MTT法检测RAW264_7细胞活力及可能因素分析

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mtt法检测细胞活性实验报告

mtt法检测细胞活性实验报告MTT法检测细胞活性实验报告细胞活性是评估细胞健康和功能的重要指标。

在细胞培养实验中，MTT法被广泛应用于评估细胞的存活率和代谢活性。

本实验旨在通过MTT法检测细胞活性，探究不同处理条件对细胞的影响，并分析实验结果。

实验材料和方法：1. 细胞培养：选取人类肺癌细胞株A549作为实验对象，通过传代培养维持细胞的生长状态。

2. 细胞处理：将A549细胞均匀分配到不同处理组，包括对照组和实验组。

实验组根据需求添加不同浓度的药物处理，对照组则不添加药物。

3. MTT法测定细胞活性：将处理后的细胞悬液均匀分配到96孔板中，每组设置3个孔位。

加入MTT溶液，孵育一定时间后，加入溶解液，最后测定吸光度。

实验结果：通过MTT法测定细胞活性，我们得到了以下结果。

1. 实验组A：添加药物A处理的细胞活性明显下降。

随着药物A浓度的增加，细胞存活率呈现逐渐下降的趋势。

最高浓度的药物A处理组，细胞存活率仅为对照组的30%。

2. 实验组B：添加药物B处理的细胞活性呈现剂量依赖性下降。

低浓度的药物B处理组，细胞存活率与对照组相近。

高浓度的药物B处理组，细胞存活率显著下降，仅为对照组的50%。

3. 实验组C：添加药物C处理的细胞活性呈现非线性变化。

低浓度的药物C处理组，细胞存活率略高于对照组。

中等浓度的药物C处理组，细胞存活率降低，但仍高于对照组。

高浓度的药物C处理组，细胞存活率显著下降，仅为对照组的40%。

讨论与分析：根据实验结果，我们可以得出以下结论。

1. 药物A对A549细胞具有明显的抑制作用。

随着药物A浓度的增加，细胞存活率逐渐降低，表明药物A可能具有抗肿瘤活性。

然而，高浓度的药物A处理组细胞存活率仅为30%，可能存在细胞毒性作用。

2. 药物B对A549细胞的影响呈现剂量依赖性。

低浓度的药物B处理组细胞存活率与对照组相近，可能对细胞没有明显影响。

然而，高浓度的药物B处理组细胞存活率下降，表明药物B可能对细胞产生抑制作用。

MTT法检测细胞活力精讲

耐药性机制研究
通过MTT法可以研究肿瘤耐药性的机制，了解耐药相关基因和蛋白的表达及功能。
逆转耐药性
MTT法可用于筛选能够逆转肿瘤耐药性的药物或分子，提高肿瘤治疗的疗效。
注意事项与局限性
01
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实验条件控制
细胞状态与培养时间
干扰因素
仅适用于贴壁细胞
MTT法的实验条件需严格控制，以确保实验结果的准确性和可靠性。
细胞类型特异性
MTT法在不同类型的细胞中表现出不同的敏感性，可用于研究不同细胞类型的毒性特征。
细胞凋亡检测
通过MTT法可以检测细胞凋亡的发生，了解凋亡相关基因和信号通路的活性。
在肿瘤耐药性研究中的应用
肿瘤耐药性评估
MTT法可用于评估肿瘤细胞对化疗药物的耐药性，为制定有效的治疗方案提供依据。
通过MTT法可以研究药物的作用机制，了解药物对细胞生长、增殖和凋亡等方面的影响。
药物浓度与细胞毒性关系
通过MTT法可以观察不同浓度的药物对细胞活力的影响，从而确定药物的毒性阈值和安全使用范围。
在细胞毒性研究中的应用
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细胞毒性评估
MTT法可用于评估不同因素对细胞造成的毒性作用，如化学物质、辐射、病毒等。
80%
细胞毒性评估
通过比较给药组与对照组的OD值，可评估药物的细胞毒性。OD值降低表明药物对细胞活力产生负面影响。
02
mtt法的操作步骤
细胞培养与样品准备
细胞培养
选择适宜的细胞系，在适宜的培养条件下进行细胞培养，确保细胞生长旺盛、状态良好。
样品准备
将待检测的细胞样品离心，去除培养液，并用磷酸盐缓冲液清洗细胞，去除残留的培养液。

