~耗时少<～>原位杂交检测原位杂交技术目前在植物基因工程研究中已成为外源基因在染色体上整合定位及在组织细胞内表达定位的主要方法原位杂交技术主要有同位素原位杂交和荧光原位杂交<>~使用放射性同位素标记~放射自显影检出该方法灵敏性强~对于单拷贝的序列检出非常有效原位杂交可以分为三个层次:①染色体原位杂交~可以确定外源基因在染色体上的整合位置及整合方式~还可以研究外源基因的整合方式对外源基因遗传稳定性~外源基因表达的影响~以及不同的转化方式与外源基因整合方式的关系等重大机理问题;②组织细胞原位杂交~对特定的基因表达的进行组织细胞分布的空间定位~获得外源基因在植物组织细胞内表达情况<是否表达~表达位置~表达量等>;③外源基因表达蛋白的组织细胞免疫定位~指利用外源基因表达蛋白的抗体~通过免疫反应确定表达蛋白在转基因植物组织及细胞中的分布该方法也是研究转基因植物中外源基因功能~外源蛋白稳定性及功能蛋白含量的重要手段检测方法的评估用提取方法对目的基因进行检测方法简便~适合大批量样品的分析~又能检测目的基因的完整性~是早期检测的较好方法]~~杂交分别从整合~转录~翻译水平检测外源基因~是检测外源基因最经典~最可靠的方法虽然现在出现了一些像~等功能类似~方便快捷的检测技术~然而由于其技术本身的原因~还不能取代以上技术在转基因植物检测和鉴年第期牡丹江师范学院学报!自然科学版"# !总第期"定上的权威地位随着科学技术的发展 各种新的检测方法也在不断涌现 例如生物传感器筛选法 远红外线光谱法 定量 实时基因芯片等 每种检测方法都有其自身的优点和不足 应该根据不同的检测目的和要求 选择合适的方法 在实际工作中把几种方法结合运用 可获得外源基因不同表达水平的信息 是准确检测转基因植物产品的合理策略参考文献王学聘 卞祖娴 张晋华 等 欧美杨转基因植物的 检测 林业科学 朱新产 导入外源 对小麦基因表达的影响 西北植物学报 刘建强 孙仲序 赵春芝 转基因植物鉴定方法的研究概况 山东林业科技 李乃坚 袁四清 卡那霉素胁迫对转基因烟草种子发芽的影响 广东农业学报毛慧珠 唐惕 曹湘玲 等 抗虫转基因甘蓝及其后代的研究 中国科学 辑编辑 琳莉收稿日期 基金项目 黑龙江发展高新技术产业专项资金无基质喷雾栽培法生产脱毒小薯的研究于洪涛黑龙江省农业科学院绥化研究所 黑龙江绥化摘要 研究了无基质喷雾栽培法生产马铃薯脱毒小薯过程中不同品种 不同苗来源及不同收获方式对块茎产量的影响 结果表明 无基质喷雾栽培法生产马铃薯小薯以扦插苗分期收获效果最佳 无基质喷雾栽培比较适合栽培早熟品种以早大白最佳 关键词 无基质 马铃薯 脱毒小薯 中图分类法 文献标识码 文章编号在马铃薯良种繁育体系中 原种的生产是关键环节 其质量的高低和数量的多少直接影响马铃薯的生产 无基质喷雾栽培法是一种极有前途的核心种薯生产方法 其主要技术是将适于马铃薯不同发育时期的营养液适时适量地喷于保持在黑暗状态下的马铃薯植株根际 使马铃薯根际获得充分的养分 促进马铃薯块茎的生长 马铃薯喷雾栽培技术在我国尚属起步阶段 提高其生产效率是生产实践中亟待解决的问题 为此 本试验对无基质喷雾栽培法生产马铃薯脱毒小薯过程中不年第 期牡丹江师范学院学报 自然科学版总第 期转基因植物的检测与鉴定作者：宫雪超， 于丽杰， 高金秋， GONG Xuechao， YU Lijie， GAO Jinqiu作者单位：哈尔滨师范大学环境与生命科学院,黑龙江,哈尔滨,150025刊名：牡丹江师范学院学报（自然科学版）英文刊名：JOURNAL OF MUDANJING TEACHERS' COLLEGE(NATURAL SCIENCES EDITION)年，卷(期)：2007(1)被引用次数：3次1.Datta S K;A Petew 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转基因植物的分子检测与鉴定方法及进展
