基因敲除方法专题-郭..
基因敲除技术的方法
基因敲除技术的方法
基因敲除技术是一种利用CRISPR-Cas9系统对细胞基因进行定向编辑和删除的新技术。
该技术可以帮助研究人员研究基因功能和疾病发生机制，以及开发新的治疗方法。
基因敲除技术的方法主要包括以下几个步骤：
1. 设计sgRNA：首先需要选择待敲除的基因，然后设计合适的sgRNA序列。
sgRNA是一种小RNA分子，能够将Cas9蛋白精确地指向目标基因，并切割该基因的DNA序列。
2. 转染sgRNA和Cas9：将sgRNA和Cas9蛋白导入目标细胞中。
通常采用的方法有脂质体转染、电穿孔转染等。
3. 筛选细胞：利用细胞内的修复机制，CRISPR-Cas9系统会在目标基因处切割DNA序列，并引起细胞的修复。
通过筛选，可以获得已经敲除目标基因的细胞。
4. 鉴定敲除效果：可以采用PCR、Western blot、qPCR等技术检测目标基因是否已被完全删除。
通过基因敲除技术，研究者能够研究目标基因对某种生物功能的影响，以及对疾病发生的贡献。
这一技术被广泛应用于生命科学研究领域，并在基因治疗等领域也具有广阔的应用前景。
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基因敲除实验步骤
基因敲除实验步骤嘿，咱今儿就来讲讲基因敲除实验这档子事儿！你想啊，这基因就好比是生物体的一套神秘密码，而基因敲除呢，就是要去修改或者删掉其中的一些关键部分。
这可不容易，但别怕，咱一步一步来。
首先呢，得选好你要敲除的那个基因，这就像是在茫茫密码本里找到你要动的那一部分，得精准，可不能找错咯。
然后，设计出专门针对这个基因的工具，就像是一把特制的小钥匙，能准确地去开启或者关闭这个基因。
接下来，就是把这个工具送到细胞里面去。
这可不是随便就能送进去的呀，得用些巧妙的办法，比如利用一些载体，就好像给这把小钥匙找了个合适的交通工具，让它能顺利到达目的地。
到了细胞里，这工具就开始发挥作用啦！它会找到目标基因，然后按照我们的设计，要么把它删掉，要么让它失去功能。
这过程中，可得时刻留意着，看看是不是真的敲除成功了。
怎么看呢？那就得用各种检测手段啦，就像给细胞做个体检，看看那个基因是不是真的被搞定了。
你说这像不像一场和基因的小战斗？我们就是那指挥作战的将军，得精心策划每一步，稍有不慎可就前功尽弃啦！而且啊，这实验可不是一次就能成功的哟，有时候可能得反复尝试好多回呢。
就跟你学骑自行车似的，一开始总会摔倒，但多练几次不就会了嘛。
在做基因敲除实验的时候，还得特别小心，别一不小心敲错了其他基因，那可就麻烦大啦！这就好比你本来想去剪个头发，结果一剪刀下去，把耳朵给剪了，那可不行呀！总之呢，基因敲除实验是个精细活儿，需要我们有耐心、有技术、还要有那么一点点运气。
但一旦成功了，那可就太有成就感啦！说不定还能为科学研究做出大贡献呢！所以呀，别害怕，大胆去尝试，说不定你就是下一个基因敲除大师哟！。
基因敲除技术的原理、方法和应用
基因敲除技术的原理、方法和应用2010-01-24 17:03:43 来源：易生物实验浏览次数：6302 网友评论 0 条1．基因敲除概述2．实现基因敲除的多种原理和方法：2.1.利用基因同源重组进行基因敲除 2.2利用随机插入突变进行基因敲除。
2.3.RNAi引起的基因敲除。
3．基因敲除技术的应用及前景4．基因敲除技术的缺陷关键词：基因敲除1．基因敲除概述：基因敲除是自80年代末以来发展起来的一种新型分子生物学技术，是通过一定的途径使机体特定的基因失活或缺失的技术。
通常意义上的基因敲除主要是应用DNA同源重组原理，用设计的同源片段替代靶基因片段，从而达到基因敲除的目的。
随着基因敲除技术的发展，除了同源重组外，新的原理和技术也逐渐被应用，比较成功的有基因的插入突变和iRNA，它们同样可以达到基因敲除的目的。
2．实现基因敲除的多种原理和方法：2．1．利用基因同源重组进行基因敲除基因敲除是80年代后半期应用DNA同源重组原理发展起来的。
80年代初，胚胎干细胞（ES细胞）分离和体外培养的成功奠定了基因敲除的技术基础。
1985 年，首次证实的哺乳动物细胞中同源重组的存在奠定了基因敲除的理论基础。
到1987年，Thompsson首次建立了完整的ES细胞基因敲除的小鼠模型 [1]。
直到现在，运用基因同源重组进行基因敲除依然是构建基因敲除动物模型中最普遍的使用方法。
