植物组织与细胞培养
植物细胞培养的基本概念
植物细胞培养的定义----植物组织和细胞培养 是指在无菌条件、人工控制的营养和培养基、 人工控制的环境条件如光照、温度下，研究植 物的细胞、组织、器官，以及控制其生长发育 的技术。
植物细胞培养概况
1、可供培养的植物种类 （1）到目前为止，有研究显示，近300种植物的
细胞培养物能够产生400多种有效的药用成份。 （2）许多药用植物如人参、长春花、紫草、甘草、
（7）培养过程具有结构、功能上的全能性。
（11）突变体---细胞本身由于变异、或者是通过 应用诱变技术进行处理，所获得的遗传变异性新 细胞，称为突变体。
（12）原代培养和继代培养---由外植体上切下 来的组织细胞的第一代培养称为“原代培养”、 从此以后的多代培养则称为“继代培养”
（13）连续培养---是指在培养罐中不断地加入 新的培养基、并且连续收集培养物，以保持反 应平衡而进行的长期不转移的培养方式。
素细胞壁。 （2）培养过程生长速度缓慢，易受微生物污染、
需要用抗生素。 （3）在细胞生长的中期和对数期，容易凝聚成
直径达350-400um的团块，悬浮培养比较困难。
（4）培养时需要供氧，培养液粘度较大，不能 耐受强力通风搅拌。
（5）细胞具有群体效应、无锚地依赖性和接触 抑制性。
（6）细胞培养产物多数滞留于细胞内，产量较 低。
紫杉、银杏、黄连等，其细胞培养十分成功。 （3）据初步统计，有约30种化合物在培养细胞中
的含量已经超过1%，如紫草素的含量可达12%、 小檗碱的含量可达1%，人参皂苷可达7%。
2、目前现存的问题 （1）技术工艺还不够成熟。 （2）提高单位培养基中有效物质的产量 （3）降低目的产物的生产成本 （4）改进培养条件 （5）筛选高产细胞株 （6）研制适合于植物细胞培养的新型反应器
细胞和组织培养技术在植物育种中的应用
细胞和组织培养技术在植物育种中的应用1 植物育种中的重要性植物育种是通过人工的手段提高植物的遗传品质，以获得更高产、更适应环境的新品种。
在植物育种研究中，细胞和组织培养技术已经成为一种重要的技术手段。
2 细胞和组织培养技术细胞和组织培养技术是通过对植物的组织和细胞进行培养，实现植物育种目标的一种技术方式。
该技术有很多优点，如可以加快植物繁殖的速度，提高植物的遗传品质，并且可以通过对细胞和组织的特定处理来培育出特定的性状和特性的植株。
3 细胞和组织培养技术的应用细胞和组织培养技术在植物育种领域中应用广泛。
例如，可以通过细胞和组织培养技术来实现以下植物育种目标。
3.1 新品种的选育通过细胞和组织培养技术，可以通过选择不同的细胞和组织的特性，实现新品种的选育。
3.2 繁殖控制采用细胞和组织培养技术，可以用于植物的繁殖控制。
例如，可以通过组织培养来实现体细胞的多倍体化，从而增加植物的染色体数目，提高早期杂交的成功率。
3.3 再生和转化再生和转化是细胞和组织培养技术的主要应用之一。
该技术被用于生产快速生长和具有特定性状的植株，从而实现对植物遗传性状和生物合成途径的调控和改善。
4 细胞和组织培养技术的潜在应用除了上述应用之外，细胞和组织培养技术还具有一些潜在的应用前景。
如工程植物通过CRISPR/Cas针对性地修饰植物遗传物质，从而修改植物的基因组。
此外，与传统育种方法相比，细胞和组织培养技术还具有更快的反应速度和更灵活的模拟性，可推动植物育种领域的发展。
5 小结细胞和组织培养技术可以作为一种有力的技术手段，应用于植物育种研究中，包括新品种的选育、繁殖控制和再生与转化等方面。
这些技术在实践中已经得到广泛的应用，并且在未来仍然具有很大的潜力和发展空间。
植物细胞与组织的实验原理
植物细胞与组织的实验原理植物细胞和组织的实验原理涵盖了多个方面，包括细胞结构的观察、组织培养和细胞分离等。
以下是对植物细胞与组织实验原理的详细解释：一、植物细胞结构观察实验原理：1. 细胞质染色观察：通过荧光染料如卡伦登染料或结构染料如甲苯胺蓝B染色剂对细胞膜、细胞质和核等结构进行染色，然后通过荧光显微镜或透射电子显微镜观察和记录。
2. 细胞器观察：通过不同的实验方法，如细胞器标记、免疫荧光染色或电镜观察等，来观察植物细胞中的细胞器，如叶绿体、线粒体、高尔基体、内质网和液泡等。
3. 细胞膜透明化和显微观察：通过染色和脱水技术，将植物细胞膜透明化，然后使用显微镜观察细胞膜的形态结构和细胞器的位置，以了解细胞内部结构的分布情况。
4. 细胞骨架的观察：通过染色和显微镜观察，可以研究植物细胞骨架的组成和结构，如微丝、中间丝和微管等，同时也可以观察细胞骨架在细胞分裂和细胞形态变化中的作用。
