双光子及光谱扫描在激光共聚焦显微镜上的应用经验
双光子显微成像原理及近期应用案例
双光子显微成像原理及近期应用案例双光子显微成像是一种高分辨率的成像技术，它利用两个光子的共同作用实现对生物样本的成像。
该技术在生命科学、医学和材料科学等领域有着广泛的应用。
本文将介绍双光子显微成像的原理，并探讨其在近期的应用案例。
双光子显微成像的原理是基于非线性光学效应。
在传统的荧光显微镜中，利用单光子的激发来激发和探测样品中的荧光信号。
然而，单光子的能量较高，容易导致样品的光化学损伤和细胞的光毒性作用。
而双光子显微成像则采用两个光子的准同步非共线激发，以降低光毒性并增加分辨率。
双光子显微成像的工作原理是通过使用超短脉冲激光来激发样品中的荧光物质。
这种超短脉冲激光具有高能量浓度和高峰值功率，可以实现光穿透较深的样品，如活体组织。
当两个光子同时到达荧光物质并被吸收后，它们的能量叠加，使得荧光物质处于激发态，进而发出荧光信号。
通过检测和记录这些荧光信号，可以获取样品的高分辨率图像。
在生命科学领域，双光子显微成像因其高分辨率和非侵入性的优势而得到广泛应用。
例如，研究者可以利用双光子显微成像技术观察细胞内的亚细胞器、蛋白质分子和细胞结构的变化。
双光子显微成像还可以用于监测神经元活动和细胞信号传导等重要生理过程。
通过对这些生物学过程的观察和研究，我们可以更好地理解生命的本质和疾病的发生机制。
近年来，双光子显微成像在医学诊断和治疗方面也取得了重要进展。
例如，在皮肤科领域，双光子显微成像可以非侵入性地观察皮肤水分含量、胶原蛋白分布和血管结构等，从而帮助医生诊断和治疗各种皮肤病。
另外，双光子显微成像还可以用于术前虚拟操作和手术引导等方面，提高手术的准确性和成功率。
例如，在眼科手术中，医生可以利用双光子显微成像技术精确地观察眼底血管和细胞变化，从而为患者提供更好的治疗方案。
除了生命科学和医学领域，双光子显微成像还在材料科学、纳米技术和能源研究等领域得到广泛应用。
例如，研究者可以利用双光子显微成像技术观察材料中的晶格结构、电子云变化和界面反应等，为新材料的设计和合成提供重要的参考。
双光子及光谱扫描在激光共聚焦显微镜上的应用经验
Ex 1000
498
副发射峰位于约540nm
Lambda合成图特征：
GFP标记利水用稻根不中同自发波荧长光的的清双除 光子激光照 目La的mb：d了a射合解成土可图壤能特中征的含：不碳同细纳菌米间的管竞的争关靶系向药物， 目的：了la解m土b壤d中a的扫不描同细发菌现间的荧竞光争关信系号呈现 e原x理90：0某n严m些做材格z料-s的在tac双倍k，光频显子示激关多发系层，光会刻发效射果波，长信为号激随发深光度一增半加的而荧衰光减
GFP：绿色偏蓝
呈台阶形
自发荧光：绿色偏黄
自发荧光：
叶绿素荧光：红色
在560nm左右对称分布
叶绿素荧光：
625nm以上强烈信号
转基因ห้องสมุดไป่ตู้料的快速筛选
原则：密集预排列待测样
技巧：lambda扫描
色彩判别
荧光峰形检查
GFP蓝绿特征色
GFP台阶形特征峰
518
540
土壤浸出液中外源GFP标记细菌浓度分析
目的：了解土壤中的不同细菌间的竞争关系 方法：等比掺入外源GFP标记菌体，设置多种 环境条件 问题：土壤标本背景嘈杂，往往带有各种带荧 光的杂质颗粒 解决： 1 固定样品体积 2 lambda成像检测GFP特异荧光 3 最大化pinhole
主 6绿2发色5n射信m峰 号以激 光位 被上于 强发一强约 烈烈，半红5信1光会的号8n掩m发荧盖射光波长为激发
3 最大化pinhole
GFP和RFP弱时无法分辨
ex 900nm 做z-stack，显示多层光刻效果，信号随深度增加而衰减
利用光谱扫描鉴定微弱荧光信号的真假
后者高度约为前者的一半
在2个不同Z坐标下做bleach， ex 458nm
双光子和光谱扫描在激光共聚焦显微镜上的应用经验
图像采集与处理
采集参数设置
根据样本特性和实验目的，合理 设置图像采集的参数，如曝光时 间、增益等，以提高图像质量。
图像处理与分析
利用专业软件对采集到的图像进 行必要的处理和分析，如去噪、 增强对比度、测量荧光强度等。
数据导出与共享
将处理后的数据导出为通用的文 件格式，便于进一步的数据分析 和共享。
防止光漂白
在观察过程中，应尽量避免长时间 照射和频繁扫描，以减少荧光染料 的光漂白。
荧光探针的选择与使用
探针特异性
选择具有高特异性的荧光探针，以确 保标记的准确性和可靠性。
探针浓度与稳定性
探针混合使用
在某些情况下，可能需要将几种荧光 探针混合使用，此时应确保它们之间 不会发生相互干扰或淬灭现象。
根据实验需求，调整荧光探针的浓度， 并确保其在样本中的稳定性。
药理学研究中的应用
总结词
双光子和光谱扫描在药理学研究中具有重要价值，能够观察药物对细胞和组织的影响，有助于发现新 的药物作用机制和靶点。
详细描述
在药理学研究中，双光子和光谱扫描技术被广泛应用于观察药物对细胞和组织的影响。这些技术能够 实时监测药物对细胞代谢、能量代谢、蛋白质表达等方面的影响，帮助科学家们发现新的药物作用机 制和靶点，为新药研发提供有力支持。
04 技术挑战与未来展望
提高成像深度与分辨率
优化双光子吸收截面
通过提高双光子吸收截面，可以降低成像所需的激光功率，从而 减少光毒性。
开发新型光谱扫描技术
通过改进光谱扫描技术，可以实现更快速、更准确的图像采集，提 高分辨率。
优化光学元件
选用高数值孔径的物镜和低噪声的光电探测器，提高成像深度和分 辨率。
察细胞和组织的细微结构。
激光扫描共聚焦显微镜技术讲解
激光扫描共聚焦显微镜技术Laser Scanning Confocal Microscope——基础篇李治国细胞的内在生活显微镜的发展史没有显微镜就不可能有细胞学诞生。
1590年，荷兰眼镜制造商J 和Z.Janssen 父子制作了第一台复式显微镜。
1665年，英国人Robert Hook首次描述了植物细胞(木栓，命名为cella 。
1680年，荷兰人A.van Leeuwenhoek成为皇家学会会员，他一生中制作了200多台显微镜和400多个镜头，用设计较好的显微镜观察了许多动植物的活细胞与原生动物。
Made by A.van Leeuwenhoek (1632-1723.Magnification ranges at 50-275x.显微镜的最重要参数——分辨力显微镜物象是否清楚不仅决定于放大倍数，还与显微镜的分辨力（resolution ）有关。