2.1.1利用同源重组构建基因敲除动物模型的基本步骤(图1)：a．基因载体的构建：把目的基因和与细胞内靶基因特异片段同源的DNA 分子都重组到带有标记基因(如neo 基因，TK 基因等)的载体上，成为重组载体。
基因敲除是为了使某一基因失去其生理功能，所以一般设计为替换型载体。
b．ES 细胞的获得：现在基因敲除一般采用是胚胎干细胞，最常用的是鼠，而兔，猪，鸡等的胚胎干细胞也有使用。
常用的鼠的种系是１２９及其杂合体，因为这类小鼠具有自发突变形成畸胎瘤和畸胎肉瘤的倾向，是基因敲除的理想实验动物。
简述基因敲除技术操作方法
简述基因敲除技术操作方法
基因敲除技术是将某一特定基因在细胞或生物体中进行完全或部分去除或失活的一种基因编辑技术。
操作步骤：
1. 设计sgRNA：首先，为目标基因设计合适的sgRNA (single guide RNA)序列。
sgRNA由两个部分组成，一个是能够结合到Cas9蛋白上的常规RNA序列，另一个是与目标基因靶向结合的特定RNA序列。
2. 获得Cas9蛋白：将Cas9基因导入目标细胞中，通过蛋白质合成过程获得Cas9蛋白。
3. sgRNA和Cas9蛋白配对：将sgRNA分别与Cas9蛋白组装在一起，形成"CRISPR-Cas9复合物"。
4. 将CRISPR-Cas9复合物导入目标细胞：利用一些常见的基因转染技术或选择性培养细胞系等方法将该复合体导入目标细胞。
5. 分析基因敲除效果：使用PCR，Western印迹、等手段来确定基因是否被去除、缺失或失活。
需要注意的是，基因敲除技术可以有效地诱导基因缺失或失活，但有时它也可能导致同源重组或非同源重组，使得去除那些不想去除的基因或区域。
因此，在实验操作时，必须谨慎考虑sgRNA的设计和基因敲除效果的确定方法。
基因敲除2
PCR法
PCR方法可以用来筛选基因打靶操作中的阳性克隆。
选择性地扩增发生同源重组的 DNA片段。先在靶载体 中插入neor基因使其突变，然后合成两个引物，它们分别 位于外源靶载体和与靶载体相接处的内源非同源序列上。 将G-418 抗性细胞克隆分别进行PCR。发生同源重组时， 由于两个引物分别从相对的两个方向同时扩增，结果是 DNA片段的拷贝数以指数式增加，得到已知长度DNA双链 片段。与之相反，在随机整合中，由于只有一个引物且为 单方向，所以扩增的片段拷贝数呈线性比例，片段为单链， 长度不定。
正相选择法
在基因敲除载体的目的片段中插入启动子缺失的正向选 择基因neor ，目的基因片段也不包含该基因的启动序列，再 嵌合入打靶载体中与靶位点同源的序列内，将打靶载体转染 进靶细胞，可能出现下面几种情况： 打靶载体不整合入靶细胞基因组，将随传代而丢失； 随机整合，由于neor基因缺失了其自身的启动子和起始码，整 合位点周围亦无启动子，使neor基因的表达受阻； 虽是随机整合，但其整合位点侧翼序列在其它基因的启动子 能启动neor基因的表达； 外源打靶载体与靶位点发生了同源重组，则neor基因可借助靶 基因自然存在的其和起始密码的作用而呈现表达活性。 用G418筛选，则抗性细胞中将只包含③④，根据基因组DNA 酶切图谱的不一致，用Southern印迹杂交可检测出同源重组的 克隆。
筛选方法的特点
PNS及PCR法是对任何靶基因的定点敲除都适用的两 种重要的方法，但它们都有不足之处。 PCR法缺乏直接的选择标记，运用PCR 法进行筛选 时，必须对每个细胞克隆分别进行扩增，因此较为费时费 力，工作量非常大。 PNS法可能是目前应用最广泛的方法，但PNS法要经 过2种药物筛选，有可能对ES细胞产生潜在的影响。 正向选择法适合于敲除那些在细胞中良好表达的基因。
基因敲除技术的主要方法和步骤有哪些？
基因敲除技术的主要方法和步骤有哪些？基因敲除是用含有一定已知序列的DNA片段与受体细胞基因组中序列相同或相近的基因发生同源重组，整合至受体细胞基因组中并得到表达的一种外源DNA导入技术。
它是针对某个序列已知但功能未知的序列，改变生物遗传基因，令特定的基因功能丧失，从而使部分功能被屏蔽，并可进一步对生物体造成影响，进而推测出该基因的生物学功能。
目前能实现基因敲除的方法有：1.运用基因同源重组进行基因敲除(1)步骤方法A 构建基因载体：把目的基因和与细胞内靶基因特异片段同源的DNA 分子都重组到带有标记基因的载体上，使之成为重组载体，常用的标记基因有：neo 基因、TK 基因等。