二、植物组织培养实验原理：1. 组织培养基的配制：根据植物组织的生长需求，配制含有不同植物激素和养分的培养基，确保组织的生长和分化。
2. 组织的获取和处理：从植物的茎、叶、根等部位获取组织，并通过消毒处理获得无菌组织。
3. 组织培养和细胞分裂：将组织接种在含有培养基的培养皿中，在合适的温度、光照和湿度条件下培养，通过细胞分裂和组织分化来获得较大量的细胞和组织。
4. 细胞分化和组织再生：通过调节培养基中激素的类型和浓度，可以促进细胞分化和组织再生，形成新的植株。
三、植物细胞分离实验原理：1. 细胞溶解：将植物茎、叶、根等组织切碎，使用酶解液或溶解液对细胞进行溶解，以释放细胞内的物质。
2. 细胞筛选：通过离心和过滤等方法，将细胞的碎片和其他细胞组分分离出来，然后使用显微镜或流式细胞仪等设备对特定细胞进行观察和分析。
3. 细胞培养：将分离的细胞接种在含有培养基的培养皿中，促使细胞再次生长和分裂。
4. 细胞检测和分析：通过染色、免疫荧光染色、酶活性测定等方法，对分离的细胞进行检测和分析，以研究细胞的类型、结构和功能。
植物组织培养与细胞培养知识重点
第一个发明的培养基为White 培养基培养基中的铁盐采用Fe-EDTA 形态IAA/CTK比例高时，促进生根培养，比例低时，促进芽的分化植物组织培养：（广义）人工控制条件下培养形成再生植株（狭义）对植物组织器官产生愈伤组织进行培养直至生成完整植株。
外植体：从植物体上分离下来的用于离体培养的材料愈伤组织：在离体培养的条件下切口处形成的一团具有分生能力的不规则的细胞团分化：细胞在分裂过程中发生结构和功能上的改变形成各类组织和器官的过程脱分化：已分化好的细胞在人工诱导条件下恢复分生能力恢复到分生组织状态的过程再分化：由脱分化的细胞重新形成各类组织和器官的过程初代培养：诱导愈伤组织、侧芽或不定芽、胚状体（形似胚，具有配的功能）过程继代培养：更换新鲜培养基繁殖同一类型材料生根培养：将芽苗转移到生根培养基上培养形成完整植株驯化培养：将组培苗经人工炼苗驯化使其能够在苗床上生长器官培养：是指对植物体各种器官的离体培养离体胚培养：指从植物种子中分离出胚组织进行离体培养的技术细胞悬浮培养：将植物的细胞或细胞小聚体悬浮在液体培养基上进行培养，使之在体外繁殖、生长、发育，并在培养过程中能保持很好的分散性的技术原生质体培养：指从细胞中分离出来的原生质体经过离体培养使其分裂、增殖进而分化成完整植株的技术。
器官发生：又名器官形成，是指植物根茎叶花果实等器官的分化与形成灭菌：用物理或化学方法，杀死物体表面或空隙间的微生物消毒：杀死，消除或抑制部分微生物，使之不发生作用褐化：接种后外植体表面产生酚、醌类棕褐色物质，细胞停止代谢生长玻璃化：离体植物嫩茎或叶呈半透明水状，生理失调不能进行光合作用指示植物：能够对病毒汁液产生迅速和特有的反应的某类转株寄主植物细胞的全能性：每个植物细胞都具有母体的全部遗传特性；每一个细胞都可以在特定条件下发育成与母体一样的植株灭菌方法：物理法：灼烧、常压蒸煮，紫外线，超声波，微波，过滤清洗。
化学法：升汞，过氧化氢，甲醛，酒精，高锰酸钾，漂白粉，次氯酸钠，抗菌素四大母液：大量元素母液，微量元素母液、铁盐母液、有机物质母液、激素母液实验室安排：贮藏室、药品室、洗涤间、消毒室、接种室，准备室、暗室、分析室、培养室离体培养基本设备：天平、酸度计、移液管、容量瓶、三角瓶添加活性炭的目的：活性炭具有吸附作用，可吸附非极性物质和色素大分子物质，茎尖初代培养使可防止褐化，促进生根，防止玻璃化苗几种维生素：VB1：有利于植株生根，促进愈伤组织产生VB6：促进根的生长VC：防止褐化VB5：影响植物代谢和胚的发育VE、VB12各培养基的特点：White：无机盐浓度低，适宜于生根培养；MS：无机盐浓度高，为比较稳定的离子平衡溶液，其养分的数量和比例比较合适，可满足植物的营养和生理需要，硝酸盐含量相对较高，广泛应用于植物器官，花药，细胞和原生质体培养，效果良好；B5：含较低的铵对不少培养物的生长有抑制作用。
3.植物细胞培养（植物组织培养）
3.植物细胞培养（植物组织培养）第三章植物细胞培养植物细胞培养：指对从植物器官或由愈伤组织上分离的单细胞（或⼩细胞团）进⾏培养，形成单细胞⽆性系或再⽣植株的技术。
Haberlandt（1902）⾸次尝试分离和培养植物叶⽚单细胞。
细胞培养的意义有利于进⾏细胞⽣理代谢以及各种不同物质对细胞代谢影响的研究。
进⾏细胞培养，通过单细胞的克隆化，即称为“细胞株”（cell line），可以把微⽣物遗传技术⽤于⾼等植物以进⾏农作物的改良。