MTT法检测细菌细胞数的主要影响因素分析_吴窈画

标准菌株 E． coli ATCC 25922 P． aeruginosa ATCC BAA427 S． pneumoniae ATCC 6305 B． fragilis ATCC 25285
1． 1． 1
菌株由 ATCC 引进的实验菌株包括大肠埃希菌（ Escherichia coli，ATCC 25922 ）、铜绿假
1． 2． 3
脂（ TSA，含或不含 5% 羊血）、脑心浸液液体培养（ BHI ）（ BHIA ，基和脑心浸液琼脂含 5% 羊血）。 1． 1． 3 主要试剂 5 mg / mL MTT 溶液［6］（取 100 mg MTT 溶于 20 mL pH 7． 4 的 0． 01 mol / L PBS 缓 4 ℃ 避光保存）、冲液中，充分溶解后过滤除菌，三
［25 ］，性试验、肿瘤放射敏感性测定以及微生物活［67 ］。菌计数微生物学用于细菌计数的常规方法
基金项目：国家科技型中小企业技术创新基金（ 08C26213200567 ）作者简介：吴窈画女，硕士，工程师。研究方向为微生物样本采集和传递技术。 Tel： 02586200378 ， Email： wuyh@ citotest． com． cn 0425 ；修回日期： 20110522 收稿日期： 2011-
同时进行平板菌落计数法测定：对测试样品进行 10 倍梯度稀释，取各梯度菌液分别做活菌平板培养计数。 1． 2． 2 还原反应时间和 MTT 剂量分析取 4 种病原菌对数生长期的纯培养物（各菌株所用培养
［10 ］基及培养条件如表 1 ），于适量 0． 90% NaCl 中 9 分别制成约 3． 0 × 10 cfu / mL 细菌悬液，连续 3 倍

MTT法检测细胞活性的操作方法

MTT法检测细胞活性的操作方法一、MTT是什么MTT是一种粉末状化学试剂，全称为3-(4,5)-dimethylthiahiazo (-z-y1)-3,5-di-phenytetrazoliumromide，汉语化学名为3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐，商品名：噻唑蓝。

是一种黄颜色的染料。

二、MTT法用来做什么简单地说：是一种检测细胞存活和生长的方法。

MTT主要有两个用途1．药物（也包括其他处理方式如放射线照射）对体外培养的细胞毒性的测定；2．细胞增殖及细胞活性测定。

三、为何MTT可以用来做上述工作检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒（Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。

二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的甲瓒，用酶标仪在490nm波长处测定其光吸收值，在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。

根据测得的吸光度值（OD值），来判断活细胞数量，OD值越大，细胞活性越强（如果是测药物毒性，则表示药物毒性越小）。

四、实验所需材料1．MTT 溶液的配制通常MTT 配成的终浓度为5mg/ml,须用PBS 或生理盐水做溶剂。

市面上一般MTT的包装为100mg,250mg或1g。

1.1对于100mg这样的小包装，厂家都是将MTT放入小管中的，个人建议不要再用天平称量分装，而应该一次性将其全配制成溶液，如100mg用20mlPBS来溶解。

具体做法：预先在50ml离心管（没有的话，可用培养瓶替代）加入20ml PBS，从中先吸取500-1000ul PBS装入含MTT的小管中，吹打若干次后将其移入50ml离心管，然后再混匀。

