MTT法检测RAW264_7细胞活力及可能因素分析

白生宾 １，陈红香 ３，钟近洁 １，冯树梅 １，李 甜 １，罗学港 ２
（１ ．新疆医科大学基础医学院 组胚教研室，新疆 乌鲁木齐 ８３００１ １ ；２．中南大学湘雅医学院 人体解剖与神经生物学系，湖南 长沙 ４１ ００１ ３；３．新疆维吾尔自治区人民医院 妇科， 新疆 乌鲁木齐 ８３０００１）
摘要：目的 通过 Ｍ Ｔ Ｔ 法检测 Ｒ Ａ Ｗ ２６４．７ 细胞活力并绘制生长曲线，探讨 Ｍ Ｔ Ｔ 作用环节中的可能影响
关键词： Ｍ Ｔ Ｔ ；Ｒ Ａ Ｗ ２６４．７；活力；因素分析
中图分类号：Ｑ ２－ ３３
文献标识码：Ａ
RAW264.7 cell viability via MTT assay and possible factor analysis*
BAI Sheng-bin1, CHEN Hong-xiang3, ZHONG Jin-jie1, FENG Shu-mei1, LI Tian1, LUO Xue-gang2
0
空白组
12
24
36
48
时间（h）
图 ２ 无血清培养 Ｒ Ａ Ｗ ２６４．７ 细胞的生长曲线
吸光度值
wk.baidu.com
培养天数
图 ３ Ｒ Ａ Ｗ ２６４．７ 细胞的生长曲线
DMSO 溶解后放置不同时间，OD 值的变化以及 孔板盖子对 OD 值的影响。将对数生长期 RAW264. 7 细胞，以 2×105 种植于 96 孔板，DMSO 溶解后，将 细胞移入另一 96 孔板，分别在不同时间进行比色， 并将 96 孔板盖子盖上和去掉，所得结果显示，DMSO 溶解后 0~48 h 内，OD 值结果差异没有统计学意义 （P >0.05）；3~30 d，OD 值结果与 0 h 组比较，差异有 统计学意义（P <0.05）。加盖前后 OD 值比较，差异没
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第 23 期
白生宾，等：MTT 法检测 RAW264.7 细胞活力及可能因素分析
附表 ９６ 孔板盖子对 Ｏ Ｄ 值的影响比较 （x±s）
分组 加盖组 去盖组
0h 0.918±0.022 0.859±0.016
6h 0.923±0.024 0.867±0.029
12 h 0.915±0.019 0.860±0.029
照片见图 1。取对数生长期的 RAW264.7 细胞，以 2×105 种植于 96 孔板，脱离血清进行培养观察 48 h 内细胞生长情况，生长曲线如图 2 所示；另取对数生 长期的 RAW264.7 细胞，以 5×104 种植于 96 孔板， 10%的血清正常培养 8 d，每 2 天换液 1 次，记录 OD 值，描绘生长曲线，见图 3。
Abstract: 【Objective】 To draw RAW264.7 cell growth cureve assay cell viability via MTT method. Find possible affective factor and optimalize experimental methods. 【Methods】Note the OD value in the different time using normal RAW264.7 cell culture and discard serum RAW 264.7 cell culutre methods. Write these data after 6 h, 12 h, 24 h, 48 h, 3 day, 15 day and 30 days. 【Results】the OD value is not obviously be－ tween group comparison (P >0.05) when time is from 0 hour to 48 hours. The OD value is obviously between group comparison (P <0.05) when time is more than 3 days. 【Conclusions】 Verification and drawing RAW264.7 cell growth curve. 96 well plate cover can increase OD value and affect OD data. When time is not more than 48 hours OD value is stable and experimental results are reliable.