分辨率是指区分开两个质点间的最小距离各种显微镜的分辨能力光学显微镜（light microscopy）0.2μm电子显微镜 (Electro microscopy 0.2nm扫描遂道显微镜 (scanning tunneling microscope 0.2nm以下 1932年，德国人M.Knoll 和E.A.F.Ruska 发明电镜，1940年，美、德制造出分辨力为0.2nm 的商品电镜。
1981年，瑞士人G.Binnig 和H.RoherI 在IBM 苏黎世实验中心（Zurich Research Center）发明了扫描隧道显微镜而与电镜发明者Ruska 同获1986年度的诺贝尔物理学奖。
常用的光学显微镜（light microscopy普通光学显微镜暗视野显微镜相差显微镜偏光显微镜微分干涉显微镜荧光显微镜激光共焦扫描显微镜普通光学显微镜原理普通光学显微镜原理图1. 构成：①照明系统②光学放大系统③机械装置2. 原理：经物镜形成倒立实像，经目镜放大成虚像。
激光共聚焦显微镜的原理和应用
激光共聚焦显微镜的原理和应用1. 引言激光共聚焦显微镜（Laser Scanning Confocal Microscope，简称LSCM）是一种高分辨率的显微镜技术，已经广泛应用于生物学、医学和材料科学等领域。
本文将介绍激光共聚焦显微镜的原理和应用。
2. 原理激光共聚焦显微镜通过激光束的共聚焦和通过物体的反射或荧光发射来实现图像的采集。
2.1 激光共聚焦•通过透镜来聚焦激光束•聚焦点在样本表面上产生光斑•样本反射或发射出来的光再次通过透镜，聚焦到探测器上•透镜的位置可以移动，可以扫描整个样本2.2 反射和荧光信号的采集•激光束照射到样本上，经过反射或荧光发射•光学系统收集并聚焦这些发射的光•通过探测器记录下发射光的强度和位置•通过移动透镜和探测器，可以获得样本的三维图像3. 应用激光共聚焦显微镜在许多领域都得到了广泛的应用，以下是其中的几个典型应用。
3.1 细胞生物学•可以观察细胞的形态和结构•可以追踪细胞内的生物分子运动•可以观察细胞的生物化学过程3.2 分子生物学•可以观察和定量细胞器的分布和聚集情况•可以观察和测量分子的扩散速率•可以研究蛋白质的合成和代谢过程3.3 医学研究•可以观察和诊断组织和器官的病理变化•可以研究疾病的发生和发展机制•可以评估治疗方法的有效性和副作用3.4 材料科学•可以观察材料的微观结构和表面形貌•可以研究材料的热力学和力学性质•可以评估材料的耐久性和可靠性4. 总结激光共聚焦显微镜是一种高分辨率的显微镜技术，通过激光束的共聚焦和物体的反射或荧光发射来实现图像的采集。
它在细胞生物学、分子生物学、医学研究和材料科学等领域都有着广泛的应用。
利用激光共聚焦显微镜，科研人员可以观察和研究生物和材料的微观结构、功能和相互作用，为科学研究和应用提供了强大的工具。
激光共聚焦扫描显微镜成像的基本原理
激光共聚焦扫描显微镜成像的基本原理激光共聚焦显微镜（LCM）是近年来发展起来的一种高分辨率荧光显微成像技术。
它通过将样品置于激光束的焦点处，利用高灵敏度的探测器记录样品发出荧光信号，从而实现对样品内部结构的高分辨率成像。
本文将详细介绍LCM的基本原理、成像途径、成像原理及优缺点等方面的内容。
一、激光共聚焦显微镜的基本原理激光共聚焦显微镜基于利用激光束在三维空间内聚焦成极小的点状光斑，对样品进行扫描成像的技术原理。
在聚焦点位置，通过聚焦光斑的极高光密度，激活样品中的荧光染料，荧光染料则针对特定的结构在荧光信号波长处发出荧光信号，被高灵敏度荧光探测器探测并记录下来，然后通过计算机处理、分析和重建，生成高质量的高分辨率图像。
与普通显微镜最大的区别在于，普通显微镜由于透过整个样品并以相位差效应成像，而激光共聚焦显微镜由于仅仅聚焦于样品表面的非常窄的一点，信号只能从聚焦点的附近探测到，而且该点在扫描过程中会不断变换位置。
换言之，成像并不是透过整个样品实现，而是在样品上面扫描得到，并聚焦于单个点上。
对于毫米量级的样品，其层面精度可以达到25nm。
二、激光共聚焦显微镜成像途径激光共聚焦显微镜的成像途径目前有两种，分别为单光子激发型和双光子激发型。
1、单光子激发型单光子成像模式是利用激光束在荧光染料上发生的单光子激发效应进行成像的一种方式。
在单光子激发光下，荧光染料的各自精细结构会发生辐射跃迁产生能量并发射荧光，同时发射时间对荧光能量的传递产生影响，可以通过荧光转移速率反映。
荧光束在被激活后，将以光子流的形式反射回来，被共聚焦显微镜探测并捕捉。
2、双光子激发型双光子成像模式使用了两次光子激发效应，产生高到对比度的图像，并最小化了样品在激发时所受的损伤输出功率。
双光子成像所需条件包括至少两个光子激发、空间和时间上的集中在样品特定区域。
在这种情况下，激光光束相互作用，将样品中转运载分子激发成放射的谐振态发生荧光发射。
双光子激光扫描荧光显微镜及其应用
表 1 几种常见荧光分子的单光子 、双光子 和三光子的吸收截面 3 [5 ]
荧光分子
δ1 (λ/ nm) / 10 - 16cm2
ηδ2 (700nm)
/ 10 - 50cm4·s / 光子
ηδ3 (700nm) / 10 - 83cm6·s2/ 光子2
DAPI free
113 (345nm)
Dansy1
TWO PHOTON LASER SCANNING FL UORESCENCE MICROSCOPY AND ITS APPL ICATIONS
CHEN De2Qiang XIA An2Dong WAN G Ke2Yi HUAN G Wen2Hao
( Depart ment of Precision M achi nery and Inst rument ation , U niversity of Science and Technology of Chi na , Hef ei 230026)
图 1 单 、双光子激发过程示意图
图 2 单 、双光子激发所形成的荧光形貌 (样品为罗丹明 B 的水溶液. 上为单光子激发 ,下为双光子激发)
3 材料的吸收截面 δ
吸收截面 δ是双光子激发现象的重要参数 , 它 的大小反映了分子吸收双光子的本领. 对单光子激 发中的吸收截面 δ已有较为准确的文献记载 , 而对 双光子乃至多光子吸收截面 δ,目前尚缺乏全面 、准 确的记载. 因此 ,对常用的荧光分子多光子吸收截面 δ和光谱的进一步研究 , 将有助于多光子激发共焦 激光扫描荧光显微镜的进一步广泛应用.