根据实验目的不同，打靶载体分为全基因敲除、条件敲除、基因敲进、诱导性基因敲除等打靶载体。
B获得胚胎干细胞：现在基因敲除一般采用是胚胎干细胞，最常用的是鼠，而兔、猪、鸡等的胚胎干细胞也有使用。
基因敲除一般应用于鼠，常用的鼠的种系是129及其杂合体，因为这类小鼠具有自发突变形成畸胎瘤和畸胎肉瘤的倾向，是基因敲除的理想实验动物。
有些科研机构和单位已经运用C57BL/6遗传背景的小鼠的胚胎干细胞进行基因打靶，广泛运用于免疫学、神经学、癌症等领域。
C同源重组：将重组载体通过一定的方式(电穿孔法或显微注射)导入同源的胚胎干细胞(ES cell)中，使外源DNA 与胚胎干细胞基因组中相应部分发生同源重组，将重组载体中的DNA 序列整合到内源基因组中，从而得以表达。
一般来说，显微注射命中率较高，但技术难度较大，电穿孔命中率比显微注射低，但操作便利。
D筛选已表达的细胞：由于基因转移的同源重组自然发生率极低，因此要从众多细胞中筛出真正发生了同源重组的胚胎干细胞。
目前常用的方法有：正负筛选法(PNS法)、标记基因的特异位点表达法以及PCR 法，其中应用最多的是PNS法。
E 性状观察：通过观察重组小鼠的生物学形状的变化进而了解目的基因变化前后对小鼠的生物学形状的改变，达到研究目的基因的目的。
基因敲除的方法
基因敲除的方法
基因敲除是一种实验手段，通过干扰或删除某个基因来研究其对生物体的功能和表达的影响。
以下是常见的基因敲除方法：
1. RNA干扰（RNAi）：通过引入特定的双链RNA分子，可以在细胞中诱导RNA干扰复合物（RISC），使其与特定的mRNA序列结合并导致其降解或抑制翻译。
这种方法可以通过合成小分子RNA片段作为外源性RNAi分子，或者通过转染质粒表达RNAi分子来实现基因敲除。
2. 质粒介导的基因敲除：通过构建质粒载体，将基因的反义序列整合到质粒中，并将其导入到目标细胞中。
质粒中的反义序列可以与目标基因的mRNA互补配对，形成双链结构，从而抑制基因的翻译或引起mRNA降解。
3. CRISPR/Cas9系统：CRISPR（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats）/Cas9
（CRISPR-associated protein 9）系统是一种常用的基因敲除技术。
它利用Cas9酶与特定的单链RNA（sgRNA）结合，形成复合物，该复合物可以与目标基因的DNA序列互补配对，并导致DNA双链断裂。
当细胞修复这些断裂时，可能会引入错误的碱基，导致基因的敲除或功能丧失。
4. 胚胎干细胞敲除：通过基因敲除技术，可以在胚胎干细胞中敲除特定的基因，从而生成敲除该基因的小鼠模型。
这种方法可以用于研究特定基因的功能和生理学过程。
这些基因敲除方法可以在体外或体内进行，并根据具体研究需求
选择最适合的方法。
基因敲除
基因敲除技术(组图)一．概述：基因敲除是自80年代末以来发展起来的一种新型分子生物学技术，是通过一定的途径使机体特定的基因失活或缺失的技术。
通常意义上的基因敲除主要是应用DNA 同源重组原理，用设计的同源片段替代靶基因片段，从而达到基因敲除的目的。
随着基因敲除技术的发展，除了同源重组外，新的原理和技术也逐渐被应用，比较成功的有基因的插入突变和iRNA ，它们同样可以达到基因敲除的目的。
二．实现基因敲除的多种原理和方法：1．利用基因同源重组进行基因敲除基因敲除是80年代后半期应用DNA 同源重组原理发展起来的。
80年代初，胚胎干细胞（ES细胞）分离和体外培养的成功奠定了基因敲除的技术基础。
1985年，首次证实的哺乳动物细胞中同源重组的存在奠定了基因敲除的理论基础。
到1987年，Thompsson首次建立了完整的ES细胞基因敲除的小鼠模型[1]。
直到现在，运用基因同源重组进行基因敲除依然是构建基因敲除动物模型中最普遍的使用方法。
(1)利用同源重组构建基因敲除动物模型的基本步骤(图1)：①．基因载体的构建：把目的基因和与细胞内靶基因特异片段同源的DNA 分子都重组到带有标记基因(如neo 基因，TK 基因等)的载体上，成为重组载体。
基因敲除是为了使某一基因失去其生理功能，所以一般设计为替换型载体。
②．ES 细胞的获得：现在基因敲除一般采用是胚胎干细胞，最常用的是鼠，而兔，猪，鸡等的胚胎干细胞也有使用。
