第八章 酶定向进化

其基本操作过程如下 : 靶基因经随机突 变产生含不同突变类型的亲本基因群, 用 DNase I 随机切割; 得到的片段经过不加 引物的多次PCR 循环, 在该过程中, 这些 片段之间互为引物和模板进行扩增, 直至 获得全长基因; 再加入基因的两端引物进 行常规PCR, 最终获得发生改组的基因库。
2.1交错延伸重组(Stagger extension process)

图给出最常用的大肠杆菌克隆用质粒pUC19的图 谱，此质粒的复制起点处序列经过改造，能高频 率起动质粒复制，使一个细菌pUC19的拷贝数可 达500-700个； 质粒携带一个抗氨芐青霉素基因，编码能水解β内酰胺环，从而破坏氨芐青霉素的酶，当用 pUC19转化细菌后放入含氨芐青霉素的培养基中， 凡不含pUC19者都不能生长，结果长出的细菌就 是都含有pUC19的。
它是由两个相互独立的关键技术组成. 一个是随机基因文 库的构建, 另一个是特定酶( 特别是增加催化活性、增强 选择性或稳定性) 的筛选策略。
第二节 定向进化的方法
一、酶基因的随机突变
1.易错PCR技术 (Error prone PCR)
易错PCR 是指从酶的单一基因出发，通过 改变PCR 的反应条件 , 使碱基在一定程度上 随机错配而引入多点突变, 构建 行全面的筛选。为此要求构建 可能完变基库容量。
所有的质粒载体都有三个 共同的特征：一个复制子、一 个选择性标志和一个克隆位点。 复制子是含有DNA复制起始 位点的一段DNA（ori），也包 括表达由质粒编码的复制必需 的RNA和蛋白质的基因。 选择性标志对于质粒在细 胞内持续存在时必不可少的。 克隆位点是限制性内切酶 切割位点，外源性DNA可由此插 入质粒内，而且并不影响质粒 的复制能力，或为宿主提供选 择性表型。
与常规DNA 改组相比,RPR 技术有如下优点: ( 1) 可利用单链DNA 为模板, 故可直接用mRNA 或cDNA 为亲本进行进 化。 ( 2) 在该方法中, 随机片段不是由亲本基因切割获得, 故大大降低了改组中, 片段重新装配前必须彻底去除DNaseI, 所以该方法更 为简单。 ( 4) 合成的随机引物具有同样长度, 无序列倾向性。在理论上, PCR 扩增 时模板上每个碱基都应被复制或以相似的频率发生突变。
( 5) 随机引发合成的DNA 片段的大小,不受DNA 模板长度的限制。
3 基因家族重排技术
基因家族重排又称为基因家族改组技术，是 从基因家族的若干同源基因出发，用酶切割成随 机片段，经过不加引物的多次PCR循环,使DNA的 碱基序列发生重新排布而引起基因突变的技术过 程。
出发点不同
当以单一的酶分子 基因进行定向进化 时, 基因的多样化 起源于易错PCR 等 反应中产生的随机 突变, 所以采用这 种过程累积有益突 变的速度比较慢。1.2构建突变的主要过程载体的选择

基因重组组装突变基因载体的选择 质粒载体
质粒是存在于微生物细胞内染色体外的遗传单位， 是一种闭合环状双链DNA分子。
有自主的复制起点
两种以上的易于检测的选择性标记
特点
多种限制性内切核酸酶的单一位点
适合小片段DNA的重组

噬菌体DNA载体
载体的选择
例
2.4%
2 ������
DNA 重排
DNA 重排又称为有性PCR ( Sexual PCR) , 其目 的是创造将亲本基因群中的突变尽可能组合的机会, 以导致更大的变异, 最终获得具有最佳突变组合的酶。 该技术不仅可加速积累有益突变, 而且可实现目的 蛋白多种特性的共进化, 所以无论在理论上, 还是在 实际应用中, 均优于连续易错PCR。
依 据
2 依据颜色变化筛选 3 根据透明圈情况筛选 4 荧光筛选
高通量筛选技术

Loo 等人提出一种对环氧化物水解酶平板筛选的 新方法. 由于E . col i 中环氧化物水解后得到的二 醇具有氧化能力, 而被氧化的NADH 的释放通过 呼吸链使得膜电势升高, 产生强质子流, 增强了细 胞对番红O 的摄入, 并使得番红O 在细胞内聚集. 具有环氧化物水解酶活力的克隆显示均匀的桃红 色, 而无活力的克隆则有一个透明圈. 通过这种琼 脂平板涂布, Loo 等人对环氧化物水解酶的高对映 选择性进行了定向进化.
第八章 酶定向进化
教师：冯玮
1
第一节 定向进化的原理
2
第二节 定向进化的方法
3
第三节 酶突变基因的定向选择
3
第四节 酶定向进化的应用
第一节 定向进化的原理