·232 ·
2 双光子激发原理简介
在激光照射下 ,基态荧光分子或原子吸收一个 光子后成为激发态 ,随后又弛豫到某一基态 ,同时以 光子形式释放能量而发出荧光. 这一过程就是通常 的单光子激发情况. 1931 年 ,Maria G ppert - Mayer 预言一个分子或原子可以在同一个量子过程中 ,同 时吸收两个光子而成激发态 ,这种情况就是双光子 激发过程[2 ] . 1961 年 , Kaiser 等在 CaF2 ∶Eu2 + 晶体 中首次观察到了这种双光子激发现象[3 ] . 图 1 简单 地描述了这种双光子激发的过程. 比如在单光子激 发情形 ,NADH 酶在 350nm 的光激发下产生 450nm 的荧光 ,而在双光子激发情形 , NADH 酶则需同时 吸收两个 700nm 的光子才能产生 450nm 的荧光. 这 就是说 ,双光子技术可以使我们无需使用紫外光源
激光共聚焦显微镜的原理与应用范围讲解
激光共聚焦显微镜的原理与应用范围讲解激光共聚焦显微镜（Confocal laser scanning microscope, CLSM）是一种高分辨率的显微镜技术，它利用激光束进行点扫描，将样品的不同深度处的信息获取并合成，从而实现三维图像的获取。
本文将对激光共聚焦显微镜的原理和应用范围进行详细介绍。
首先是激光扫描。
激光束通过空气透镜和扫描镜反射，聚焦在样品上。
扫描镜以一个固定的频率和幅度来快速振动，使得激光束扫描在样品表面，形成二维扫描像。
其次是共焦原理。
共焦显微镜利用一个空孔径光阑（pinhole）来调整激光束的直径，只允许经过焦平面的光通过，其他散射光被阻挡。
这样可以消除在光路上不同深度处的散射光干扰，提高图像的纵向分辨率。
同时，由于只有通过焦平面的光才能进入探测器，所以可以采集不同深度处的信息，合成三维图像。
最后是探测技术。
通常激光共聚焦显微镜会配备一个光电探测器，并通过探测器来收集散射和荧光光信号。
散射光可以用来形成反射式图像，而荧光光信号则可以用来观察标记了特定分子或细胞的样品。
通过调整激光的波长和探测器的设置，可以实现不同特定分子和结构的成像。
1.细胞和组织成像：激光共聚焦显微镜可以提供高分辨率的细胞和组织成像。
通过荧光标记特定蛋白质或细胞结构，可以观察和研究细胞内部的生物过程和结构。
2.神经科学：激光共聚焦显微镜在神经科学中的应用得到了广泛关注。
可以观察和追踪神经元的形态和功能，研究神经网络的连接和活动，揭示神经系统的工作机制。
3.生物医学研究：激光共聚焦显微镜在生物医学研究中也扮演着重要的角色。
可以用于癌症细胞的培养和观察，研究癌症的发生和发展机制。
还可以用于研究哺乳动物早期发育过程中的细胞分化和组织形态的变化。
4.材料科学：激光共聚焦显微镜可用于对材料的表面和内部结构进行观察和分析。
可以研究纳米材料的形貌和组成，观察材料的晶体结构和缺陷。
总之，激光共聚焦显微镜是一种重要的显微镜技术，具有高分辨率、三维成像和可观察特定分子和结构的能力。
共聚焦激光扫描显微镜技术在医学研究中的应用讲解
共聚焦激光扫描显微镜技术在医学研究中的应用上世纪80年代发展起来的一种先进的细胞生物学分析仪器,是一项具有划时代意义的高科技新产品,是近代生物医学图像分析仪器最重要的发展之一,有细胞“CT”之称。
它是在荧光显微镜成像基础上加装了激光扫描装置,利用计算机进行图像处理,使用紫外线或可见光激发荧光探针,从而得到组织内部微细结构的荧光图像,在亚细胞水平上观察诸如Ca2+,pH值、膜电位等生理信号及细胞形态改变,成为形态学、分子细胞生物学、神经科学、药理学、遗传学等领域中新一代较有力的研究工具。
1 基本构造与原理 CLSM是将光学显微镜技术、激光扫描技术和计算机图像处理技术结合在一起的一种高尖设备。
其主要由计算机系统、激光发射系统、探子系统、X-Y轴台阶系统和Z轴前进马达构成。
计算机系统一般由不同型号的CLSM作相应硬件配置及相应的图像采集、分析、离子测定等软件配置。
激光器通常是氪-氩离子混合激光管,可有多个激光波长。
按工作介质不同,激光器可分为气体、固体、染料和半导体等几种。
而近年来问世的双光子激光器具有更明显的优势。
“双光子”具有更强的穿透力,更为重要的是其比普通的CLSM的激光能量低,因此对活细胞的损伤更小, 同时减少高能量激光对荧光染料的漂白效应,从而使观察活细胞的实验过程延长。
CLSM采用点光源代替传统光镜的场光源,使探测点与照明点相对于物镜焦平面是共扼的。
焦平面以外的点不会在探测点处成像,只有焦平面上的点同时聚焦于探测点和照明点,即共聚焦。
以激光做光源并对样品进行扫描,在此过程中两次聚焦,因此称为共聚焦激光扫描显微镜。
2 主要优点 . 提高了敏感性及分辨率使用荧光素交联的抗体来测定细胞内的某些特异性参数在生物医学研究中已基本普及应用,但常常受到不在同一焦平面上的荧光干扰,而造成本底较高、组织结构细节不易分辨清楚。
CLSM的分辨率高于普通光镜,同时CLSM将高敏感性的光电倍增管合为一体,并应用数字滤过功能, 使信噪比最佳化,尽可能地排除了焦点以外的荧光干扰。
激光共聚焦显微镜的原理和应用讲解
激光共聚焦显微镜的原理和应用李楠王黎明杨军关键词激光; 显微镜; 原理和作用中国图书资料分类法分类号R 318. 51激光共聚焦显微镜是80年代发展起来的一项划时代意义的高科技新产品, 它是在荧光显微镜成像基础上加装了激光扫描装置, 利用计算机进行图象处理, 使用紫外或可见光激发荧光探针, 从而得到细胞或组织内部微细结构的荧光图象, 在亚细胞水平上观察诸如Ca 2+、pH 值, , 成为形态学, , , 学, 1994, 了目前世界次最高, 功能最全的美国M eridian 公司的产品:A cas 系列U lti m a 型和扫描速度最快的In sigh t 型两台激光共聚焦仪。