常用的鼠的种系是１２９及其杂合体，因为这类小鼠具有自发突变形成畸胎瘤和畸胎肉瘤的倾向，是基因敲除的理想实验动物。
而其他遗传背景的胚胎干细胞系也逐渐被发展应用。
[2，3]③．同源重组：将重组载体通过一定的方式(电穿孔法或显微注射)导入同源的胚胎干细胞(ES cell)中，使外源DNA 与胚胎干细胞基因组中相应部分发生同源重组，将重组载体中的DNA 序列整合到内源基因组中，从而得以表达。
一般地，显微注射命中率较高，但技术难度较大，电穿孔命中率比显微注射低，但便于使用。
基因敲除步骤范文
基因敲除步骤范文基因敲除通过删除或抑制目标基因来研究该基因的功能和作用。
以下是基因敲除的基本步骤：1. 设计RNA干扰（RNAi）或小分子干扰（siRNA）：-首先，需要了解目标基因的序列和结构。
可以使用基因组数据库来获取这些信息。
-设计能够特异性沉默目标基因的短RNA序列。
这些短RNA将会与目标mRNA的互补序列形成双链结构，并导致目标mRNA的降解或转译后调节。
- 确保设计的RNAi或siRNA具有足够的选择性，以避免对其他相关基因的影响。
2. 合成RNAi或siRNA：- 根据设计的RNAi或siRNA序列，可以使用化学合成方法合成RNAi或siRNA。
- 确保合成的RNAi或siRNA质量良好，并且没有污染物。
3.转染细胞或生物体：-使用的细胞系或生物体应该与目标基因相关，以确保敲除效果的有效性。
- 可以通过转染方法将合成的RNAi或siRNA导入细胞，如使用转染试剂或电穿孔。
4.分析基因沉默效果：- 在转染RNAi或siRNA后，需要进行一系列实验来分析基因的敲除效果。
-最常见的方法之一是实时定量PCR（qPCR），用于检测目标mRNA水平的降低。
- 另一种常用的方法是Western blot或免疫组织化学染色，用于检测目标蛋白质的水平。
5.分析表型变化：-基因敲除可能会导致细胞或生物体出现表型变化。
-可以使用细胞增殖、分化、凋亡等实验来分析这些表型变化。
-对于整个生物体，可以通过观察生物体级表型如外观、发育、行为等方面的变化来分析基因敲除的效果。
6.验证实验结果：-要验证基因敲除的效果，最好进行多个实验并使用不同的方法来检测目标基因的沉默。
-如果实验结果一致，可以得出结论基因敲除有效。
值得注意的是，基因敲除并不总是直接获得所需的结果。
有时候目标基因的功能可能是在特定的细胞或组织中发挥作用的，因此需要使用特异性的敲除方法。
另外，敲除一些基因可能导致细胞或生物体的死亡，所以在应用基因敲除的时候需要小心操作。
基因敲除方法和原理
基因敲除方法和原理标题：基因敲除方法和原理引言：基因敲除是分子生物学中常用的一种实验方法，通过破坏或删除目标基因，来研究该基因对生物体的功能和表型的影响。
本文将介绍基因敲除的方法和原理，以及其在基因功能研究和疾病治疗中的应用。
一、基因敲除的方法基因敲除的方法主要有两种：第一种是通过体细胞敲除，第二种是通过胚胎干细胞敲除。
1. 体细胞敲除体细胞敲除是在体细胞中敲除目标基因的方法。
其步骤主要包括：选择目标基因，构建敲除载体，将敲除载体导入体细胞，筛选敲除细胞，验证敲除效果。
（1）选择目标基因：根据研究的需要，选择一个具有重要功能或表型的基因作为目标基因。
（2）构建敲除载体：利用重组DNA技术构建含有目标基因敲除所需序列的敲除载体。
敲除载体通常包括两个关键元素：敲除片段和选择标记。
（3）将敲除载体导入体细胞：采用适当的方法，如转染或电穿孔等，将敲除载体导入体细胞中。
（4）筛选敲除细胞：利用选择标记，如抗生素抗性基因，筛选出成功发生基因敲除的细胞。
（5）验证敲除效果：通过PCR、Southern blot等方法验证基因敲除的效果。
2. 胚胎干细胞敲除胚胎干细胞敲除是在胚胎干细胞中敲除目标基因的方法。
其步骤主要包括：选择胚胎干细胞，构建敲除载体，将敲除载体导入胚胎干细胞，筛选敲除细胞，验证敲除效果。
（1）选择胚胎干细胞：选择具有胚胎干细胞特性的细胞作为研究对象。
（2）构建敲除载体：同样利用重组DNA技术构建含有目标基因敲除所需序列的敲除载体。
（3）将敲除载体导入胚胎干细胞：采用适当的方法，如电穿孔或病毒导入等，将敲除载体导入胚胎干细胞中。
（4）筛选敲除细胞：利用选择标记，如抗生素抗性基因，筛选出成功发生基因敲除的胚胎干细胞。
（5）验证敲除效果：通过PCR、Southern blot等方法验证基因敲除的效果。