可以重复几次，以使小管中的MTT不残留于管内。

将MTT 完全混匀后，用0.22μm滤膜过滤以除去溶液里的细菌，分装避光(避光袋或是黑纸、锡箔纸包住)可长期保存于-20度。

按细胞培养板每孔需加10ul计算，一般每96孔板约需1ml，所以分装时可考虑每管分装1ml。

细胞学堂RAW264.7分化问题全攻略

不规则形（圆形、短梭形）
DMEM＋10% FBS＋1% P/S 气相：95%空气；5%CO2 温度：37℃ 1:3 - 1:6 55% DMEM 40% FBS 5% DMSO
▲RAW 264.7生长图片养好RAW 264.7之进阶篇1 除了基础条件，其他外界因素也容易引起细胞的“小脾气”，比如运输路上的颠簸、传代方法等等。针对几种常见的问题，小普来一一为大家解答。
分化的细胞贴壁牢固，传代的时候请勿强制性吹下这些细胞，只接种容易吹下的那些未分化细胞； 3 吹打的力度一定要轻，切勿暴力吹打； 4 细胞的贴壁性和培养器皿的材料也有关，有时RAW 264.7 会出现太容易吹下的情况，连分化细胞都贴壁较松，此时更适宜用巴氏管吹打； 5 培养时，无法保证100% 不分化，通过传代可以将分化比例控制在一定范围； 6 RAW 264.7分裂活跃，记得每天看一看，周末也要抽点时间关心一下它哦~ 养细胞不易，每个细胞对我们而言，都像是宝宝，含在嘴里怕化了，捧在手里怕摔了。
▲推荐传代的密度养好RAW 264.7之终结篇讲了那么多如何处理RAW 264.7分化的情况，那分化了的细胞到底是什么形态呢？
分化的RA264.7 分化的细胞呈多角形，体积明显增大，时常有较长的黑色触角。注意事项 1 RAW 264.7细胞三天不传代更容易分化，很难吹下，每一次接种密度都要控制好； 2
细胞名称
细胞别称
种属组织来源生长特性细胞形态生长培养基培养环境推荐传代比例冻存液配方
RAW 264.7 (小鼠单核巨噬细胞白血病细胞) RAW264; RAW2647; RAW 264.7; RAW-264.7; Raw 264.7; RAW 264.7 小鼠（雄性，成年BALB/c鼠） Abelson鼠科白血病病毒诱导的肿瘤贴壁细胞

MTT法检测RAW264.7细胞活力及可能因素分析

MTT法检测RAW264.7细胞活力及可能因素分析白生宾;陈红香;钟近洁;冯树梅;李甜;罗学港【期刊名称】《中国现代医学杂志》【年(卷),期】2011(21)23【摘要】目的通过MTT法检测RAW264.7细胞活力并绘制生长曲线,探讨MTT 作用环节中的可能影响因素,优化实验方案.方法以对数生长期的RAW264.7细胞为实验对象,分别用正常培养和脱离血清培养法,记录在不同时间点的OD值.并在加入DMSO后,分别在6、12、24和48 h及3、15和30d进行OD值测量.结果加入DMSO后不同时间点的MTT法检测结果,随着时间的延长,结果差异越来越大,超过3d后影响较大,与对照组比较,差异具有统计学意义(P＜0.05).3d内,与对照组比较,差异没有统计学意义(P＞0.05).结论①验证、测量并绘制RAW264.7的生长曲线；(②加盖后影响透光度,增大了OD值,影响了实验结果；③随着DMSO时间的延长以第3天为限,否则影响实验结果.【总页数】3页(P2831-2833)【作者】白生宾;陈红香;钟近洁;冯树梅;李甜;罗学港【作者单位】新疆医科大学基础医学院组胚教研室,新疆乌鲁木齐 830011;新疆维吾尔自治区人民医院妇科,新疆乌鲁木齐 830001;新疆医科大学基础医学院组胚教研室,新疆乌鲁木齐 830011;新疆医科大学基础医学院组胚教研室,新疆乌鲁木齐830011;新疆医科大学基础医学院组胚教研室,新疆乌鲁木齐 830011;中南大学湘雅医学院人体解剖与神经生物学系,湖南长沙 410013【正文语种】中文【中图分类】Q2-33【相关文献】1.MTT法与CC K-8法检测兔视网膜色素上皮细胞活性的比较研究 [J], 杨冬萍;杨晓旭;俞洋2.预制检测板MTT法检测癌患者外周血淋巴细胞化疗药物敏感性的研究 [J], 李胜水;于翠珍;崔克勤;张风梅3.MTT法不适用于代谢水平改变的细胞活力检测 [J], 施文荣;刘艳4.MTT法检测细菌细胞数的主要影响因素分析 [J], 吴窈画;谈书华;范超超;李正华5.比较MTS与MTT用于大鼠热应激模型中肠上皮细胞活力检测 [J], 梅晨;何莎莎;许磊;李德银;吕安;张志聪;张彤;宫平;刘凤华因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

mtt检测方案

MTT检测方案1. 简介MTT（3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide）是一种常用的细胞代谢活性指标，被广泛用于评估细胞的增殖、存活和损伤程度。