仪器自1995年5月份到货安装以来, 已为我院7个科室的10个课题所应用, 目前主要开展的研究内容有:(1 细胞内游离钙的实时监测; (2 细胞通讯的研究; (3 细胞形态学的研究。
1基本原理和功能1. 1基本原理传统的光学显微镜使用的是场光源, 标本上每一点的图象都会受到邻近点的衍射光或散射光的干扰; 激光共聚焦显微镜利用激光束经照明针孔形成点光源对标本内焦平面上的每一点扫描, 标本上的被照射点, 在探测针孔处成像, 由探测针孔后的光电倍增管(PM T 或冷电耦器件(cCCD 逐点或逐线接收, 迅速在计算机监视器屏幕上形成荧光图象。
照明针孔与探测针孔相对于物镜焦平面是共轭作者单位解放军总医院实验仪器中心, 北京100853的, 焦平面上的点同时聚焦于照明针孔和发射针孔, 焦平面以外的点不会在探测针孔处成像, 这样得到的共聚焦图象是标本的光学横断面, 克服了普通显微镜图象模糊的缺点。
在显微镜的载物台上加一个微量步进马达, 可使载物台上下步进移动, 最小步进距离为的0. 1Λm , 能清楚地显示, 实现了的目的, 这就是21. . CT ”功能通过狭缝扫描技术将我们对细胞的研究由多层迭加影像推进到真正的平面影像水平, 使图像更加清晰, 从而为分子细胞生物学的深入研究拓宽了视野。
激光扫描共聚焦显微镜的基本原理及其使用技巧
的非 线 性 关 系 和 激 光 扫 描 器 的 拉 曼 光 谱 学 。 １ ９ ７ ８年 ， Ｂ ｒ ａ ｎ ｋ ｅ ｎ ｈ ｏ ｆ 等发 明 了一种 有 着较 高数 值 孔 径 的透 镜 ， 并将 这种 高 数 值 孑 Ｌ 径 的 透镜 应 用 在 激 光 共 聚焦 显 微 镜 上 。 １ ９ ８ ７年 ， Ｗｈ ｉ ｔ ｅ等 用 免 疫荧 光
文章编号 ： １ ０ ０ ０ — ６ ２ ８ １ （ ２ ０ １ ５ ） ０ ２ － ０ １ ６ ９ － ０ ８
激 光 扫 描 共 聚 焦 显 微 镜 的基 本 原理 及 其使 用技 巧
李 叶 ，黄 华 平 ，林 培 群 ，崔 艳 梅 ， 李 勤奋 ，郑 勇奇
（ １ ．中国热 带农 业 科 学院环 境 与植物 保 护研 究所 ， 海南 海１ ： ７ ５ ７ １ １ ０ １ ； ２ ．农 业部 热 带农林 有 害 生物入侵 监 测 与控 制 重 点开放 实验 室 ， 海南 儋州 ５ ７ １ ７ ３ ７
源 自尼普科 夫 盘 的发 明和 拉 曼 光谱 学 理 论 的建 立 。 但 由于尼普 科夫 盘 在 设 计 中技 术 尚不 成 熟 ， 在 实 际 的应用 中有 着较 大 的缺 陷［ ６ ３ 。１ ９ ７ ７年 ， Ｗｉ ｌ ｓ ｏ ｎ在 前 人 研究 的基 础上 ， 结 合 构 成 共 聚 焦成 像 的几 何 学 的
标 记法 使得 胚胎 的大 分子 物 质成 功 显 示 ， 这 标 志 着 Ｌ Ｓ Ｃ Ｍ 已经成 为进 行科 学研 究 的重要 工具 。
如 何判 断所 采 集 的图像 是 否理想 等 问题 。所 以对 初 学者 ， 要通 过一 段 时 间 的训 练 才 能 熟 练 进 行 共 聚 焦 图像 的采集 。本文 希望 通 过介绍 Ｌ Ｓ Ｃ Ｍ 的 成像 原 理 及优 点 ， 并 以花 粉 为例 ， 探讨 激光 共 聚焦 扫描 显微 镜 的使用 技 巧 ， 以期 为更 多 的科 技 人 员 开 展 相 关 研 究
LSM780双光子激光共聚焦显微镜技术参数
LSM780双光子激光共聚焦显微镜技术参数LSM780双光子激光共聚焦显微镜是一种基于双光子荧光共聚焦显微镜技术的高性能显微镜，具有高分辨率、深入组织的成像能力，能够提供关于三维结构和功能的细胞和组织的详细信息。
下面将详细介绍LSM780双光子激光共聚焦显微镜的技术参数。
1. 激光系统：LSM780双光子激光共聚焦显微镜通常配备两个紫外激光器，能够提供两个不同波长的激光，通常为800nm和1040nm。
这些激光器可以分别或同时使用，以适应不同的样品和实验需求。
2.激光功率：LSM780双光子激光共聚焦显微镜的激光功率通常在几十至上百毫瓦之间。
激光功率的选择取决于样品的特性和实验需求，功率越高，进一步成像的深度越大，但也会增加样品的破坏风险。
3.探测系统：LSM780双光子激光共聚焦显微镜的探测系统包括一个探测单元、一个光学滤光片轮和一个光电倍增管（PMT）。
探测单元通常包含两个探测器，可用于收集荧光信号和二次非线性光学信号，以获得不同的成像信息。
4.透射探测：LSM780双光子激光共聚焦显微镜还可配备透射探测系统，用于监测透过样品的激光强度，以实现更精确的深度控制和真实的三维成像。
5.XY扫描系统：LSM780双光子激光共聚焦显微镜的扫描系统通过使用高速扫描镜和电子扫描控制器来实现XY扫描，以获取二维图像。
扫描速度和分辨率可以通过调整激光功率和扫描模式进行优化。
6.Z轴扫描系统：LSM780双光子激光共聚焦显微镜的Z轴扫描系统通常由一个压电陶瓷驱动器和一个扫描镜组成，可以实现在样品的Z轴方向上进行成像，从而获得三维图像。
7. 图像处理软件：LSM780双光子激光共聚焦显微镜通常使用配套的图像处理软件，如Zeiss ZEN软件，用于图像采集、分析和处理。
该软件提供了多种功能，包括多通道成像、3D成像和图像重建等。
总之，LSM780双光子激光共聚焦显微镜具有先进的激光系统、灵活的样品探测系统、高速和高精度的扫描系统以及强大的图像处理软件等技术参数，为研究者提供了一种高分辨率、高亮度和无损伤成像的显微技术工具。
激光扫描共聚焦显微镜使用说明
激光扫描共聚焦显微镜使用说明标签：激光扫描共聚焦显微镜使用说明激光扫描共聚焦显微镜可以：（1）光切片扫描、3D图像处理、时间序列拍摄成像；（2）细胞、绿荧光蛋白、生物荧光样品观察分析；（3）荧光原位杂交分析。
详细实验方法共聚焦显微镜激光扫描法实验方法原理激光共聚焦扫描显微镜（Confocal laser scanning microscope，CLSM）用激光作扫描光源，逐点、逐行、逐面快速扫描成像，扫描的激光与荧光收集共用一个物镜，物镜的焦点即扫描激光的聚焦点，也是瞬时成像的物点。