细胞培养的增殖速度快，适合⼤规模悬浮培养，⽣产⼀些特有的产物，如许多种植物的次⽣代谢产物，包括各种药材的有效成分等，⽤于医药业、酶⼯业及天然⾊素⼯业，这是植物产品⼯业化⽣产的新途径。
由于植物组织培养中细胞之间在遗传和⽣理⽣化上会出现种种变异，这些细胞形成的植株也都表现出⼀定的差异。
这种差异反映在它们的植株的形态、产量、品质、抗病⾍和抗逆性等⽅⾯。
所以由单细胞培养获得的单细胞⽆性繁殖系，并对不同的细胞进⾏研究，在理论上和实践上都有很重要的意义。
细胞培养就是从⾼等植物的某个特定的器官或组织中取得单个细胞进⾏培养，并诱导其分裂增殖，由细胞分裂形成细胞团，再通过细胞分化形成芽根等器官或胚状体，长成完整植株。
第⼀节植物细胞培养⼀. 单细胞培养(⼀)单细胞分离1.机械法2.酶解法3.从愈伤组织中分离(⼆)单细胞的培养⽅法1、平板培养（细胞的⽣长周期）2、看护培养3、微室培养 4. 条件化培养⼆. 细胞悬浮培养（⼀）悬浮培养的⽅法1、分批培养（细胞的⽣长周期）2、半连续培养3、连续培养——封闭型、开放型（化学、浊度恒定式）4、固定化培养（⼆）培养细胞的同步化1. 化学⽅法(饥饿法、抑制法、有丝分裂抑制法）2. 物理⽅法（分选、低温）（三）培养基振荡⼀、单细胞培养（⼀）单细胞的分离1.机械法: Ball(1965)⾸次由花⽣成熟叶⽚利⽤机械的⽅法使叶⾁细胞得到分离的技术。
⑴⼑⽚刮: 取下叶⽚→叶⽚消毒(75%酒精或7%次氯酸钠)→撕去下表⽪(露出叶⾁细胞) →⽤解剖⼑刮下细胞→单细胞悬浮培养⑵研磨离⼼法: 取下叶⽚→叶⽚消毒(75%酒精或7%次氯酸钠) →研磨匀浆(10g叶⽚+40ml研磨介质)→匀浆过滤(细纱布) →离⼼(先低速去碎屑) →游离细胞沉降到底部(净化细胞) →植株培养或悬浮培养研磨介质: 20µmol蔗糖+ 10µmol MgCl2 + 20µmol Tris-HCl (pH7.8)机械法的特点：⑴细胞不受酶的伤害；⑵不发⽣质壁分离。
植物组织培养与细胞培养技术研究
植物组织培养与细胞培养技术研究植物组织培养与细胞培养技术是现代生物技术领域中非常重要的一部分，它的应用广泛，包括农业、林业、医药和生物工程等多个领域。
它能够对植物进行育种、繁殖、遗传转化和基因修饰等研究，对于保护生物多样性和实现农业可持续发展具有重要作用。
植物组织培养技术是指通过细胞分离培养基和生长因子的作用，使植物体内的一系列细胞体外生长繁殖，最终形成新的植物个体的过程。
它包括原生质体培养、愈伤组织培养和植物再生技术等。
原生质体培养技术是指通过将植物细胞进行分离和培养，培养出单个细胞，然后通过电融合或化学刺激等方式将不同种类的原生质体进行融合，形成新的杂交种，产生具有新特性的植物个体。
目前这种技术在植物育种中已经得到了广泛的应用，例如水稻、玉米、小麦等作物的培育，不但可以提高作物的产量和抗病能力，同时可以丰富作物种类，实现农业可持续发展。
愈伤组织培养技术是指通过将植物切割或切除部分组织，然后将其进行培养，形成愈伤组织，进而通过细胞分裂和分化，形成新的植物个体。
这种技术的优点是可以进行无性繁殖，大大加快了培养和繁殖的速度，并且可以对植物组织进行遗传转化，培育出具有新特性的植物。
植物再生技术是指通过植物体的组织或细胞进行分化和再生，形成新的植物个体。
这种技术的优点是可以进行整体遗传改良，包括基因改造、基因转移等技术，例如将抗病基因、抗虫基因、早期成熟基因等导入到目标植物中，提高植物的产量和抗病抗虫能力。
细胞培养技术是指将植物体内的细胞在无菌的培养基上进行细胞培养，形成细胞群落。
这种技术通常是在实验室环境中进行的，目的是对植物的生理和代谢进行研究。
应用广泛的包括植物激素的研究、药物代谢机制等。
植物组织培养技术的应用非常广泛，不仅可以对植物进行改良，还可以用来繁殖罕见和濒危物种，恢复和保护生态环境，解决农业生产和森林经营中的问题。
但同时也应该注意到，植物组织培养技术的应用还存在一些问题，例如容易产生变异、突变和杂交，导致植物品种的稳定性和一致性下降，需要加强对其安全性和环境风险的评估和管理。
细胞工程植物组织与细胞培养
B、植物细胞培养过程
3．3．5 植物细胞培养的应用
3．3．6 原生质体 培养
（技术线 路，以经 济海藻— —红篱为
例）
【习题】
1、名词解释，并简要说明它们间关系： 去分化与再分化
外植体与胚状体 无毒苗与快繁苗 2、简要分析愈伤组织和胚状体在植物细胞全
能性的实现途径中技术关键是什么？
Chapter3、植物组织与细胞培养
3．1 植物细胞工程概述 3．2 植物组织培养 3．3 植物细胞培养
3．1 植物细胞工程概述
3．1．1 植物细胞工程是细胞工程的一个重要分支学科。