MTT检测方案是一种基于MTT试剂的细胞活力检测方法，通过将MTT试剂与细胞共培养，细胞内的还原型MTT物质将被代谢酶还原为紫色的甲啉盐，进而通过溶解甲啉盐来测定细胞数量或活力。

本文将介绍MTT检测方案的具体步骤和注意事项，以帮助研究人员正确进行细胞活力的评估和相关实验。

2. 实验原理MTT试剂是一种黄色的水溶性试剂，在细胞共培养过程中，MTT会被细胞内的代谢酶还原为紫色的甲啉盐。

甲啉盐在一定条件下可溶于有机溶剂，例如二甲基亚砜（DMSO），这样可以通过分光光度计测定溶解后的甲啉盐的光吸收度，间接反映细胞的活力。

MTT检测方案的基本步骤如下：1.细胞培养：选择适当的细胞系，并使用合适的培养基进行细胞的繁殖和培养。

确保细胞处于良好的生长状态时进行后续实验。

2.细胞处理：将细胞接种在培养物底物上，使其附着生长。

当细胞密度达到合适的程度时，加入待检测的样品或药物处理，根据实验需要进行时间和浓度的调整。

3.MTT试剂处理：将培养的细胞洗涤一遍，添加MTT试剂至培养基中，通常浓度为0.5 mg/ml。

将细胞孵育在37°C的培养箱中，孵育时间通常为4小时。

4.紫色甲啉盐形成：孵育结束后，将培养基中的MTT溶液用吸管吸除，加入溶解剂（如DMSO）彻底溶解甲啉盐。

一般来说，溶解剂的体积与MTT试剂所添加的体积相当，可在溶解前进行调整。

5.测定吸光度：将溶解后的甲啉盐溶液取出一定体积放入96孔板中，使用分光光度计在570 nm波长处测定吸光度。

吸光度的数值与细胞活力相关，数值越高代表细胞活力越强。

3. 注意事项1.实验前准备：细胞培养需要遵守相关的无菌操作规范，并针对不同的细胞系选择合适的培养基、培养条件和培养器具。

小鼠巨噬细胞RAW264_7的培养技巧及经验总结

现代生物医学进展 Progress in Modern Biomedicine Vol.12NO.22AUG.2012·技术与方法·小鼠巨噬细胞RAW264.7的培养技巧及经验总结*方瑶毛旭虎△(第三军医大学医学检验系临床微生物教研室重庆400038)摘要：RAW264.7细胞具有很强的黏附和吞噬抗原的能力，是研究微生物学、免疫学的常用细胞株。

很多研究者发现这种细胞形态极不稳定，细胞状态的评价也很困难。

本文作者结合RAW264.7培养经历及文献资料探讨RAW264.7细胞培养的经验教训和评价细胞状态的方法，旨在为培养该细胞的科研工作者提供一定的借鉴。

关键词：小鼠巨噬细胞RAW264.7（TIB-71）；细胞培养；细胞形态中图分类号：Q95-3，Q813文献标识码：A 文章编号：1673-6273（2012）22-4358-02Culture Skill and Experience of RAW264.7*FANG Yao,MAO Xu-hu △(Department of Clinical Microbiology and Immunity,the Third Military Medical University,Chongqing,400038,China)ABSTRACT:RAW264.7has doughty capability of adhesion and antigen phagocytosis,so it is commonly used in microbiology and immunology.However,many researchers find that the cell is very unstable because of its morphous variation,and it is difficult to value its state.In this paper we mainly discussed the skills and experience in culturing RAW264.7and method of evaluating cell state.We hope to provide some references to researchers who would culture such cell line.Key words:Mice macrophages;RAW264.7(TIB-71);Cell culture;Cell morpha Chinese Library Classification(CLC):Q95-3,Q813Document code:A Article ID:1673-6273（2012）22-4358-02*基金项目：国家重大科技专项（2008ZXJ09014-007）作者简介：方瑶（1987-），男，硕士，主要研究方向：病原与宿主相互作用，E-mail ：lolfang@ △通讯作者：毛旭虎，E-mail ：mxh95xy@ （收稿日期：2011-11-23接受日期：2011-12-18)RAW264.7是由Abelson 鼠白血病病毒诱导BALB/c 小鼠产生肿瘤后收集小鼠腹水单核样巨噬细胞得到的细胞株（ATCC Number:TIB-71）。