由于激光束的波长较短，光束很细，所以共焦激光扫描显微镜有较高的分辨力，大约是普通光学显微镜的3倍。
系统经一次调焦，扫描限制在样品的一个平面内。
调焦深度不一样时，就可以获得样品不同深度层次的图像，这些图像信息都储于计算机内，通过计算机分析和模拟，就能显示细胞样品的立体结构。
实验材料细胞试剂、试剂盒荧光染料水培养基仪器、耗材激光扫描共聚焦显微镜载玻片洗瓶滴管试管实验步骤一、观察及仪器操作1. 开启仪器电源及光源一般先开启显微镜和激光器，再启动计算机，然后启动操作软件，设置荧光样品的激发光波长，选择相应的滤光镜组块。
以便光电倍增管(photo multiplier tube，PMT)检测器能得到足够的信号结果。
使用汞灯的注意事项同普通荧光显微镜。
2. 设置相应的扫描方式在目视模式下．调整所用物镜放大倍数，在荧光显微镜下找到需要检测的细胞。
切换到扫描模式，调整双孔针和激光强度参数，即可得到清晰的共聚焦图像。
3. 获取图像选择合适的图像分辨率，将样品完整扫描后，保存图像结果即可。
4. 关闭仪器仪器测定样品结束后，先关闭激光器部分，计算机仍可继续进行图像和数据处理。
若要退出整个激光扫描共聚焦显微镜系统．则应该在激光器关闭后，待其冷却至少10分钟后再关闭计算机及总开关。
二、获取三维图像激光扫描共聚焦显微镜具有细胞“CT”功能，因此，它可以在不损伤细胞的情况下，获得一系列光学切片图像。
激光共聚焦显微镜原理和应用
激光共聚焦显微镜原理和应用共聚焦显微镜的发展历史1955年，Marvin Minsky利用共焦原理搭建了一台共焦显微镜，用来在体观察大脑的神经元网络。
1957年，Marvin Minsky申请了共聚焦显微镜的专利。
1970年，第一台单光束共聚焦激光扫描显微镜问世。
1985年，多个实验室的多篇报道显示共聚焦显微镜可以消除焦点模糊，得到非常清晰的图像。
1987年，BIO-RAD公司推出了第一台商业化的共聚焦显微镜。
共聚焦显微镜最大的优点就是可以只检测一个聚焦平面的信号。
样品聚焦平面和检测器（光电倍增管）之前均有一个针孔，针孔的设置可以有效地滤除非聚焦平面的信号，增加显微镜的信噪比。
激光扫描显微镜能够逐点和诸行对样品进行扫描，最终根据象素信息形成一个高对比度和高分辨率的图像。
通过逐层对样品扫描并把每一层的图像组合成一个整体，激光扫描显微镜能够对样品进行三维分析，非常适合于超厚样品的检测。
传统显微镜是一次性照明整个视野中的样品，因此可以用眼睛直接观察或者用CCD获取图像，没有时间延迟；而共聚焦显微镜是逐点成像，无法用眼睛成像，也无法用CCD获取图像，只能用探测器收集每个象素点的信号，再通过软件重构图象，有一定的时间延迟。
How a Confocal Image is FormedCondenser Lens Pinhole 1Pinhole 2Objective LensSpecimen DetectorWide Microscopy and Confocal MicoscopyWide Field Confocal Field Wide Field Confocal FieldConfocal PrincipleTransmitted Light White Light Source630 nm BandPass Filter620 -640 nm LightTransmitted LightLight Source520 nm Long Pass Filter>520 nm LightTransmitted Light Light Source575 nm Short Pass Filter<575 nm Light Standard Short Pass FiltersOptical Filters Dichroic Filter/Mirror at 45 degReflected light Transmitted LightLight Source510 LP dichroic Mirror生命科学院的激光共聚焦显微镜Beam Path of Zeiss CLSM 510 METAThe unique scanning module is thecore of the LSM 510 META. It containsmotorized collimators, scanning mirrors,individually adjustable and positionablepinholes, and highly sensitive detectorsincluding the META detector. All thesecomponents are arranged to ensureoptimum specimen illumination andefficient collection of reflected oremitted light. A highly efficient opticalgrating provides an innovative way ofseparating the fluorescence emissions inthe META detector. The gratingprojects the entire fluorescencespectrum onto the 32 channels of theMETA detector. Thus, the spectralsignature is acquired for each pixel ofthe scanned image and subsequently canbe used for the digital separation intocomponent