转基因植物的分子检测与鉴定方法及进展随着分子生物学和植物基因工程的不断发展，越来越多的育种工作者开始利用转基因技术获得常规育种技术难以得到的新种质和新品种。
植物转基因技术最大的好处在于可以打破自然界物种间原有的生殖隔离，促进基因在不同物种间的交流，极大地丰富变异类型，增大遗传多样性，为植物新品种的培育提供丰富的育种资源。
通过对基因功能的研究，筛选m目的基因，还可实现植物性状的定向改良。
因此该技术自1983年首次获得转基因植物以来，便深受育种工作者青睐，得到了蓬勃地发展。
至今已有30多科约200多种植物转基因成功；国际上相继有30多个国家批准3 000多例转基因植物进入田间试验，并且在美国、加拿大、中国等20多个国家成功进行了商品化生产…。
到2006年止，全球转基因作物的商业种植面积达1．02亿hm2，比2005年增长13％，是1996年的62倍。
转基因作物品种在农业生产中日益显现出巨大潜力。
植物转基因操作中，除利用抗生素抗性和除草剂抗性等选择基因排除非转化细胞而留存转化细胞，以及利用Gus和CFP等报告基因显示转基因成功外，更重要的是从分子水平鉴别出阳性转化体，明确目的基因在转基因植株中的拷贝数和转录与表达情况。
本文就常用的转基因植株检测与鉴定方法作一概述，并对近期发展起来的新方法做简要介绍。
1 外源基因整合与否及其整合拷贝数的鉴定1．1 PCR(p01 ymera se chain reaction)检测1．1．1 常规PCRPCR技术对目的片段的快速扩增实际上是一种在模板DNA、引物和4种脱氧核糖核苷酸存在的条件下利用DNA聚合酶的酶促反应，通过3个温度依赖性步骤(即变性、退火和延伸)完成的反复循环。
经PCR扩增所得目的片段的特异性取决于引物与模板DNA间结合的特异性。
根据外源基因序列设计出一对引物，通过PCR反应便可特异性地扩增出转化植株基因组内外源基因的片段，而非转化植株不被扩增，从而筛选出可能被转化的植株。
第十章 转基因植物的检测与鉴定
二、外源基因整合的PCR-Southern检测
该方法是先对被检测材料进行外源基因的PCR扩增， 然后再用目的基因的同源探针与扩增的特异性条带 进行杂交。 注意：设置三个对照 空白对照：无任何DNA模板；
阳性对照：以外源基因的重组质粒DNA为模板；
阴性对照：以非转化植株基因组DNA为模板。
图28-3地高辛标记探针杂交体检出原理示意图
3、标记方法
放射性标记有体内标记法及体外标记法。体外 标记法包括化学法、酶法和PCR法
酶法：是先将标记物标记在核苷酸上，然后通
过酶促聚合反应使带标记的核苷酸掺入到核酸 序列中，产生合适探针。 包括切口平移法及随机引物法。
PCR法：是利用Taq酶可将修饰的核苷酸掺入到 PCR产物中（如32P-dNTP、地高辛-dUTP荧光素 标记的dNTP）所得PCR产物可用作探针。 化学法：是通过标记物的活性基团与核酸分子 中的某种基团发生化学反应而继续标记，标记 物直接与核酸分子相连。
抗生物素蛋白可与酶、荧光素等物质结合，是抗生物 素蛋白被这些物质标记，杂交时，生物素标记探针与 被检的单链DNA中同源序列杂交，检出时，加入被酶等 标记物标记的抗生物素蛋白，生物素与被标记的抗生 物素蛋白特异结合，形成杂交DNA-生物素-抗生物素酶等标记物的杂交检出体系，根据抗生物素蛋白上的 标记物性质进行检出。
一、ELISA检测
1、抗体的制备
抗体：是机体应抗原刺激产生的一组特殊的 球蛋白，Ig表示。
ELISA检测中涉及的抗体有两种，未标记的抗 体和酶标记的抗体，酶标记的抗体有包括两 种：一是针对特异抗原的酶标一抗，一是针 对一抗的酶标二抗。
转基因玉米的鉴别方法
转基因玉米的鉴别方法转基因玉米的鉴别可以采用许多复杂的技术，如分子标记分析，流式细胞术，实时定量PCR（qPCR）分析，蛋白分析，原位杂交等。
不过，可能也需要结合抗性检测或外部鉴别等方法。