二、基因敲除的原理基因敲除的原理是通过破坏或删除目标基因，使其无法正常表达或产生功能缺陷，从而观察其对生物体的影响。
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• 这个奇怪的现象直到3年后1998才被解开———华盛顿卡耐基研 究院的Andrew Fire和马萨诸塞大学癌症中心的Craig Mello首 次将双链dsRNA———正义链和反义链的混合物注入线虫,结果 诱发了比单独注射正义链或者反义链都要强得多的基因沉默。 将制备的RNA高度纯化后发现，正义RNA无基因抑制作用，反义 RNA的基因抑制作用也很微弱，而用纯化后的dsRNA注入线虫， 却能高效、特异地阻断相应基因的表达 。实际上每个细胞只要 很少几个分子的双链在线虫中注入双链ＲＮＡ不单可以阻断整个线 虫的同源基因表达,还会导致其第一代子代的同源基因沉默。他 们将这种现象称为dsRNA介导的RNA干扰（RNAi）。 • 并证明了Guo和kemphues所发现的正义RNA的基因压制作用其实 是转录时污染微量dsRNA所造成的。
反义链组成的小干扰RNA（small interfering RNA，
siRNA）。
r
RNAi过程的功能单元：siRNA
• siRNA的两条单链末端为5’－磷酸和3’－羟基，且3’端
均有２~3个突出的核苷酸。果蝇中的RNaseⅢ核酸酶
称为Dicer。
19 nt duplex
2 nt 3’ overhangs
四、RNAi研究的一般技术路线
目的基因mRNA序列分析 设计siRNA序列 正义RNA和反义RNA的合成 构建转基因载体 转入受体细胞 检测基因抑制结果
存在的问题
目前siRNA导入胞内的效率低下，如何有效将siRNA转移 入体内成为RNAi应用的最大障碍； 如何在目的基因序列上选择21-23nt左右的序列作为 siRNA 的模板，从目前的研究来看，序列的选择原则尚不 清楚； 目前RNAi 机制尚未完全阐明，尤其在哺乳动物细胞中的 研究报道不多。 siRNA的稳定性 在多基因家族中的非特异性问题 如何将RNAi技术运用到临床试验
基因敲除
基因敲除一、基因敲除简介基因敲除是上个世纪90年代出现的最新外源DNA导入技术。
基因敲除是基因打靶技术的一种，类似于基因的同源重组。
指外源DNA与受体细胞基因组中序列相同或相近的基因发生同源重组，从而代替受体细胞基因组中的相同/相似的基因序列，整合入受体细胞的基因组中。
此法可产生精确的基因突变，也可正确纠正机体的基因突变。
二、基因敲除的方法及原理1．利用基因同源重组进行基因敲除：是构建基因敲除动物模型中最普遍的使用方法。
把目的基因和与细胞内靶基因特异片段同源的DNA分子都重组到带有标记基因（如：neo基因）的载体上，成为重组载体。
将重组载体通过一定的方式（如显微注射）导入同源的胚胎干细胞（EScell）中，使外源DNA 与胚胎干细胞基因中相应的部分发生同源重组。
将重组载体中的DNA序列整合到内源基因组中，从而得以表达。
动物的重组概率为10-2~10-5，植物的概率为10-4~10-5，如何从众多细胞中筛出真正发生了同源重组的胚胎干细胞非常重要。
目前常用的方法是正负筛选法(PNS法)，标记基因的特异位点表达法以及PCR 法。
其中应用最多的是PNS法。
通过观察嵌和体小鼠的生物学形状的变化进而了解目的基因变化前后对小鼠的生物学形状的改变，达到研究目的基因的目的。
由于同源重组常常发生在一对染色体上中一条染色体中,所以如果要得到稳定遗传的纯合体基因敲除模型，需要进行至少两代遗传。
例题(18分）1. 基因敲除自20世纪80年代末发展起来，是通过一定的途径使机体特定的基因失活或缺失的技术，下图是基因敲除技术之一的示意图：该技术的主要步骤及应用如下：（1）第一步是构建打靶载体，把2个标记基因（新霉素抗性基因neo和单纯疱疹病毒胸苷激酶基因HSV - TK）插入到含目的基因（与待敲除的基因同源）的载体中，使目的基因__________。
（2）第二步是将打靶载体通过________________技术导入ES细胞中，失活的目的基因替换ES细胞染色体上待敲除的基因，以达到基因敲除的目的。
基因敲除载体导入胚胎干细胞的常用方法
基因敲除载体导入胚胎干细胞的常用方法嘿，朋友们！今天咱就来唠唠基因敲除载体导入胚胎干细胞的常用方法。
