植物组织与细胞培养

在通常状态下，Ri质粒上Vir区的基因处于抑制 状态，当发根农杆菌感染寄主植物时，受损伤 的植物细胞合成的低分子苯酚化合物乙酰丁香 酮使Vir区处于抑制状态的基因被激活，产生一 系列限制性核酸内切酶，在酶的切割作用下产 生T-DNA链，T-DNA进入植物细胞核内，整合进 植物细胞的基因组。其整合和表达的结果导致 了大量毛状根的产生。 T-DNA上有生长素合成基因tms 1和tms 2，指导 IAA(吲哚乙酸)的合成，因此转化产生的毛状根 ，在培养时不需要添加外源生长激素，为激素 自养型。
第三章 植物组织与器官培养
本章内容
第一节 植物组织培养 第二节 植物胚胎培养 第三节 毛状根培养 第四节 人工种子 第五节 植物脱毒
本节课主要内容 1.毛状根培养制备次级代谢产物 2.人工种子的制备 本节课关键问题 1.毛状根的诱导机制与方法、应用， 2.人工种子的制备
第三节 毛状根培养
一、毛状根培养生产次级代谢产物
第四节 人工种子
一、 人工种子概念与发展状况 二、 人工种子制作 三、 人工种子储存 四、 人工种子优点及存在问题
一、人工种子概念与发展状况
• 人工种子（ Artificial seed）：又称合成种子
(Synthetic seed)或体细胞种子(Somatic seed)，是指 将植物离体培养中产生的胚状体或芽包裹在含有养 分和保护功能的人工胚乳(Artificial endosperm)和人 工种皮(Artificial seed coat)中形成的类似种子的颗
2.毛状根诱导方法 （1）外植体接种法
取植物的叶片、茎段、叶柄等无菌外植体， 与发根农杆菌共同培养2～3天，将植物的外 植体移到含有抗生素的选择培养基上进行培 养，经过多次继代培养，转化的植物细胞产 生愈伤组织，并可产生毛状根。
（2）茎杆接种法 无菌植株生长到一定时候，将植株的茎尖、叶片 切去，剩下茎杆和根部，在茎杆上划出伤口，将 带Ri质粒的发根农杆菌接种在伤口处和茎的顶部 切口处，经过一段时间培养，在接种部位产生毛 状根。
毛状根分化程度高，产生次级代谢产物能力强， 合成较为稳定，能大量合成某些悬浮培养的细胞 不能或者很少合成的次级代谢产物。 通过T-DNA改造，易于采用基因工程途径提高次级 代谢产物产量。
4.毛状根在药用次生代谢产物中的应用
毛状根应用于药用植物次生代谢产物的生产已有 近30年的历史。 黄酮类(flavonoids)：付春祥等的研究表明。来 源于新疆雪莲根段外植体的毛状根系。其20d的 生长速率可达到鲜重接种量的24倍。其中黄酮含 量是野生雪莲根的8.6倍，是野生雪莲叶片的2.9 倍。
1.毛状根诱导
发根农杆菌 (Agrobacterium rhizogenes)是一种革兰氏阴性菌，能 侵染大多数的双子叶植物、少数单子叶 植物及个别的裸子植物，诱发被感染植 物的受伤部位长出毛状根。 发根农杆菌具有致根性，是因为它具有 能诱导毛状根产生的Ri(Root inducing)质粒（约250kb的Biblioteka Baidu质粒） ）, 是位于发根农杆菌染色体之外的独立的 双链环状DNA。具有2个主要的功能区： T-DNA区(Transferred DNA region， 转移区)和Vir区(Virulanee region， 致病区)。
皂苷类(saponins)：对人参的研究表明：以无菌 苗带叶幼茎为外植体诱导的毛状根中人参总皂苷 含量为2.486％(干重)。高于原药材总皂苷含量 1.403％(干重)。 苯丙素类(类(phenyIpropanoids)：雪莲毛状根中丁 香苷和高车前素的含量分别约是野生植株的40倍 和3倍。 萜类(terpenoids)：对短叶红豆杉的研究表明： 以无菌苗的芽为外植体可诱导出毛状根。毛状根 中紫杉醇的含量为愈伤组织的1 3--88.00倍。
传统反应器改造
在搅拌式反应器中用丝网把毛状根与叶轮隔开， 避免了叶轮剪切力的影响。 在鼓泡塔反应器中增加大量的喷头，提高了充 氧效率。
新型反应器设计:超声雾化反应器
1 生物反应器 2 中心筒 3 不锈钢筛网 4 空气出口 5 时间继电器 6 雾化头 7 培养液 8 空气入口 9 空气过滤器 10 流量计 11 电磁阀 12 空气储罐 13 雾化装置 14 40W 日光灯
一些植物的次级代谢产物在根里大量合成 ，但是正常根的培养非常困难，生长缓慢 ，收获困难。
毛状根(hairy roots)是发根农杆菌（ Agrobacterium rhizogenes）感染双子叶 植物后，形成的类似头发一样的根组织。 许多植物的毛状根在离体培养条件下表现 出次生代谢产物的合成能力，产物产量较 正常植物及悬浮培养细胞的要高。
（3）原生质体—农杆菌共培养法 将原生质体培养3-5天后，加入带Ri质粒的发根农 杆菌进行共培养，然后借助于转化后的细胞激素 自养型特性或T-DNA上的抗菌素标记筛选出转化成 功的细胞。 分裂形成愈伤组织，在无激素培养基上可产生毛 状根。
3.毛状根培养优点
由Ri质粒转化的毛状根生长快、激素自养型、生 长周期短，在培养时不需要添加外源激素，易于 培养。
生物碱类(alkaloids)：孙敏等以长春花 (Catharanthus roseus)无菌苗叶片为外植体诱导 毛状根，其中长春碱含量是原植物根和叶中含量 的27.4倍和23.5倍。长春新碱的含量是原植物根 是23.55倍。 蒽醌类(anthraquinones):对何首乌(Polygonium multiflorum Thunb)的研究表明：以再生植株的 叶柄、茎段和叶片为外植体可诱导毛状根，毛状 根中大黄酸的含量为2.49μg/L(干重)。是无菌幼 苗的2.85倍。
5.毛状根培养的生物反应器
毛状根外型像毛发，容易交织缠绕。毛状根的 特点决定了用于毛状根培养的生物反应器需要 特殊设计。 例如：反应器的内部需要特殊设计满足毛状根 的空间分布的均匀性问题。同时，也要提供合 适的培养液循环与气体供给方式才能满足毛状 根对营养和气体的需求，还要考虑接种、取样 、收获、生物量检测等特殊问题。