dyes.Focus ConeSpecimen X/Y ImageXYTo get an 2 D image, the excitation spot has to be moved over the specimen3 D information is acquired by moving the excitation focus not only in XY direction but also in Z direction. The result is a 3 D data stack consisting of number of XY images representing different optical sections from the specimenX/Y/Z StackZ-Driveoptical slice共聚焦显微镜的三维信息采集zxy# z sections =#imagesA confocal data set is similar to a book. A book has many pages, and Each page shows information only available if you move down to that page and ready it. Reading a page in a book, is just like scanning with a confocal microscope –you remove all of the other pages!z xy zyy The advantage of confocal microscopy is that you can visualize frames from a 3D object even in planes that you don’t image directly. This is called “slicing” an object and is an important component of confocal imaging.三维数据重构建荧光共振能量转移荧光共振能量转移（Fluorescence Resonance Energy Transfer，FRET）作为一种高效的光学“分子标尺”，在生物大分子相互作用、免疫分析、核酸检测等方面有广泛的应用。
激光扫描共聚焦显微镜操作说明书
激光扫描共聚焦显微镜操作说明书操作说明书激光扫描共聚焦显微镜是一种高端的显微镜设备，具有高分辨率、高灵敏度的特点，广泛用于生物学、医学、材料科学等领域。
为了正确且有效地操作激光扫描共聚焦显微镜，本操作说明书将为您提供详细的指导。
一、设备介绍激光扫描共聚焦显微镜由以下主要部分组成：1. 显微镜主体：负责接收样本的光信号，并进行扫描成像。
2. 激光系统：提供高能量、高稳定性的激光光源，用于激发样本的荧光信号。
3. 探测系统：用于接收样本的荧光信号，并将其转化为图像信号。
4. 控制系统：提供对显微镜参数进行调节和设置的功能。
二、注意事项在操作激光扫描共聚焦显微镜之前，请确保您已熟悉以下注意事项：1. 安全操作：激光光源具有较强的激光辐射，请佩戴适当的激光防护眼镜并避免直接暴露于激光光束下。
2. 样本准备：样本应事先处理好并放置在适当的载玻片上，确保样本表面平整，避免气泡或杂质的干扰。
3. 导入样本：轻轻将载玻片插入显微镜主体的样本台中，并用调节旋钮精确定位样本。
4. 参数设置：根据实验需要，设置合适的激光功率、放大倍数和扫描速度等参数，确保获得清晰的图像。
5. 镜头清洁：定期清洁显微镜镜片，避免灰尘或污渍影响成像质量。
注意使用专用的镜头清洁纸和清洁液。
三、操作步骤基于激光扫描共聚焦显微镜的特点，以下为一般操作步骤的指导：1. 打开设备电源，等待设备启动并进行自检。
2. 调节放大倍数：通过显微镜主体上的放大调节旋钮，调节适当的放大倍数，以便观察到合适大小的图像。
3. 确定激光功率：在控制系统中，设置合适的激光功率以激发样本的荧光信号，避免过高的功率导致样本损伤。
4. 调整扫描速度：通过控制系统中的扫描速度调节器，设置合适的扫描速度，以获得清晰且稳定的图像。
5. 对焦样本：使用显微镜主体上的对焦调节旋钮，将样本调焦至最清晰状态。
6. 开始扫描：通过控制系统中的扫描启动按钮，启动扫描功能，并观察图像显示区域是否居中和清晰。
激光扫描共聚焦显微镜实验技术与应用_韩卓
科技信息2009年第19期SCIENCE&TECHNOLOGY INFORMATION随着科学技术的发展，实验技术已经成为实现实验目的的重要手段，对实验技术的了解和掌握是科技工作者应具备的技能。
激光扫描共聚焦显微镜（Laser scanning confocal microscope）是20世纪80年代中期发展起来并得到广泛应用的新技术[1]，它是激光、电子摄像和计算机图像处理等现代高科技手段渗透，并与传统的光学显微镜结合产生的先进的细胞分子生物学分析仪器，在生物及医学等领域的应用越来越广泛，已经成为生物医学实验研究的必备工具[2]。
在传统光学显微镜基础上，激光扫描共聚焦显微镜用激光作为光源，采用共扼聚焦原理和装置，并利用计算机对所观察的对象进行数字图像处理观察、分析和输出。
其特点是可以对样品进行断层扫描和成像，进行无损伤观察和分析细胞的三维空间结构[3]。
同时，利用免疫荧光标记和离子荧光标记探针，该技术不仅可观察固定的细胞、组织切片,还可以对活细胞的结构、分子、离子及生命活动进行实时动态观察和检测,在亚细胞水平上观察诸如Ca2+,pH值,膜电位等生理信号及细胞形态的变化,成为形态学、分子细胞生物学、神经科学、药理学、遗传学等领域中新一代强有力的研究工具[4]，极大地丰富了人们对细胞生命现象的认识。
1.激光扫描共聚焦显微镜的原理在普通宽视野光学显微镜中，整个标本全部都被水银弧光灯或氙灯的光线照明，图像可以用肉眼直接观察[5]。