咱先说说电穿孔法吧，这就好比是给细胞来一场“闪电战”！通过短暂而强烈的电击，让基因敲除载体像闪电一样“嗖”地钻进胚胎干细胞里。
你说神奇不神奇？这就像是给细胞开了个特别通道，让那些载体能快速地进去安营扎寨。
还有病毒介导法，就好像是让病毒这个“小快递员”帮忙送基因敲除载体进去。
病毒可是很会钻空子的家伙，它能带着载体轻松地进入细胞，然后把载体放下。
不过可别小看了这个“小快递员”，得小心它会不会捣乱哦！化学转染法也挺有意思，就像是给细胞喂了一颗“魔法药丸”。
这颗药丸能让细胞变得更容易接受基因敲除载体，然后载体就顺顺利利地进去啦。
是不是很像变魔术一样？脂质体介导法呢，就像是给基因敲除载体包上了一层“保护衣”，让它能更安全地进入胚胎干细胞。
这层“保护衣”就像个护盾，护送着载体到达目的地。
这些方法各有各的特点和用处，就看咱怎么根据实际情况来选择啦。
你想想，如果咱能熟练掌握这些方法，那在研究基因的世界里不就如鱼得水了嘛！那能解开多少基因的秘密呀，能给医学和生物学带来多大的进步呀！咱不就能更好地了解生命的奥秘了嘛！比如说，要是能通过这些方法搞清楚某些疾病的基因根源，那咱不就能更好地治疗这些疾病了嘛！这可不是小事呀，这是能拯救好多生命的大事呢！或者说，通过研究基因，咱能让农作物长得更好，产量更高，那对咱的生活影响可就大啦！所以说呀，基因敲除载体导入胚胎干细胞的常用方法可真是太重要啦！咱得好好研究，好好利用，让它们为咱的科学研究和生活带来更多的好处和惊喜！别小瞧了这些方法，它们可是打开基因奥秘大门的钥匙呢！咱可得紧紧握住这把钥匙，去探索那神秘而又充满无限可能的基因世界呀！。
细菌基因敲除方法和原理
细菌基因敲除方法和原理
细菌基因敲除，哇塞，这可是个超厉害的技术呢！那它到底咋搞呢？首先呢，得选好要敲除的基因。
这就好比在一堆宝藏里挑出你不想要的那个宝贝。
然后呢，设计合适的敲除工具，就像给战士选一把称手的武器。
接着，把这个工具导入细菌里，让它发挥作用，就像派个小特工去完成任务。
在这个过程中，有啥要注意的呢？那可不少！得保证工具的准确性呀，不然敲错了基因可就麻烦啦！还得注意细菌的状态，要是细菌状态不好，那可就像一个生病的战士，没法好好打仗。
那这个过程安全不？稳定不？嘿，一般来说，如果操作得当，还是挺安全稳定的呢！就像走在一条铺好的小路上，只要你不瞎折腾，基本不会有啥大问题。
这技术有啥应用场景和优势呢？哎呀呀，那可多了去了！可以研究细菌的特定功能，就像解开一个神秘的密码。
还能用来开发新的抗菌药物，哇，这多厉害！优势嘛，精准度高呀，能直接针对特定基因下手，就像狙击手瞄准目标。
咱来看看实际案例呗！比如说，有研究人员通过基因敲除研究了某种细菌的致病机制，结果发现了关键基因，为治疗相关疾病提供了新思路。
这效果，杠杠的！
细菌基因敲除就是这么牛！它能让我们更深入地了解细菌，为科学研究和医学发展做出巨大贡献。
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差异蛋白点过多，测序片段随机且过短，氨基酸→碱基序列简并 性过高
高通量基因芯片（诺丁汉大学—陆春贵博士）：
差异性状---基于已知序列---高通量表达差异分析---确定大量关 联基因---新基因---价格昂贵---数据分析处理复杂
图位克隆
群体至关重要---工作量超大---获得基因随机---仍是王道
RNAi能达到基因敲除的效果。
三、RNAi的作用机制
基因沉默
基因沉默分为转录水平的基因沉默(Transcriptional Gene
Silencing, TGS) 和转录后水平的基因沉默(Post-transcriptional
Gene Silencing, PTGS)两种：
TGS是指转基因在细胞核内RNA 合成受到了阻止而导致基因
四、RNAi研究的一般技术路线
目的基因mRNA序列分析 设计siRNA序列 正义RNA和反义RNA的合成 构建转基因载体 转入受体细胞 检测基因抑制结果
存在的问题
目前siRNA导入胞内的效率低下，如何有效将siRNA转移 入体内成为RNAi应用的最大障碍； 如何在目的基因序列上选择21-23nt左右的序列作为 siRNA 的模板，从目前的研究来看，序列的选择原则尚不 清楚； 目前RNAi 机制尚未完全阐明，尤其在哺乳动物细胞中的 研究报道不多。 siRNA的稳定性 在多基因家族中的非特异性问题 如何将RNAi技术运用到临床试验