3．1．2 植物细胞工程（plant cell engineering）
植物细胞工程（plant cell engineering）：是 在植物细胞全能性的基础上，以植物细胞为 基本单位，在体外条件下进行培养、繁殖或 人为的精细操作，使细胞的某些生物学特性 按照人们的意愿发生改变，从而改良品种或 创制新种，或加速繁殖植物个体，或获得有 用产物的过程。
体细胞胚的培养：（自旋过滤式反应器）气升式剪 切力小。
3．2．9 存在问题：
一、理论问题：细胞全能性与激素作用机制； 二、技术问题：效率偏低、外植体诱导时间
长、培养基配方、继代培养植株变异、 新型反应器工艺设备改进； 三、应用范围：工厂化、成本高、资金多。
3．3 植物细胞培养 3．3．1 定义： 植物细胞培养：是指在离体条件下，将愈 伤组织或其他易分散的组织置于液体培养 基中进行振荡培养，得到悬浮细胞，再通 过继代培养使细胞增殖，从而获得大量细 胞群体的技术。它是在组培基础上发展起 来的。
七、植物组织器官的生物反应器培养
——是指那些用来生产植物次生代谢产物的组织 器官（生长快，生理、生化特征稳定）培养物的大规 模工厂化批量生产过程。
植物细胞培养
4.3 植物组织与器官培养
4.3.1 植物组织培养的定义： 在无菌条件下，将离体的 植物器官，组织，细胞，胚 胎，原生质体等在人工培养 的条件下，诱发产生愈伤组 织，潜在芽或者长成新的完 整植物的一门实验技术，又 称为“试管植物”。
4.3.2 几个重要概念
• 全能性细胞：是能够表达生物体基因组的任何一种
•
4.4.2 植物细胞培养的方法
根据培养对象： 主要有：单细胞培养，单倍体培养（花药雄 性生殖细胞），原生质 根据培养系统： 主要有：固体培养和液体培养。
4.4.3 植物细胞培养的培养基
• 基础培养基有：
MS，B5，N6 。 主要有无机盐， 碳源， 有机氮源，有机酸等构成。 常用的培养基的组成：MS+植物生长激素+椰 子汁
• 4.1 植物组织培养与细胞培养的区别 • 4.2 发展历史 • 4.3 植物组织与器官培养 • 4.4 植物细胞培养 • 4.5 植物原生质培养
4.4 植物细胞的培养：
• 4.4.1 植物细胞培养定义 • 定义：指在离体条件下，将愈伤组织或其它容易
分散的组织置于培养基中进行培养，得到分散成 游离的悬浮细胞，通过继代培养使细胞增殖，从 而获得大量细胞群体的一门技术。目的是获得初 级和次级代谢产物。 可通过改变培养基成分及其浓度，生长调节剂的 选择等手段来实现代谢产物的诱导。
4.5.2 原生质体研究意义
研究组织和器官发育机制；
可以进行有关遗传操作；
研究植物细胞的生理功能；
诱导融合形成杂种细胞。
4.5.3 原生质体的制备 原材料准备 预处理与酶解 原生质体收集与纯化 原生质体活力检测
4.5.3.1 用于分离原生质体的材料来源
两个来源：
植物细胞和组织培养
植物细胞全能性及其表达
（一）植物细胞全能性的提出与证明
（二）胚性细胞 —— 植物的干细胞 （三）从分化细胞到胚性细胞
（二）胚性细胞 —— 植物的干细胞
在自然条件下，植物体内的许多细 胞可以不断地产生不定胚或芽，表 明它们保留着胚性。在自然界表现 出胚性的细胞可以分为三大类，即 早期胚胎细胞、茎端分生细胞和成 熟组织中遗留的胚性细胞。 最典型的例子是落地生根，其叶片 周缘组织特定部位中遗留的胚性细 胞能够沿著叶片的四周形成不定芽， 然后发育为具有根系的小植株，脱 Kalanchoe laxiflola 落到地面。
2. 器官分化
烟草的薄层表皮培养时，花枝 的薄层表皮只能产生花芽，植 株基部的薄层细胞只能产生营 养芽，中间部分的外植体能产 生两种类型的芽，但其间的比 例会有不同，这取决于它们与 植株基部距离的远近。花芽的 分化还受外源激素组成的影响， 只有当培养基中所含的激动素 和 IAA 的 克 分 子 浓 度 皆 为 106mol/L 时，花枝的表皮才能形 成花芽。若不改变 IAA 浓度， 把激动素浓度提高到10-5moI/L， 则会完全抑制花芽的形成，而 只出现营养芽。器官分化的基 因表达尚有待研究。
二、脱分化过程中细胞结构的变化 植物体内最大量的分化细胞是成熟的薄壁细胞，例如叶肉 细胞、表皮细胞、内皮层和髓部的薄壁细胞等，它们的细胞核 的体积较小，位于细胞边缘，细胞中央有一个大的液泡，细胞 质内核糖体密度较低，多聚核糖体数目很少，质体为分化程度 较高的叶绿体、杂色体、白色体或淀粉体。 在离体培养条件下烟草的叶肉细胞从第一次分裂开始即进 入脱分化的过程。通过数次有丝分裂，逐步转变为分生细胞， 核体积变大，占据中央位置，大液泡逐渐消失，液泡中出现一 种与细胞质生长相关的蛋白体 ，叶绿体通过缢裂和出芽生殖转 变为原质体。