24 h 0.887±0.029 0.825±0.028
48 h 0.865±0.025 0.804±0.031
3d 0.723±0.031覮 0.673±0.037覮
15 d 0.401±0.018覮 0.359±0.015覮
30 d 0.296±0.021覮 0.243±0.011覮
注：覮 与 0 h 组相比，P <0.05
因素，优化实验方案。方法 以对数生长期的 Ｒ Ａ Ｗ ２６４．７ 细胞为实验对象，分别用正常培养和脱离血清培养
法，记录在不同时间点的 Ｏ Ｄ 值。并在加入 Ｄ Ｍ ＳＯ 后，分别在 ６、１２、２４ 和 ４８ ｈ 及 ３、１５ 和 ３０ ｄ 进行 Ｏ Ｄ 值测
量。结果 加入 Ｄ Ｍ ＳＯ 后不同时间点的 Ｍ Ｔ Ｔ 法检测结果，随着时间的延长，结果差异越来越大，超过 ３ ｄ 后影
收稿日期：2010- 12- 01 *基金项目：国家自然科学基金资助项目（No：30860249） [通信作者] 钟近洁，E- mail: zhongjinjie@sina.com
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中国现代医学杂志
第 21 卷
体琥珀酸脱氢酶反应，在细胞增殖、分化以及与细胞 代谢有关的免疫学实验中有非常广 泛的应用[1-2]。 RAW264.7 细胞是一种很好的破骨细胞的前体细 胞，可以诱导分化为成熟的破骨细胞[3]。在其实际应 用中发现存在较多的影响因素，其中在 MTT 的检测 过程中，加入 DMSO 的时间是否对实验结果有一定 的影响，国内外尚无详细报道和阐述。笔者课题组 以 RAW264.7 细胞为实验对象进行比较分析，为今 后改进实验，完善实验结果，优化实验方法，开展后 续的 细 胞 实 验 提 供 一定的实验依据，打下良好的 基础。
笔者认为，当受试细胞在进行 MTT 实验时，首 先需要对种植细胞的浓度进行计数，最好选择在 1×104~2×105 的细胞数比较合适，对实验中检测和 绘制细胞生长曲线以及细胞活力等试验指标影响较 小。另外，即将检测的细胞应当用锡箔纸包裹，室温 下避光保存。在进行 MTT 检测时，如果疏忽没有将 盖子取下来，所测得的 OD 值，要比正常测量的值要 高很多，这可能与盖子影响到了透光度有关。
第 21 卷第 23 期 2011 年 8 月
中国现代医学杂志 China Journal of Modern Medicine
Vol. 21 No.23 Aug. 2011
文章编号： １００５－ ８９８２（２０１１）２３－ ２８３１－ ０３
·论著·
MTT 法检测 RAW264.7 细胞活力及可能因素分析*
采用 SPSS 11.0 统计软件行方差分析，检验水 准α=0.05。
２ 结果
处于生长期的 RAW264.7 细胞在倒置显微镜下
A 倒置显微镜下 RAW 细胞 B 普通光镜下 HE 染色 RAW 细 胞 图 １ Ｒ Ａ Ｗ 细胞
OD 值
1.100 1.000 0.900 0.800 0.700 0.600 0.500 0.400 0.300
有统计学意义（P >0.05），但是加盖后 OD 值相对值 要增大0.06~0.07，对最终结果有一定的影响。见附表。
３ 讨论
众所周知，MTT 是一种显色剂，可以检测细胞 存活和生长[4- 6]。它的作用原理都已经很清楚，活细 胞内的琥珀酸脱氢酶还原 MTT 形成蓝色的结晶物， 与细胞数成正比，采用 Biotek Elx800 酶标仪在 490 nm 处测其吸光度，可间接反应活细胞的数量。但是， 当反应体系中存在影响细胞生长的因素时，常会影 响实验结果造成实验数据的偏差[7-9]。在 MTT 比色法 实验操作结尾时，要进行 OD 值测量时，也可能会存 在误差，或因时间选择等问题造成数据偏差或错误。 在实验中，操作者处理完孔板内的细胞后，通过 2 种 方式将细胞移出放入酶标仪进行测量，通常用 DMSO 完全溶解后，全部移入相同孔数的板子，直接进 行测量；另一种，有一次性酶标仪转移板，也可直接 移入进行测量。如果能够实时测量且工作量较少，则 可以进行，不会影响测量结果。考虑到药物剂量的筛 选、细胞毒性试验的测定等批量工作，设想能将不同 作用时间的细胞和不同作用的细胞数量在某个剂量 下，既能同时检测，又能反映出细胞的活力，而且不 影响实验结果。