同时，来自焦点以外的其他区域的荧光对结构的干扰较大，尤其是标本的厚度在2um以上时，其影响更为明显。
图1激光扫描共聚焦显微镜光路图激光共聚焦显微镜脱离了传统光学显微镜的场光源和局部平面成像模式，采用激光束作光源，激光束经照明针孔，经由分光镜反射至物镜，并聚焦于样品上，对标本焦平面上每一点进行扫描。
组织样品中如果有可被激发的荧光物质，受到激发后发出的荧光经原来入射光路直接反向回到分光镜，通过探测针孔时先聚焦，聚焦后的光被光电倍增管（PMT）探测收集，并将信号输送到计算机，处理后在计算机显示器上显示图像[6]。
激光扫描共聚焦显微镜的原理和应用
显微镜设置： “Ocular”——> “Light Path”——> 点击物镜图标，选择物镜——> 样品聚焦。
透射光控制（Transmitted Light Control） 反射光光闸控制（Reflected Light Shutter）
荧光激发块选择（Reflector）
共聚焦LSM 扫描设置 点击“LSM”（ZEN软件界面右上角），系 统切换至共聚焦扫描光路：
（2）进—初始化整个系统， 用于激光扫描取图、分析等。 “Image Processing”——不启动共聚焦扫描硬件， 用于已存图像数据的处理、分析。
（3）软件界面：
1 功能界面切换：扫描取图（Acquisition）、图像处理（Processing）、维护（Maintain）（注：Maintain仅供
光路设置：
选取“荧光探针”、“颜色”、扫描方法， 应用“Apply”。（注：Fastest 为最快速扫描， 多条激光谱线同时扫描。 Best signal 为最佳信号扫描，多条激光谱线顺 序扫描。 Best compromise 为兼顾速度与信号的折 中式扫描。）
扫描图像参数设置：
每个通道的精细调节： 包括： （1）Pinhole的调节（一般设为1AU。该值越大，则信号越强，但共聚焦图像 效果会降低。原则上，在保证图像质量的前提下，该值越接近于1AU 越好）； （2）Master Gain的调节（增大则信号和噪音都增强，减小则信号和噪音均减 小。原则上，在保证图像质量的前提下，Gain值越小越好）； （3）Digital Offset的调节（可扣除背景噪音，但标本信号也有一定程度的扣 除。原则上，在保证图像质量的前提下，Digital Offset值越接近于0越好）； （4）Digital Gain的调节（增大则信号和噪音都增强，减小则信号和噪音均减
双光子荧光寿命成像激光共聚焦扫描显微镜
院系：生命科学联合中心
仪器 编号 制造商 国别 经费 来源 责任 教授
201214339 德国 科研专款 或基金 程和平
所属ห้องสมุดไป่ตู้实验室 制造 厂商 单价 存放 地点
北京大学生命科学联合中心 蔡司 402.82万元 型号 购置 日期 LSM 710 NLOFLIM 2012年11月
程和平 否 程和平 服务 对象 电子 邮件 — chengp@ 收费 标准 联系 电话 62765957 — 开放 时间 —
608
双光子荧光寿命成像激光共聚焦扫描显微镜
主要研 究方向 在研 或曾 承担 重大 项目 奖项 专利 人才 培养 相 关 科 研 信 息 学 术 论 文
线粒体超氧炫、钙离子活动的机制和生理功能，活细胞内CaMKII酶活性和ATP浓度成像
国家基础研究项目（“973计划”）
— 博士生4人，硕士生2人
—
知名 用户 共 享 信 息 备 注 是否对 外开放 联系人
英杰交流中心335E
基 本 信 息
技术指 标及功 能简介
红外飞秒激光，可见激光， 34 通道光谱检测系统， 10 种染料可用同一时间精确区分，电动显微镜， FLIM荧光寿命成像系统。细胞自身荧光寿命分析， 自身荧光对于标记荧光的有效区分活细胞钙离子浓 度测量,共振能量转移，局部氧气浓度测量。 光谱范围 350nm-1100nm ；覆盖近紫外、可见光、 近红外波段。其光谱分辨率 3nm ，采用 x 、 y 轴独立 双镜扫描；Coherent- Chameleon Vision II红外飞秒 脉冲激光器，波长范围：680-1080nm，包含色散补 偿功能；双光子显微镜提供反射和透射的 NDD 通 道；32通道可见光光谱成像；TCSPC设备时间通道 宽度最小可达813fs，荧光寿命图像最高分辨率可达 8192×8192。
双光子显微成像技术的研究和应用
双光子显微成像技术的研究和应用双光子显微成像技术是一种近年来广受关注的微纳米成像技术。
它基于非线性光学，通过将两个低能量的光子同时照射到样品中心，使其达到能量吸收条件而引发荧光信号，从而获得高分辨率的三维成像。
该技术在生物学、医学等领域有着广泛的应用，具有成像深度较大、对组织损伤小等优点。
本文将对双光子显微成像技术的研究和应用进行介绍。
一、技术原理首先，我们来了解一下该技术的原理。
单个光子具有很小的能量，在常规光学成像中，需要大量光子的积累作用才能够获得明显的荧光信号。
但是，由于组织中存在的散射和吸收，使用传统的单光子成像技术时，很难同时获得高空间和时间分辨率的三维成像。
相比之下，双光子显微成像技术具有成像深度较大、分辨率较高等优点。
它使用的是两个低能量的光子同时照射样品，这些光子的波长通常在700nm到1000nm的范围内。
此时，两个光子同时穿过样品时，它们会激发在硅基底或其它二次谐波晶体中非线性荧光材料的激发态，从而产生可检测的荧光信号。
简单来说，双光子显微成像技术利用的是非线性光学效应，使得能量密集在样品的中央，荧光信号可以高效地产生。
同时，这种产生荧光信号的方式也减小了和组织的相互作用，使得该技术成为了生物和医学领域中一种非常有用的成像技术。
二、应用领域由于双光子显微成像技术具有较高的空间分辨率和成像深度，因此它被广泛应用于生物医学、神经科学、材料科学等领域。
以下是其中的一些应用。