模拟自然进化的过程，进行人工随机突变，并在特 定的环境条件下进行选择，使进化朝着人们所需要 方向发展的技术过程。
定向进化= 随机突变+ 选择 定向进化的基本规则是, 获取你所筛选的突变体������
交错延伸重组 在提高枯草杆 菌蛋白酶的稳 定性和酶活力 方面, 取得了 极大的成功。
2.2 随机引物体外重组(Random priming in vitro recombination)
随机引物体外重组是用一套随机序列引物, 先产生大量互
补于模板不同位点的短DNA 片段, 由于碱基的错配, 这些短 DNA 片段中也会有少量的点突变。然后除去模板，这些DNA 片段互为模板和引物进行扩增，通过碱基序列的重新排布而 获得全长突变基因。
高通量筛选技术
2.1平板筛选
平板筛选方法是将含有随机突变基因的重组细胞，涂 布在平板培养基中，并在固体平板培养基中加入底物, 根 据宿主菌表达的突变酶作用于底物形成透明圈或其他特征 进行筛选, 或是利用有关的缺陷株作为宿主菌, 直接将突变 体与宿主菌的生长联系起来。
高通量筛选技术
1 依据细胞生长情况筛选

定向选择环境条件的设定
在定向环境选择中，重组细胞培养的环境条件是根据定向进化的目的 要求而人工设定的，所设定的环境条件需要在每一次突变-筛选的循环 中加以调整，逐步向着进化的方向靠近，最终达到目的，获得人们所 需要的具有新催化特性的进化酶。

高通量筛选技术
高通量筛选技术要求：通量大、效率高，在较短时间内简便的判断 出正突变基因，并易于排出那些无效的突变基因。
基因重组

基因重组是在体外通过DNA连接酶的作用，将基 因与载体DNA连接在一起形成重组DNA的技术过 程。 黏性末端连接

将载体DNA和目的基因用形成黏性末端的同一种限制 性内切核酸酶进行切割，形成黏性末端，按照1：1的 比例混合，经过退火处理，使载体DNA与外源DNA的黏 性末端结合，形成双链结合体；在T4DNA连接酶的作 用下双链结合体连接形成稳定重组DNA分子。
从自然界中存在的基因 家族出发, 利用它们之间 的同源序列进行DNA 改组。 由于每一个天然酶的基因 都经过千百万年的进化, 并且基因之间存在比较显 著的差异, 所以获得的重 组基因库充分体现了基因 的多样化。基因通过易错PCR引起的错配 碱基数目控制在2-5个。
在通常情况下, 经一轮的易错PCR、定向筛选, 很难获得令人满意的结果。所以由此发展出了连 续易错PCR ( Sequential error prone PCR) .
该方法是将一次PCR 扩增得到的有益突变基 因作为下一次PCR 扩增的模板, 连续反复进行随 机诱变, 使得每一次获得的少量突变累积而产生重 要的有益突变。
定向进化虽然人工模拟自然进化, 但两者却不 相同:
1 进化动力不同。
2 进化方向不同。
3 进化速度不同。 4 定向进化的目标往往超越 生物学意义的要求。

按照对象不同分为分子定向进化和细胞定向进化 等。

分子定向进化
以各种生物大分子为进化对象，目的是改良 目标分子的结构、功能和特性，主要包括酶分子 定向进化，蛋白质定向进化，核酸分子定向进化。 分子定向进化首先要通过从细胞内提取或者 通过PCR等方法获取目标分子的基因，在体外采用 易错PCR,DNA重排，基因家族重排等技术进行人工 突变，然后进行定向选择而获得所需突变体。
由噬菌体DNA改造而成的具有自我复制能力的载 体成为噬菌体DNA载体。
载体的选择
黏粒载体
是一类人工构建的含有λDNA黏性末端和质粒复制 子的质粒载体，又称为柯斯质粒。
载体的选择
噬菌体载体
是一类人工构建的由M13噬菌体单链DNA的基因间隔
区与质粒载体结合而成的基因载体。
具有M13噬菌体DNA的复制起点，同时具有质粒载体 的特性。可以组装比载体长度长几倍的外源DNA片段。
判断质粒转化成功


pUC19还携带细菌lac操纵元中的lacI和lacZ’基因编码，当培 养基中含有诱导物IPTG和Xgal时，lacz’ 基因被诱导表达产 生具有活性的β-半乳糖苷酶，半乳糖苷酶水解Xgal而使菌落 呈现蓝色。

在lacz’ 中间又插入了一段人工设计合成的DNA序列，其中密 集多个常用的限制性核酸内切酶的位点，使外来的基因和序 列能很方便地被插入此位置，当外来序列插入后则破坏了 lacz’ 编码的半乳糖苷酶活性，生长的菌落就呈白色，这种颜 色标志的变化就很容易区分和挑选含有和不含有插入序列或 基因的转化菌落，称为蓝白筛选法。
在该方法中, 遗传变化只发生在单一分子内部, 所以属于无性进化。
由于它较为费力、耗时, 一般多用于较小基因 片段( < 800bp) 的改造。
采用易错PCR时，要控制好适当的突变频率。
当突变频 和中性突变。 但突变率也不能太 低, 否则未发生突 变的野生型将占据 突变群体的优势, 也很难筛选到理想 的正突变体.
交错延伸重组交错延伸重组是在PCR 反应中, 将含不同
点突变的模板（两个或多个DNA片段）混合, 将常规的退 火和延伸合并为一步, 并大大缩短其反应时间, 从而只能合 成出非常短的新生链, 经变性的新生链再作为引物随机地 杂交到含不同突变的模板上继续延伸, 此过程反复进行直 至获得全长基因。结果会产生间隔的含不同模板序列的新 生DNA 分子。