植物细胞培养的原理
植物细胞培养的原理植物细胞培养是一种通过体外培养植物细胞和组织来研究植物生长、发育和代谢过程的技术。
它主要基于细胞分裂和再分化的原理。
在植物细胞培养中，细胞和组织在合适的培养基上生长和分裂，从而形成新的细胞或组织。
细胞分裂和再分化是植物细胞培养的基础原理。
植物细胞培养的理论基础是组织培养，即将植物的组织切割成细胞，通过特定培养基上的营养物质供应来刺激细胞生长和分裂。
这种培养基包括碳源、氮源、矿物元素等。
同时，培养基中还添加了生长调节物质，如植物激素等，以促进细胞分化和再生。
植物细胞培养的步骤一般包括以下几个方面：材料准备、无菌操作、培养基配制、细胞或组织的预处理、细胞或组织的接种、培养条件的控制等。
在材料准备方面，首先需要选择要培养的植物种类和组织类型。
一般来说，根、茎、叶等组织都可以成为培养的对象。
然后，需要将这些组织从植物体中取出，并进行清洗和消毒处理，以去除外部的污染物。
无菌操作是植物细胞培养中非常重要的一环。
无菌操作可以通过火化、高压灭菌等方法进行。
当组织表面被消毒后，可以将其切割成较小的片段或胚珠、根尖等，并将其接种到培养基上。
无菌操作的目的是保证培养过程中没有细菌、真菌或其他微生物的污染。
培养基的配制是植物细胞培养过程中的一个重要步骤。
培养基是提供细胞和组织生长所需的营养物质的基础，包括碳源、氮源、矿物元素等。
在培养基中还需要添加一定的植物激素来促进细胞分化和再生。
培养基的配制需要根据不同的组织类型和培养目的进行调整。
细胞或组织的预处理是植物细胞培养中的另一个重要步骤。
预处理可以帮助提高细胞和组织的存活率和再生能力。
通常，预处理包括细胞离体培养、试管前培养、组织分化等。
接种是植物细胞培养中最关键的一步。
接种可以使用无菌的微型听管、培养皿等容器。
将预处理好的细胞或组织放置在培养基上，然后在适当的条件下进行培养。
培养条件包括光照、温度、湿度等因素，不同的植物种类和组织类型需要不同的培养条件。
植物组织与细胞培养课件
第三十四页，共三十四页。
培养
第十九页，共三十四页。
幼胚培养
(péiyǎng)
影响幼胚培养成功的因素 培养基：无机盐、碳水化合物、激素等
环境(huánjìng)条件(温度：多数为25-30℃，因植物种类有所
差别。光照：一般认为黑暗或弱光条件较为合适。)
提高幼胚的成活率，可采用胚乳看护培养
第二十页，共三十四页。
胚龄与胚性发育(fāyù)的关系
胚乳培养过程 含胚乳的果实或种子→表面消毒(xiāo dú)→无菌 条件下胚乳的剥离→接种培养基培养。 培养室温度25-27℃，黑暗或弱光下进行。
第二十四页，共三十四页。
胚乳培养的器官发生(fāshēng)
愈伤组织形成、器官发生 （1）愈伤组织的诱导 （2）愈伤组织的再分化 （3）胚乳苗的生根培养
经过自身的代谢作用合成其生长必需的物质，在营养 上已可以完全独立。
第十四页，共三十四页。
依据所剥离胚的发育时期(shíqī)不同：
培养类型
幼胚培养 (immature embryo)
成熟胚培养 (mature embryo)
子叶形成(xíngchéng) 之前
子叶(zǐyè)形成之后
第十五页，共三十四页。
受精胚珠的培养
未受精胚珠的培养
植物胚珠(pēi zhū)结构图示
第二十九页，共三十四页。
胚珠 培养 (pēi zhū)
胚珠培养的方法 培养受精胚珠，摘取授粉时间合适的子房(zǐfáng)，如培养 未受精胚珠，则在授粉前摘取子房(zǐfáng)→表面灭菌→剖 开子房壁，取出胚珠或带胚珠的胎座接种培养。
胚培养：指在无菌条件(tiáojiàn)下将胚从胚珠或种子中
使用细胞培养技术进行植物组织工程的步骤
使用细胞培养技术进行植物组织工程的步骤植物组织工程是一门应用细胞培养技术研究植物生物学和遗传学的领域。
通过细胞培养技术，可以通过基因工程手段改良植物基因组，提高其生产力、抗病性和耐逆性等性状。
本文将讨论使用细胞培养技术进行植物组织工程的一般步骤。
第一步是材料制备。
植物组织工程所需的原材料包括植物的种子、幼苗或组织片段。
这些材料需要经过严格的选择和处理，以确保其纯度和无病原微生物的存在。
常见的处理方法包括消毒、缩小体积和存储。
第二步是细胞初始培养。
将材料细碎或提取细胞，然后放入适当的培养基中，利用合适的培养条件（如光照、温度和营养物质）促进细胞分裂和生长。
初代培养一般是在无菌条件下进行，以避免外源性污染。
第三步是细胞增殖和分化。