• 2011年《Nature》杂志将TALEN技术列为 年度技术，2012年的《Science》杂志则将 其列入了年度十大科技突破，针对该文的 评论更是给予它基因组的巡航导弹技术的 美誉。
沉默；对于部分植物来说，转基因引发的基因沉默可能是因为基 因特异的甲基化而导致;
PTGS 则是指转基因能够在细胞核里被稳定地转录，但在细
胞质里却无相应的mRNA存在这一现象。目前普遍认为RNAi、共
抑制、quelling均属于PTGS！
dsRNA介导的同源性靶mRNA降解 过程
第一步（起始阶段）是较长ds RNA在ATP参与下 被RNaseⅢ特异核酸酶切割加工成21~23nt的由正义和
上对反义RNA技术的解释正好相反
反义RNA技术
• 反义RNA是指与mRNA互补的RNA分子，也包括与其它RNA互
补的RNA分子。
• 由于核糖体不能翻译双链的RNA，所以反义RNA与mRNA特异
性的互补结合, 即抑制了该mRNA的翻译。通过反义RNA控制
mRNA的翻译是原核生物基因表达调控的一种方 式，最早是在 E.coli 的产肠杆菌素的Col E1质粒中发现的，许多实验证明在真 核生物中也存在反义RNA。
5.完美基因靶向操作： 识别特异DNA序列结构+操作DNA的酶
划时代的基因靶向操作技术： TALE与 CRISPR/Cas9使靶向操作不再是梦 我们不再大海捞针！！！
RNA干扰技术
RNA干扰（RNA interference, RNAi）是指在进化过程中高 度保守的、由双链RNA（double-stranded RNA，dsRNA）诱 发的、同源mRNA高效特异性降解的现象。是真核生物中存在 的一种抗病毒入侵、抑制转座子活动、调控基因表达的监控 机制，具有重大生物学意义。 RNAi技术被《Science》杂志评为2001年的十大科学进展之 一，并名列2002年十大科学进展之首。由于使用RNAi技术可 以特异性剔除或关闭特定基因的表达，所以该技术已被广泛 用于探索基因功能和传染性疾病及恶性肿瘤的基因治疗领域 。 2006年，安德鲁·法厄与克雷格·梅洛（Craig C. Mello） 由于在RNAi机制研究中的贡献获得诺贝尔生理及医学奖。
确定基因 功能互补实验
转基因过表达、基因敲除
基因敲除专题
基因敲除概述 基因敲除(knockout)是一种遗传工程基因修 饰技术，针对某个感兴趣的遗传基因，通过一定 的基因改造过程，令特定的基因功能丧失，并研 究可能进一步对相关生命现象造成的影响，进而 推测该基因的生物学功能。 基因敲除是基因打靶技术的一种，类似于基 因的同源重组。指外源DNA与受体细胞基因组中 序列相同或相近的基因发生同源重组，从而代替 受体细胞基因组中的相同/相似的基因序列，整 合入受体细胞的基因组中，达到定点修饰或改造 染色体上某一基因的目的。
图位克隆策略
寻找性状差异 选择父母本 杂交-F1
或突变体
差异显著（最好其他性状差异较小） 不分离 性状分离 单粒传
自交
构建群体 表型统计
分子标记 软件分析初步定位
回交-扩大群体
SSR等
选
叠连克隆群 染色体步移
目标基因连锁的分子标记
外显子的分离、鉴定
体内蛋白水平 验证
如何获取基因
同源克隆：
已知基因序列比对---保守区---简并引物设计---未知物种中分离 ---RACE获得全长---结构解析---表达分析---功能比较与验证等
优点：简单，短平快 局限：过于简单，技术含量低，非新基因，文章水平相对较低 后续试验内容需增加
蛋白差异分析： 性状差异---双向电泳---蛋白点分离---氨基酸组成分析---序列 端部分析---DNA信息
反义RNA技术
• 根据反义RNA的作用机制可将其分为3类： • Ⅰ类反义RNA直接作用于靶mRNA的S D序列(ShineDalgarno sequence）和(或)部分编码区，直接抑制 翻译，或与靶mRNA结合形成双链RNA，从而易被RNA酶 Ⅲ 降解 • Ⅱ类反义RNA与mRNA的非编码区结合，引起mRNA构象 变化，抑制翻译； • Ⅲ类反义RNA则直接抑制靶mRNA的转录。
基因敲除的方法
同源重组敲除技术 条件性基因敲除法 诱导性基因敲除法 锌指核酸酶(ZFNs)技术 RNA干扰技术 TALEN技术 CRISPR-Cas9技术
生物学家的梦想：随心所欲地操作基因