其中常用的鉴定方法包括：（1）PCR 技术：它是利用脱氧核糖核酸（DNA）特异序列引物以及Taq 酶在反转录-聚合酶链反应（PCR）对转基因玉米的标志基因位点进行检测的一种技术，可以在体外快速、准确的鉴定不同的转基因玉米类型。
（2）分子权重（w）分析：它是利用核酸序列的分子量（mw）或分子量值来鉴定转基因玉米的一种技术，通过比较转基因玉米基因组DNA的分子量值与对照群体完全不同的DNA分子量值之间的差异，从而可以发现转基因玉米特有的特征。
（3）DNA 指纹：它是一种利用一系列剪接酶来生成特定基因组DNA片段的技术，可以用来鉴别转基因玉米的品种和基因组结构的变化。
（4）十二碳溴代酰胺（DCC）方法：它是一种利用基因片段中的三磷酸核苷（ATP）酶活性来鉴定转基因玉米特征的技术，可以利用电泳和有机溶剂中和镜翻转作为反应条件来鉴定基因片段的ATP 活性构成和构成比例，从而进行结果判断。
二、临床应用检测转基因玉米被广泛应用于药用植物、食物营养研究中，以及转基因产品的供应链及食品中的安全性研究中。
1. 检测转基因玉米的安全性研究：主要用于分析转基因玉米中毒性和敏感性的机制、治疗疾病进程及临床应用前的安全性评价等。
2. 转基因产品的供应链管理及检测：通过检测转基因玉米以及它在从种子到品牌食品所处的每个环节可以发掘出转基因物质在食品中是否合法。
3. 营养食品研发：通过系统地建立序列和功能数据库以及筛选和鉴别转基因玉米中的营养物质和抗耐性基因，找到一种能健康滋养身体的有效营养物质，用于营养食品的研发。
植物基因转化与转基因植株鉴定
3. 目标基因 PCR 扩增 采用 PrimeSTARTM HS DNA Polymerase 高保真酶从玉米 cDNA 中扩增 ZmMKK4 全长编码序列（GenBank 序列号：NM_001158890.1）。 ZmMKK4 扩增引物：F-ZmMKK4，R-ZmMKK4。 25μL 反应体系为：5 μL 5× PrimeSTAR Buffer (Mg2+ Plus)，2 μL dNTP Mixture (各 2.5 mM)，1μL 上游引物（5μM），1μL 下游引物（5μM），1 μL cDNA，0.25 μL PrimeSTARTM HS DNA Polymerase，加 ddH20 至 25μL。PCR 扩增程序为 98C 98C 58C 72C 72C 1～3 min 10 s 15 s 1.5 min 10 min
图 1 外源基因转化流程图
三、实验目的和实验要求 目的： 学习和掌握从基因分离克隆到植株转化及转基因植株的筛选整个实验 体系。 要求： 综合利用前面的单个实验环节所掌握的知识， 获得完整的实验理念， 并在实验过程中学会设计、构建适合的载体并将外源基因转化植株。 四、实验材料和方法 （一）实验仪器 PCR 仪， 凝胶成像系统， 台式高速离心机， 台式高速冷冻离心机， DU 640 紫 外分光光度计，UV-2450 分光光度计，精密 pH 计，微量移液器，控温摇床，电 子天平，制冰机，-80C 超低温冰箱，电热恒温水浴锅，自动电热压力蒸汽灭菌 器，超净工作台，光照培养箱等 （二）试剂及配方 Trizol试剂，RevertAid™ First Strand cDNA Synthesis Kit，DNase I，2× PCR Master Mix，FastDigest 限制性内切酶，T4 DNA Ligase，PrimeSTARTM HS DNA Polymerase 高保真酶， pEASY-Blunt C， 质粒提取试剂盒 （E.Z.N.A. Gel Extraction Kit） ， 凝胶回收试剂盒 （E.Z.N.A. Plasmid Mini Kit I） ， DNA提取试剂盒， Kanamycin （Kan） ，Ampicillin（Amp） ，Carbenicillin（Cb） ，电泳缓冲液，LB培养基、YEB 培养基，烟草培养基如下表1.