经过一段时间的培养，细胞开始增殖并分化成不同的组织或器官。
这可以通过调整培养基中的营养物质的类型和浓度、激素的种类和比例等来实现。
培养基中通常添加的激素有生长素和细胞分裂素等。
第四步是组织再生和分化。
当细胞增殖到一定程度后，可以通过调整培养条件和培养基的组合等方式来诱导其分化成特定的组织或器官。
这包括诱导根、茎、叶、愈伤组织等的形成。
这一步需要严密的控制和调节，以确保所得到的组织或器官的质量和数量。
第五步是植株再生。
当特定的组织或器官形成后，可以将其转移到含有植物生长调节剂和适当营养物质的培养基中，以促进植物的再生和生长。
这一步需要与环境条件的适应，并且可能需要经过多次次培养才能获得完整的植株。
第六步是植株生长和巩固。
当植株再生后，需要将其转移到质子土壤或更适宜的培养条件下进行营养和增长。
这包括调整光照强度、温度、湿度等因素，以保证植株的生长和巩固。
细胞培养技术是一项复杂而精细的科学和技术工作，它需要严格的操作和控制。
此外，为了保证结果的准确性和可重复性，实验过程中还需要进行对照试验和统计分析等工作。
尽管细胞培养技术在植物组织工程中已经取得了显著的进展，但仍然存在一些挑战和难题。
植物组织培养与动物细胞培养的比较
植物组织培养与动物细胞培养的⽐较
植物组织培养与动物细胞培养的⽐较⽐较项⽬植物组织培养动物细胞培养
区别
原理植物细胞的全能性细胞增殖
培
养
基
状态固体或半固体培养基液体培养基
成分包括矿质元素、蔗糖、维⽣素、
琼脂、植物激素等
包括⽆机盐、葡萄糖、维⽣素、
氨基酸、动物⾎清等
培养条件再分化阶段需光不需光
细胞来源离体植物器官、组织或细胞胚胎或幼龄动物组织、器官过程脱分化、再分化原代培养、传代培养结果获得新个体或细胞产品⼤量产⽣细胞或细胞产物
⽤途
①快速繁殖名贵花卉和果树
②培养⽆病毒植株、转基因植物
③⼤规模⽣产细胞产品如药物、
⾷品添加剂、⾹料、⾊素等
①⽣产蛋⽩质制品如病毒疫苗、
⼲扰素、单克隆抗体等
②检测有毒物质
③研究⽣理、药理、病理
相同点
①都需要⼈⼯条件下的⽆菌操作，⽆菌培养
②都是合成培养基
③都需要适宜的温度、pH等条件
④都进⾏有丝分裂。
植物组织培养与细胞培养
植物组织培养与细胞培养开始于19世纪后半叶，当时植物细胞全能性的概念还没有完全确定，但基于对自然状态下某些植物可以通过无性繁殖产生后代的观察，人们便产生了这样一种想法即能否将植物体的一部分在适当的条件下培养成一个完整的植物体，为此许多植物科学工作者开始了培养植物组织的尝试。
最初的问题仍然是集中在植物细胞有没有全能性和如何使这种全能性表现出来。
1839年Schwann提出细胞有机体的每一个生活细胞在适宜的外部环境条件下都有独立发育的潜能。
1853年trecul利用离体的茎段和根段进行培养获得了愈伤组织，愈伤组织是指一种没有器官分化但能进行活跃分裂的细胞团，但这还不能证明细胞具有全能性，因为由愈伤组织没能再生出完整植物体。
1901年Morgan首次提出一个全能性细胞应具有发育出一个完整植株的能力。
所谓全能性细胞就是指具有完整的膜系统和细胞核的生活细胞，在适宜的条件下可通过细胞分裂与分化，再生出一个完整植株。
White 指出：如果一个给定的有机体的所有细胞都大致相同，并具有全能性，那么在有机体内所观察到的细胞分化必定是这些细胞对有机体内微环境和周围环境的反应。
就是说机体内每个细胞所以没有表现出全能性，是因为该细胞所处位置的不同，致使其某些功能被抑制（suppressed),这充分说明机体内的微环境因素在细胞分化中起了十分重要的作用。
按照现代发育生物学和细胞生物学的理论，细胞分化是受基因在时间和空间两个方面的调空，空间就是指细胞在机体内所处的位置。
不同位置的细胞，其基因的表达不同，细胞所表现出的形态结构和行为就不同。
如果将一个生活的细胞从植物体内分离出来，使之脱离开原有的环境，细胞被抑制的功能将有望得以恢复，重新表现出全能性。
基于这种认识，科学工作者便萌生出了植物组织培养的念头。
Haberlandt(1902)首次提出细胞培养的概念，也是第一个用人工培养基对分离的植物细胞进行培养的人。
与rechinger不同，Haberlandt相信切块大小不会影响细胞增殖，但由于Haberlandt使用的培养液成分简单，培养的细胞是高度分化的细胞，又没采取消毒技术，所以实验失败，培养的细胞虽然存活了几个月但没能分裂。
植物组织和细胞培养技术ppt课件
植物组织培养
根据细胞全能性原理，在无菌条件下，分离植物
的器官、组织、细胞或原生质体（称为外植体），
并在培养基上培养，在适宜的条件下使其长成部