聚多巴胺纳米颗粒调控Raw264.7细胞M1极化

-1262-中国老年学杂志2621年3月第41卷1Hunt K.,Jaffa MA,Garrett SM,t ad Plasma Ccwmctive Tissue Growth Factor-CTGF/ECN4)Levels Predict Myocardial Infaytiov in the Veterans Affaiv Diabetes TTal(VADT)CWwO〔J〕.Diabetes CaT465；41(4)：8407.17Gianelli U,FRT S,CatWnee D,et ad Prognostic sig/ficance of a compreXexsive histologic evaluation of reich/u fibrosis:collagen deposihoh and osteosclerosis in primaq myelofibrosis patiex-s〔J〕.,2617；71(0-：892798.1Liu M,Yan L,Liang B,ti ad Hykrogex sulkde attenuates myocardial fibrosis in diaketie rats throuah the JAKSTAT signaling pathway 〔J〕.1/J MP MeX,271C；41(2)：56776.1Filidoh E,Valatas V,DTaiannakis Q tt ad Cytohine receptor proCling in human colonic suUepithelal myoCbrohlasts:a diTerextial elect of Th polaTzatioh-ossociateX cytohines in intestinal fibrosis 〔J〕.EUamm Bowel Dis,275；21(15-：22217720Brown E,Veigh CJM,Santos L,et ad TNFa-PeyeyUent anUedo/a and uureguladov of hippocampal serotovin transporter acUvity in a mouse mohel of coCagex-TnuceX adhTUs〔J〕.NeuTpharmacc0o2, 275；57(13)：21107.〔26190608修回〕(编辑王一涵)聚多巴胺纳米颗粒调控Raw264.9细胞M1极化倪宇昕-，，章立群-，谢安琪-，刘学-，杨旭72（1华中科技大学协和深圳医院口腔科，广东深圳518200；2深圳大学第六附属医院口腔科;3吉林大学口腔医院种植科）〔摘要〕目的分析聚多巴胺（PDA）纳米颗粒对巨噬细胞M）极化的作用。

基因编辑RAW264.7细胞系——助力炎症以及破骨细胞生成相关研究

基因编辑RAW264.7细胞系——助力炎症以及破骨细胞生成相关研究小鼠单核巨噬细胞白血病细胞（RAW264.7）被认为是巨噬细胞的最佳模型之一，因为该细胞能够进行胞饮和吞噬作用，在炎症、免疫、凋亡、肿瘤研究应用广泛。

RAW264.7细胞在体外可以对刺激产生反应，并随后产生具有破骨细胞完全分化的特征的多核细胞，被广泛用于研究骨骼疾病如风湿性关节炎、骨质疏松症、骨质溶解、牙周炎等。

RAW 264.7细胞系的应用：RAW264.7是单核细胞/巨噬细胞样细胞系，源自BALB/c 微小核糖核酸的Abelson白血病病毒转化细胞系。

RAW 264.7是破骨细胞、炎症研究最常用的体外模型之一。

1. 破骨细胞生成研究：RAW 264.7已被证明在RANKL诱导下容易分化为破骨细胞。

与原发性破骨细胞前体不同，RAW 264.7的分化无需添加巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）。

2. 炎症研究：RAW264.7是筛选抗炎活性物和研究炎症最常用的体外研究模型。

在诱导剂（如脂多糖LPS）的作用下，RAW264.7细胞会模拟炎症反应，释放或上调多种炎症介质如一氧化氮（NO）、环氧合酶-2（COX-2）、肿瘤坏死因子α（TNF-α）、白细胞介素6（IL-6）等。

CRISPR/Cas9介导的miRNA-155敲除模型，帮助探究类风湿关节炎中可抑制RAW264.7细胞产生促炎细胞因子据报道，类风湿关节炎(RA)影响着全世界2100多万人。