取对数生长期的 RAW264.7 细胞，分别以 5× 104 和 2×105 种植于 96 孔板，分别在不同时间，加 MTT，一般每孔 200μL 培养基加入 20μL MTT（5 mg/mL），37℃培养箱内继续孵育 4 h，血清浓度尽量 不高于 10%，最好在加 MTT（5 mg/mL）前换成无血 清的培养基，呈色，比色。RAW264.7 细胞是贴壁细 胞，小心吸出培养上清液，每孔加入 100μL DMSO， 使结晶物充分溶解，选择 490 nm 波长测定，在酶标 仪上测定各孔数值，记录结果，以时间为横坐标，吸 光值为纵坐标绘制细胞生长曲线。 １．３ 统计学处理
响较大，与对照组比较，差异具有统计学意义（Ｐ ＜ ０．０５）。３ ｄ 内，与对照组比较，差异没有统计学意义（Ｐ ＞ ０．０５）。
结论 ①验证、测量并绘制 Ｒ Ａ Ｗ ２６４．７ 的生长曲线；②加盖后影响透光度，增大了 Ｏ Ｄ 值，影响了实验结果；③
随着 Ｄ Ｍ ＳＯ 时间的延长以第 ３ 天为限，否则影响实验结果。
Key words: MTT; RAW264.7; viability; factor analysis
MTT 是一种四唑盐，经线粒体琥珀酸脱氢酶裂 解后生成 formazan，formazan 的生成量与细胞释放出
的酶活性成正比例，而酶活力与细胞数及细胞活力 成比例。MTT 酶促显色反应主要用于定量分析线粒
１ 材料和方法
１．１ 材料 细胞株：小鼠破骨前体细胞 RAW264.7（ATCC
TIB- 71），DMEM 培养基（美国 Gibco 公司），胎牛血 清 （杭州四季青公司），Forma 3131 型 CO2 培养箱 （美国），倒置相差显微镜 CK41（Olympus 公司），超 净工作台 （上海博讯实业有限公司），超纯水仪 （Elix3+Mill- GB，法国 Milipo 二公司），坐式自动电热 压力蒸汽灭菌器（ZDXX- 35BI 型，上海），电子分析 天平（BP221S，美国），低温高速离心机（HC- 3018R， 中 国），MTT （Amresco 分 装） 溶 解 于 PBS 中 ，5 mg/mL，抽滤除菌备用，二甲基亚砜（DMSO）（国产分 析纯），BioTek ELx800 全自动酶标仪 （美国 BioTek 公司） １．２ 方法
总之，MTT 比色法操作虽然简单，但是影响其 测 定 结 果 的 因 素 却 较多，在细胞的准备、种植、培 养等初期都非常重要，MTT 液体的配置，加入后孵 育，DMSO 的剂量，直至最后放入酶标仪后的比色， 放置时间的长短，波长的选定，等等，同样对实验者
(1.Department of Histology and Embryology, Xinjiang Medical University, Urumqi Xingjiang 830011, P.R. China; 2.Department of Anatomy & Neurobiology, Xiangya School of Medicine, Central South University, Changsha Hunan 410013, P.R. China; 3.Department of Gynecology, the Peoples’Hospital of Xinjiang Autonomous Region, Urumqi Xingjiang 830011, P.R. China)