1. 生物医学在生物医学中，双光子显微成像技术已经被广泛应用于研究神经元和其他细胞的结构和功能。
例如，该技术可以实现对活体细胞内钙稳态、骨髓造血干细胞、心肌细胞和肝脏细胞的研究和诊断。
2. 神经科学在神经科学中，双光子显微成像技术被用于研究神经元的结构和功能。
该技术可以实现对脑皮质、海马齿状回、小脑、杏仁核等特定部位的神经元成像，以及对神经元之间的相互作用的研究。
由于该技术的成像深度较大，可以不需要局部解剖治疗，因此被认为是治疗神经系统疾病的一种重要手段。
扫描共聚焦显微镜原理及应用
随着科学技术的不断进步及发展，共焦显微镜发展至今又产生了新的类型，如针孔阵 列盘式激光共聚焦显微镜和双光子共聚焦显微镜。双光子激光扫描显微镜采用的是双光 子激发，对材料的光损失较小,在厚材料中容易绕过障碍，对生物组织的穿力强，为活 细胞组织长时间的观察提供了可能，但获得的荧光量较低，成像质量也不好，分辨力比 激光扫描共聚焦显微镜低，需要我们不断地去改进和研发。
LSCM 通过在激光整合器后部引入声光调制滤光片系统，可同时分别控制各个波段激光的照射强度 或 者同一波段激光在任意时间的照射强度。因此，可对图像上特定的区域进行扫描成像 。
检测过程快、效果更灵敏、定位更准确
LSCM 由于利用光源光束点扫描，检测过程快，时间短，计算机精确控制激发光强度，光漂白和荧 光淬灭作用很小。可将很微弱的荧光信号放，只要有信号 就能被检测到。不仅可以定位到细胞水 平,还可以定位到亚细胞水平和分子水平。
原理及结构
LSCM
光学成像系 统
扫描系统
计算机系统
激光器
显微成像系统
激发滤光片
扫描控制器
计算机
Z轴 X-Y调节 共聚焦针孔 光电倍增管 激光强度
存储 显示 三维构建 数据分析
LSCM 基本结构
LSCM 是在传统的光学显微镜 基础上加装了激光扫描装置， 利用激光扫描束通过针孔形成 点光源，在焦平面上逐点扫描 ，采集点的光信号通过探测针 孔聚集后，被光电倍增管( PMT) 探测收集,经过信号处理 ，输出到计算机上成像。
种子的激光共聚焦连续光学切片和三维重建图。
LSCM 的优势 可光学切片、三维重建
LSCM
可以将这些连续的光学切片扫描图,通过 LSCM 软件进行三维重建,得到其三维立体结构，从而能十分灵活 、直观地进行形态学观 察 ,并揭示亚细胞结构的空间关系 。种子的三维多视角旋转图中，不仅能看出种子侧面的形状和结构,还增加了三维的观赏性 。
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转基因材料的快速筛选
原则：密集预排列待测样
技巧：lambda扫描
色彩判别
荧光峰形检查
GFP蓝绿特征色
GFP台阶形特征峰
518
540
土壤浸出液中外源GFP标记细菌浓度分析
目的：了解土壤中的不同细菌间的竞争关系 方法：等比掺入外源GFP标记菌体，设置多种 环境条件 问题：土壤标本背景嘈杂，往往带有各种带荧 光的杂质颗粒 解决： 1 固定样品体积
Ex 1000
300 250 200 150 100 50 0
498
利用不同波长的双光子激光照 射可能含碳纳米管的靶向药 物，lambda扫描发现荧光信号 呈现严格的倍频关系
Ex 1040
250 200 150 100 50 0
421 440 459 479 498 518 537 556 576 595 615 634 654 673 692 712
421 440 459 479 498 518 537 556 576 595 615 634 654 673 692 712
ex 1040nm
518
光刻和深度扫描
一种人工合成的透明有机晶体， 在一定强度的近紫外光下会发生 局部变性，从而具有双光子效应 在2个不同Z坐标下做bleach， ex 458nm ex 900nm 做z-stack，显示多层光 刻效果，信号随深度增加而衰减
双光子和光谱扫描在激光共聚焦显微 镜上的应用经验
浙江大学生命科学学院 仪器与技术服务平台
机型：Zeiss LSM710 nlo
690-1080nm可调谐飞秒激光器 32通道阵列PMT
激光共聚焦显微镜的非常规应用
• • • • • • • 利用双光子分辨目标荧光和自发荧光 利用光谱扫描鉴定微弱荧光信号的真假 转基因材料快速筛选 嘈杂背景下的细胞计数 非线性效应 光刻和深度扫描 模拟近红外光源
GFP标记水稻根中自发荧光的清除
单光子激发，水稻根带有强烈的黄绿色 自发荧光
ex 488nm，Lambda mode 双光子激发，自发荧光为蓝色 ex 820nm , lambda mode
GFP标记水稻根中自发荧光的清除
• 双光子激发下GFP荧光与自发荧光 的波长分离，820nm激发时，仅采 集493-542nm区间的信号以保证特 异性 Ex 820nm, channel mode
微弱或自发荧光存在下的信号鉴定
Promoter::GFP载体注射烟草叶转GFP弱表达 镜下目视特征：
转GFP不表达 光谱特征：
绿色信号被强烈红光掩盖 GFP： GFP和RFP弱时无法分辨 主发射峰位于约518nm 副发射峰位于约540nm Lambda合成图特征： 后者高度约为前者的一半 呈台阶形 GFP：绿色偏蓝 自发荧光： 自发荧光：绿色偏黄 在560nm左右对称分布 叶绿素荧光：红色 叶绿素荧光： 625nm以上强烈信号
叶表面蜡质层成像及厚度测定
菲（多环芳烃类）渗透 Ex 700nm Channel mode Z-stack
谢谢大家
2 lambda成像检测GFP特异荧光
3 最大化pinhole
非线性效应：碳纳米管
Ex 850
原理：某些材料在双光子 激发，会发射波长为激发 光一半的荧光
100 80 60 40 20 0
421
ex 850nm
394 440 469 498 527 556 586 615 644 673 702
ex 1000nm