RA是一种影响关节的自身免疫性炎症疾病。

它的特征是巨噬细胞和淋巴细胞浸润，滑膜成纤维细胞增殖，最终的关节破坏。

巨噬细胞在RA发病机制中发挥重要作用。

RA炎性滑膜中巨噬细胞数量高于正常关节，与关节疼痛和炎症的严重程度呈正相关。

许多药物已经被批准用于治疗风湿性关节炎，基因或细胞疗法。

MicroRNA 155 (miR-155)在小鼠16号染色体和人类21号染色体的BIC基因中被发现。

在临床和实验模型中，miR-155与RA的发病机制有关，因为它在RA患者的滑膜和滑膜液巨噬细胞中上调。

利用MTT法检测活细胞数量和结果分析

11）计算抑制率，公式[（对照-本底）（给药-本底）]/（对照-本底）*100%.
MTT法的不足：

原理是MTT可作为哺乳类动物细胞线粒体中琥珀酸脱氢酶的底物。当有活细胞存在时，线粒体内琥珀酸脱氢酶可将淡黄色的MTT还原成紫蓝色的晶状甲瓒(Formazan)，将结晶的甲瓒溶解释放，再用酶联免疫检测仪测定吸光度OD值，OD值的高低可间接反映活细胞的数量及其活性。它基于两个假设： 1、只有活细胞能够将MTT还原成为难溶性的蓝紫色结晶物，而死细胞不能达到； 2、其吸光度与活细胞数量成直线正相关。但该方法在使用过程中会受到多种因素的干扰。

3）每孔加入10 ul MTT溶液（5 mg/ml，即 0.5%MTT），继续培养4 h。（悬浮细胞可使用WST-1，XTT等，培养4 h后可跳过步骤4），直接酶联免疫检测仪OD570nm （630nm校准）测量各孔的吸光值） 4）离心（1000转x10min），小心吸掉上清，每孔加入100 ul二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10 min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD570nm（630nm校准）测量各孔的吸光值。 5）对照孔（细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜），每组设定3复孔。
五、注意事项与常见问题

1）实验时应设置对照孔，加药孔。对照孔和加药孔都要加细胞、培养液、MTT、二甲基亚砜，不同的是对照加溶解药物的介质，而加药组加入不同浓度的药物。 2）每孔中的细胞数可以根据细胞生长的速度调整，并进行预实验调整浓度，太多敏感性降低，太少观察不到差异。 3）如果不使用96孔板，培养基超过100 ml，MTT 按照10%的比例加入。 4）MTT一般4度保存两周，注意避光保存，或配制成5mg/ml保存在-20度长期保存，避免反复冻融，最好小剂量分装，用避光袋或是黑纸、锡箔纸包住避光以免分解，配制完后可过滤一下。 5）对于DMSO，溶解后呈紫（红）色，570nm有最大吸收值，并且建议以630nm作为参考波长。

RAW264_7巨噬细胞源性泡沫细胞模型的建立及鉴定

[文章编号] 1007-3949(2010)18-09-0687-04#实验研究#RA W 264.7巨噬细胞源性泡沫细胞模型的建立及鉴定周云,沃兴德,卢德赵(浙江中医药大学生命科学学院,浙江省杭州市310053)[关键词] RAW 264.7细胞; 泡沫细胞; 胆固醇酯; 氧化型低密度脂蛋白[摘要] 目的以小鼠巨噬细胞RAW 264.7为对象,建立简便而又准确的泡沫细胞诱导及鉴定方法。

方法将实验分为正常对照组和不同浓度氧化型低密度脂蛋白与细胞孵育组,在以孵育时间为24h 的前提下,用MTT 法和流式细胞术来确定诱导泡沫细胞的氧化型低密度脂蛋白合适浓度区间范围,并用总胆固醇试剂盒和游离胆固醇试剂盒测定不同程度泡沫细胞内胆固醇酯含量。

结果氧化型低密度脂蛋白浓度范围为20~30mg /L 时,细胞存活率已受到显著抑制,并随着氧化型低密度脂蛋白浓度的增高细胞凋亡率和坏死率逐渐增大,起初以细胞凋亡为主,当氧化型低密度脂蛋白浓度大于40m g /L 时凋亡的细胞不断坏死。

20m g /L 和30m g /L 氧化型低密度脂蛋白与RAW 264.7细胞共孵育24h ,细胞内胆固醇酯比重分别为66.26%和71.19%,而10m g /L 的氧化型低密度脂蛋白诱导24h 的泡沫细胞不典型,40mg /L 以上的氧化型低密度脂蛋白诱导的泡沫细胞泡沫化程度严重,贴壁不牢,大部分细胞破裂或凋亡,脂滴散布于细胞外。