分或完整植株的技术。
愈
根 继续
分离
脱分化
伤再分化 组
芽
培养
外植体
织
植物激素： 细胞分裂素、生长素
植物 体
胚状 体
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胚 状 体
幼 苗
离体培养
细胞全能性指已 经分化的细胞， 仍然具有发育成 完整新的生物个 体的潜能。
说明高度分化的 植物细胞具有全 能性。
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细胞的全能性
为什么细胞具有全能性？
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细胞的全能性
1．实现细胞的全能性必需的条件是什 么？为什么？
离体。因为在特定的时间和空间条件
下，细胞中的基因会选择性地表达出各 种蛋白质，形成不同的组织和器官。
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植物组织培养
根据细胞全能性原理，在无菌条件下，分
植物组织与细胞培养
植物组织与细胞培养：在无菌和人工控制条件下，利用合适的培养基，对植物的器官、组织、细胞或原生质体进行精细操作和培养，使其按照人们的意愿生长、增殖或再生的一门生物技术学科。
植物细胞全能性：任何具有完整细胞核的植物细胞，都拥有形成一个完整植珠所必须的全部遗传信息和发育成完整植株的能力。
初代培养：芽、茎段、叶片、花器等外植体从植物体上分离下来的第一次培养的过程。
继代培养：初代培养后，将组织转移到新的培养基上进行培养的都称为继代培养。
体细胞胚：植物组织培养过程中能够产生与正常合子胚相似的结构，由体细胞发育而成，也称为胚状体。
（离体）胚的培养：在无菌条件下将胚从胚珠或种子中分离出来，置于培养基上进行离体培养的方法。
外植体：从植物体上分离下来的用于离体培养的材料。
驯化现象：植物组织经长期继代培养，要加入生长调节物质，其后加入少量或不加入生长调节物质就可以生长，这种现象称为“驯化”现象。
玻璃化苗：当植物材料不断地进行离体繁殖时，有些试管苗的嫩茎、叶片往往会呈半透明水迹状，这种现象通常称为玻璃化，这种出现玻璃化现象的试管苗成为玻璃化苗。
愈伤组织：通常是指植物受到机械、动物或微生物等伤害后，创伤部位细胞脱分化而不断增殖形成的松散排列、无特定结构和功能的非器官化组织。
脱分化：已分化好的细胞在人工诱导条件下，恢复分生能力，回复到分生组织状态的过程。
再分化：脱分化后具有分生能力的细胞再经过与原来相同的分化过程，重新形成各类组织和器官的过程。
人工种子：人工种子是指植物离体培养中产生的胚状体或不定芽包裹在含有养分和保护功能的人工胚乳和人工种皮中所形成的能发芽出苗的颗粒体。
褐化现象：褐化是指在接种后，外植体表面开始褐化，释放出褐色物质，有时甚至会使整个培养基褐化的现象。
器官培养：以植物器官作为外植体进行离体培养，包括离体的根、茎、叶、花器和果实的培养。
原生质体培养：用酶及物理方法除去细胞壁，对所得到的原生质体进行培养的方法。
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5.毛状根培养的生物反应器
毛状根外型像毛发，容易交织缠绕。毛状根的 特点决定了用于毛状根培养的生物反应器需要 特殊设计。 例如：反应器的内部需要特殊设计满足毛状根 的空间分布的均匀性问题。同时，也要提供合 适的培养液循环与气体供给方式才能满足毛状 根对营养和气体的需求，还要考虑接种、取样 、收获、生物量检测等特殊问题。
一些植物的次级代谢产物在根里大量合成 ，但是正常根的培养非常困难，生长缓慢 ，收获困难。
毛状根(hairy roots)是发根农杆菌（ Agrobacterium rhizogenes）感染双子叶 植物后，形成的类似头发一样的根组织。 许多植物的毛状根在离体培养条件下表现 出次生代谢产物的合成能力，产物产量较 正常植物及悬浮培养细胞的要高。
皂苷类(saponins)：对人参的研究表明：以无菌 苗带叶幼茎为外植体诱导的毛状根中人参总皂苷 含量为2.486％(干重)。高于原药材总皂苷含量 1.403％(干重)。 苯丙素类(类(phenyIpropanoids)：雪莲毛状根中丁 香苷和高车前素的含量分别约是野生植株的40倍 和3倍。 萜类(terpenoids)：对短叶红豆杉的研究表明： 以无菌苗的芽为外植体可诱导出毛状根。毛状根 中紫杉醇的含量为愈伤组织的1 3--88.00倍。
1.毛状根诱导