转基因植物的筛选与检测
曝光显影后的条带
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• 总结：这些技术需要转膜、杂交，操作繁 琐，费用高,可对转基因植株随机取样检测。 • Southern 杂交特异性强，确定转基因植株 中基因的存在、整合及稳定性，是检测外 源基因的最可靠的方法。 • Western杂交灵敏度高，能检测出蛋白质表 达量，最具有现实意义。
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谢谢大家！
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• Northern 杂交的主要原理是把变性 RNA 转移和固定在特定的薄膜上 , 用特定的 DNA 探针来检测 RNA。 • 特点：
Northern 杂交与Southern 杂交相比 , 更接近于性 状表现 , 更有现实意义 , 被广泛用于转基因植株 的检测。但RNA 提取条件严格 , 在材料内含量少 , 不适于大批量样品的检测。
转基因植物的筛选与检测
转基因植物的筛选与检测
• 问题 • 1.进行转基因操作了，如何选出来已成功 导入基因的细胞？ • 2. 转化体里的外源基因是否成功的表达了 呢？
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一、筛选的方法与原理
• 通过特定基因在转化体内的表达，利用特 定的试剂，选择出来转化细胞。
• 注： 1.特定基因又称“抗性基因” 2.表达方式：蛋白质的合成、酶的失活等
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• Southern 印迹杂交是利用标记的探针 （probe）与膜上靶DNA片段进行杂交的技 术，检测靶DNA片段中是否存在与探针同 源的序列。 • 特点：
可清除操作过程中的污染 (如 DNA 分离及植物 DNA 分离过程中的交叉污染) ，以及转化愈伤胞 间质粒残留所引起的假阳性信号，准确度高。 Southern 杂交程序复杂，成本高 ，且对实验技术 条件要求较高。
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Southern杂交
• • • • • • • 1.提取DNA 2.电泳 3.变性 转移 DNA 印迹 4.转膜 5.固定DNA 6.探针的标记 7.杂交与检测（NBT/BCIP显色）
植物基因转化及转基因植物的分析与鉴定
植物基因转化及转基因植物的分析与鉴定1. 引言植物基因转化是一种重要的生物工程技术，利用这种技术可以引入外源基因或修改内源基因，从而改变植物的性状和功能。
转基因植物是通过植物基因转化技术获得的具有外源基因的植物，具有重要的应用价值。
本文将介绍植物基因转化的基本原理和方法，并探讨转基因植物的分析与鉴定方法。
2. 植物基因转化的基本原理和方法2.1 基本原理植物基因转化利用穿透细胞壁的技术，将外源DNA导入植物细胞，通过细胞的内源机制使其稳定地表达。
常用的植物基因转化方法包括农杆菌介导的转化、生物弹射法和基因枪法等。
2.2 基本方法2.2.1 农杆菌介导的转化农杆菌介导的转化是最常用的植物基因转化方法之一。
基本步骤包括构建表达载体、感受剂的处理和遗传转化的选择和鉴定。
构建表达载体时，将目标基因插入适当的载体上，并添加转录和翻译的调控序列，如启动子和终止子，以确保目标基因的表达。
感受剂的处理是将表达载体导入农杆菌中，并通过培养条件的优化，使农杆菌中的表达载体得到高效表达。
遗传转化的选择和鉴定是将感受剂经过适当的处理后，转化到植物细胞中，并通过筛选和鉴定来确定转化成功的细胞株。
2.2.2 生物弹射法生物弹射法是将DNA以高速撞击植物细胞，使其穿透细胞的质壁和细胞膜，进而将外源基因导入细胞内。
生物弹射法通常使用微粒子加速器或毛发管射击法进行。
微粒子加速器是一种将金属微粒或微球与外源DNA一起加速，并将其发射到目标细胞上的设备。
通过微粒的高速撞击，外源基因能够穿透细胞的质壁和细胞膜。
毛发管射击法是将DNA包裹在微小的金属颗粒上，然后使用高压气体将金属颗粒射击到目标细胞上。