经典基因操作： 1. Gene trap: 化学诱变； 转座子--------海量的筛选+good Luck 2. 同源重组：一般物种几率低, 10-6 ； ES cell 10-2 难！ 3.突破性的发现： RNAi-Knockdown; 不完全敲除，临时性。 4.充满梦想却幻灭的ZFN： • 难以完全找到匹配的3连子锌指； • Off-target 严重。 美国加州大学Dave Segal教授说： “ With zinc fingers, we have to let the DNA tell us where we target”
RISC由siRNA、解 旋酶、ATP、核酸内 切酶、核酸外切酶等 多种成分组成。
Dicer
第一步
RISC
碱基互补
酶解
第二步
RNAi的放大效应机制
• siRNA不仅可引导RISC切割靶mRNA，而且可以以siRNA 作为引物在RNA依赖的RNA聚合酶(RdRP)作用下以靶 mRNA为模板合成新的dsRNA ，它在Dicer酶的作用下也 被裂解，生成大量的次级siRNA。形成一种链式反应 ，使特定的基因表达被阻止。
TALE的发现迅速成为科技最前沿
TALEN技术形成的关键研究
Sugisaki Hiroyuki 发现FokI核酸酶 （1981）
Jens Boch 破译TALE序列 （2009）
Daniel F. Voytas Adam J.Bogdanove 将TALE DNA结合motif与FokI核酸酶融 合，推出与ZFN同类型的双链DNA剪刀， 称之为TALEN。(2011)
被抑制。开始这被认为是矮牵牛特有的怪现象。
然而，并非只有植物学家才注意到了这种意外的现象。 意大利的Cogoni等,将外源类胡萝卜素基因导入链孢
霉(Neurosporacrassa),结果转化细胞中内源性的类
胡萝卜素基因也受到了抑制。而在真菌转基因实验中
这种共抑制现象被称为“quelling”现象。
第二步（效应阶段）是siRNA 在ATP参与下被RNA
解旋酶解旋成单链，并由其中反义链指导形成RNA诱
导的沉默复合体(RNA-induced silencing complex，
RISC)。在ATP酶的作用下，活化的RISC以单链
siRNA为向导识别同源性的单链靶mRNA，并在距离 RISC的3’端11个碱基位置切割靶mRNA，导致靶基 因的沉默。
生命科学研究进展 基因功能研究之基因敲除技术
生物科学技术学院 郭志富 2014年11月21日
前
什么是基因？
言
为什么要研究基因？
如何研究？
原核体外表达
蛋白质功能 体外鉴定 转基因 进一步验证 表达规律-qPCR Western blotting
真核过表达 位置—分类--结构—功能 基因敲除
定量表达
反义链组成的小干扰RNA（small interfering RNA，
siRNA）。
r
RNAi过程的功能单元：siRNA
• siRNA的两条单链末端为5’－磷酸和3’－羟基，且3’端
均有２~3个突出的核苷酸。果蝇中的RNaseⅢ核酸酶
称为Dicer。
19 nt duplex
2 nt 3’ overhangs
一ch Jorgensen和其同事,在对矮牵牛(petunias)进行
研究中有个奇怪的发现:将一个能产生红色素的基因置于一个强启
子后,导入矮脚牵牛中,试图加深花朵的紫颜 色,结果没看到期待中的深紫色花朵,多 数花成了花斑的甚至白的。Jorgensen 将这种现象命名为 共抑制现象(cosuppression), 因为导入的基因和其相似的内源基因同时都
• 这个奇怪的现象直到3年后1998才被解开———华盛顿卡耐基研 究院的Andrew Fire和马萨诸塞大学癌症中心的Craig Mello首 次将双链dsRNA———正义链和反义链的混合物注入线虫,结果 诱发了比单独注射正义链或者反义链都要强得多的基因沉默。 将制备的RNA高度纯化后发现，正义RNA无基因抑制作用，反义 RNA的基因抑制作用也很微弱，而用纯化后的dsRNA注入线虫， 却能高效、特异地阻断相应基因的表达 。实际上每个细胞只要 很少几个分子的双链ＲＮＡ已经足够完全阻断同源基因的表达 。 • 后来的实验表明在线虫中注入双链ＲＮＡ不单可以阻断整个线 虫的同源基因表达,还会导致其第一代子代的同源基因沉默。他 们将这种现象称为dsRNA介导的RNA干扰（RNAi）。 • 并证明了Guo和kemphues所发现的正义RNA的基因压制作用其实 是转录时污染微量dsRNA所造成的。