发根农杆菌 (Agrobacterium rhizogenes)是一种革兰氏阴性菌，能 侵染大多数的双子叶植物、少数单子叶 植物及个别的裸子植物，诱发被感染植 物的受伤部位长出毛状根。 发根农杆菌具有致根性，是因为它具有 能诱导毛状根产生的Ri(Root inducing)质粒（约250kb的大质粒） ）, 是位于发根农杆菌染色体之外的独立的 双链环状DNA。具有2个主要的功能区： T-DNA区(Transferred DNA region， 转移区)和Vir区(Virulanee region， 致病区)。
生物碱类(alkaloids)：孙敏等以长春花 (Catharanthus roseus)无菌苗叶片为外植体诱导 毛状根，其中长春碱含量是原植物根和叶中含量 的27.4倍和23.5倍。长春新碱的含量是原植物根 是23.55倍。 蒽醌类(anthraquinones):对何首乌(Polygonium multiflorum Thunb)的研究表明：以再生植株的 叶柄、茎段和叶片为外植体可诱导毛状根，毛状 根中大黄酸的含量为2.49μg/L(干重)。是无菌幼 苗的2.85倍。
在通常状态下，Ri质粒上Vir区的基因处于抑制 状态，当发根农杆菌感染寄主植物时，受损伤 的植物细胞合成的低分子苯酚化合物乙酰丁香 酮使Vir区处于抑制状态的基因被激活，产生一 系列限制性核酸内切酶，在酶的切割作用下产 生T-DNA链，T-DNA进入植物细胞核内，整合进 植物细胞的基因组。其整合和表达的结果导致 了大量毛状根的产生。 T-DNA上有生长素合成基因tms 1和tms 2，指导 IAA(吲哚乙酸)的合成，因此转化产生的毛状根 ，在培养时不需要添加外源生长激素，为激素 自养型。
（3）原生质体—农杆菌共培养法 将原生质体培养3-5天后，加入带Ri质粒的发根农 杆菌进行共培养，然后借助于转化后的细胞激素 自养型特性或T-DNA上的抗菌素标记筛选出转化成 功的细胞。 分裂形成愈伤组织，在无激素培养基上可产生毛 状根。
3.毛状根培养优点
由Ri质粒转化的毛状根生长快、激素自养型、生 长周期短，在培养时不需要添加外源激素，易于 培养。
毛状根分化程度高，产生次级代谢产物能力强， 合成较为稳定，能大量合成某些悬浮培养的细胞 不能或者很少合成的次级代谢产物。 通过T-DNA改造，易于采用基因工程途径提高次级 代谢产物产量。
4.毛状根在药用次生代谢产物中的应用
毛状根应用于药用植物次生代谢产物的生产已有 近30年的历史。 黄酮类(flavonoids)：付春祥等的研究表明。来 源于新疆雪莲根段外植体的毛状根系。其20d的 生长速率可达到鲜重接种量的24倍。其中黄酮含 量是野生雪莲根的8.6倍，是野生雪莲叶片的2.9 倍。
传统反应器改造
在搅拌式反应器中用丝网把毛状根与叶轮隔开， 避免了叶轮剪切力的影响。 在鼓泡塔反应器中增加大量的喷头，提高了充 氧效率。
新型反应器设计:超声雾化反应器
1 生物反应器 2 中心筒 3 不锈钢筛网 4 空气出口 5 时间继电器 6 雾化头 7 培养液 8 空气入口 9 空气过滤器 10 流量计 11 电磁阀 12 空气储罐 13 雾化装置 14 40W 日光灯
第三章 植物组织与器官培养
本章内容
第一节 植物组织培养 第二节 植物胚胎培养 第三节 毛状根培本节课主要内容 1.毛状根培养制备次级代谢产物 2.人工种子的制备 本节课关键问题 1.毛状根的诱导机制与方法、应用， 2.人工种子的制备
第三节 毛状根培养
一、毛状根培养生产次级代谢产物
2.毛状根诱导方法 （1）外植体接种法
取植物的叶片、茎段、叶柄等无菌外植体， 与发根农杆菌共同培养2～3天，将植物的外 植体移到含有抗生素的选择培养基上进行培 养，经过多次继代培养，转化的植物细胞产 生愈伤组织，并可产生毛状根。
（2）茎杆接种法 无菌植株生长到一定时候，将植株的茎尖、叶片 切去，剩下茎杆和根部，在茎杆上划出伤口，将 带Ri质粒的发根农杆菌接种在伤口处和茎的顶部 切口处，经过一段时间培养，在接种部位产生毛 状根。
第四节 人工种子
一、 人工种子概念与发展状况 二、 人工种子制作 三、 人工种子储存 四、 人工种子优点及存在问题
一、人工种子概念与发展状况
• 人工种子（ Artificial seed）：又称合成种子
(Synthetic seed)或体细胞种子(Somatic seed)，是指 将植物离体培养中产生的胚状体或芽包裹在含有养 分和保护功能的人工胚乳(Artificial endosperm)和人 工种皮(Artificial seed coat)中形成的类似种子的颗