这种方法也能够使外源基因穿透细胞膜进入细胞。
2.2.3 基因枪法基因枪法是将外源DNA包裹在金粒或微米级金属颗粒上，并使用高压气体或炮发射器将其穿过细胞质，进入植物细胞。
基因枪法不需要依赖转化菌或细胞融合等辅助手段，直接将外源DNA送入目标细胞，因此具有较高的成功率。
转基因植物的检测与鉴定
第七章转基因植物的检测与鉴定主要内容一、PCR检测二、报告基因的表达检测三、Southern杂交鉴定四、Northern杂交鉴定五、外源基因表达蛋白的检测六、其它方法根据国内外几十年的研究，目前认为转基因植物的证据应有以下几点：①要有严格的对照（包括阳性及阴性对照）；②转化当代要提供外源基因整合和表达的分子生物学证据（PCR检测、Southern杂交，Northern 杂交，Western杂交）与表型数据（酶活性分析或其它）；③提供外源基因控制的表型性状证据（如抗虫、抗病等）；④根据该植物的繁殖方式（有性繁殖还是无性繁殖）提供遗传证据。
有性繁殖作物需有目的基因控制的表型性状传递给后代的证据，无性繁殖作物有繁殖一代稳定遗传的证据。
一、PCR检测1.概述2.基本原理3.特点4.步骤一、PCR检测1. 概述PCR是聚合酶链式反应（polymerase chain reaction）的简称。
它模拟DNA聚合酶在生物体内的催化作用，根据检测的目的片段及一定的原则设计引物，与模板DNA经过变性、退火、延伸三步骤的数个循环，对特异DNA序列进行扩增，可以在一只小小的离心管中几小时内使目的DNA 片段扩增数百万倍。
一、PCR检测1. 概述PCR检测所需的模板量仅为10ng以内，而且粗提的DNA就可以得到良好的扩增效果，因而这一技术的出现为外源基因整合的检测提供了便利条件，尤其是在转化材料少又需及早检测的时候。
但由于PCR扩增十分灵敏，有时会出现假阳性扩增，因此检测的只是初步结果。
穆利斯(Kary Mullis 1944～)美国化学家Nobel prizewinners in chemistry 1994一、PCR检测2.基本原理•DNA模板变性双链DNA是通过94℃左右的高温使其发生变性，形成单链DNA。
•模板与引物退火将合成的两个寡核苷酸引物分别与待扩增DNA 两端的序列互补。
通过控制退火条件，引物就能准确地与扩增区域的两端配对。
转基因植物的鉴定
转录水平上的检测主要方法是Northern 杂交，它是以DNA或RNA为探针，检测 RNA链。 和Southern杂交相同，Northern杂交包括 斑点杂交和印迹杂交。
也可用RT-PCR（reverse transcribed PCR）方 法检测外源DNA在植物体内的转录表达。 其原理是以植物总RNA或mRNA为模板进行 反转录，然后再经PCR扩增。 如果从细胞总RNA提取物中得到特异的cDNA 扩增条带，则表明外源基因实现了转录。 此法简单、快速，但对外源基因转录的最后 决定，还需与Northern杂交的实验结果结合。
ELISA与经典的同位素标记为基础的液 －液抗原－抗体反应体系不同之处在于 建立了固－液抗原抗体反应体系，并采 用酶标记，抗体与抗原的结合通过酶反 应来检测。 由于酶的放大作用，使测定的灵敏度极 高，可检测出1pg的目的物，同时酶反 应还具有很强的特异性。
探针与其互补的核苷酸序列杂交后，杂 交体也就带上了同样标记，可被检测出 来。 这样，以特定的已知核苷酸序列做探针， 就可以在诸多的核苷酸序列中，通过杂 交探测出与其互补的序列，因而分子杂 交是进行核酸序列分析，重组子鉴定及 检测外源基因整合表达的强有力手段。
它具有灵敏性高（可检出10-12g，即1pg DNA样品）、特异性强（可鉴别出20个 碱基对左右的同源序列）的特点，是当 前鉴定外源基因整合及表达的权威方法。 根据杂交时所用的方法，核酸分子杂交 又可分为印迹杂交、斑点（dot）杂交、 狭槽（slot）杂交和细胞原位（in situ） 杂交等。
PCR检测所需的模板量仅为10ng以内， 而且粗提的DNA就可以得到良好的扩增 效果，因而这一技术的出现为外源基因 整合的检测提供了便利条件，尤其是在 转化材料少又需及早检测的时候。 但由于PCR扩增十分灵敏，有时会出现 假阳性扩增，因此检测的只是初步结果。