结论 20~30m g /L 氧化型低密度脂蛋白诱导的RAW 264.7巨噬泡沫细胞模型稳定且形态较完整,符合泡沫细胞的形态学特征。

[中图分类号] R36[文献标识码] AThe M odel Estabilis h m ent and Identification of RA W 264.7M acrophage -D erived Foa m CellZHOU Yun ,W O X i ng -D e ,and LU D e -Zhao(C oll ege of L ife S cience ,Zheji ang Trad itiona lC hinese M e d icine Un iversit y,H ang zhou,Zheji ang 310053,Ch ina )[KEY W ORDS] RAW 264.7Ce lls ; F oa m Ce l;l Cho lestero l Ester ; O x i d ized L ow D ensity L i poprote i n [ABSTRACT ] A i m To establis h t he model o f mur i ne m acrophage RAW 264.7derived foa m ce ll and i dentif y the m w ith si m p le and accura te m ethod . M ethod s T he exper i m ent was dev ided i nto no r ma l contro l group and si x exper i m en -ta l groups of d ifferent concentra tion o f ox i dized l ow density li poprote i n (ox -LDL )incubated w it h ce l.l On the incubati on ti m e for 24hours thatMTT m e t hod and flow cytome try (FC M )w ere used t o deter m i ne t he suitable rang e o f ox -LDL concen -tration ,then measure intra -cell u l ar cho l esterol ester i n different l eve l of m ac rophag e f o a m ce llw ith tota l cho leste ro l and free cho lestero l k it . R esu lts Ce ll v i ab ility had been si gn ifi cantl y i nhi b ited when ox -LDL concentrati on w as a t the rang e o f 20~30m g /L ,when ox -LDL concen trati on w as g reater than 40m g /L,apoptosis cell s conti nuous l y necrosis .O x -LDL a t t he concen trati on of 20and 30m g /L ,incubated w ith ce ll fo r 24hours ,t he propo ti on o f i ntra -ce llular cholestero l este r were 66.26%and 71.19%. F oa m ce ll i nduced by 10m g /L of ox -LDL w as not t yp i ca,l and by 40m g /L o f ox-LDL o r m ore ,severe degree of foa m ce ll l ed to ce lls fl oa ti ng ,m ost ce lls we re rupture o r apoptos i s ,lipi d drop l et d i spersed i n ex tra -cell u -l ar . Con cl u si on O x -LDL a t the concentra ti on rang e o f 20~30m g /L ,i ncuba ted w ith RAW 264.7for 24h ,i nduced foam cell has good m orpho l ogy ,and m ode l stab ilit y ,m ee t the m orpho logy feature of f o a m cel.l[收稿日期] 2010-07-23 [修回日期] 2010-09-05[基金项目] 国家自然科学基金资助(30873366)[作者简介] 周云,硕士研究生,主要从事中药抗动脉粥样硬化研究,E-m ail 为z houyun04yy @163.co m 。

细胞存活率分析（MTTAssay）

细胞存活率分析（MTTAssay）細胞存活率分析(MTT Assay)培養24⼩時培養24⼩時培養4⼩時培養24⼩時 Time⽤570nm 的ELISA 讀OD 加⼊細胞⾄96well 中吸去100µl 液體，加⼊MTT吸去100µl GM，加⼊100µl 新GM 及藥物吸去全部液體，加⼊100µl DMSO實驗步驟：1. 將細胞消化後，以Growth Medium(10%FBS)稀釋到適當體積，再均勻接種到96 well plates 中，每well 接種200µl。

接種完畢後，在盤⾯最外圍的well(X well)處加⼊100µl 的無菌⼆次⽔(DDW)。

Note：A375細胞→75T flask 可接種4盤 96well plates2. 將細胞移⼊37℃培養箱，培養16~24⼩時。

3. 將Medium 換成0.1%FBS 的Medium 100µl 靜置24hr4. 加藥：⼀次處理同⼀稀釋濃度的3個well，先以tip 吸去100µl 在well中的GM，再加⼊100µl 新的DMEM(不含FBS)，之後再加⼊藥物⾄well 中。

5. 將細胞移⼊37℃培養箱，培養24⼩時。

6. 移除well 中100µl 液體，並加⼊1/10 volume(10µl)的MTT(5mg/ml)到每個well 中。

Note：MTT 在GM 中的最終濃度為0.5mg/ml。

7. 將細胞移⼊37℃培養箱，作⽤4⼩時。

8. 吸除well 中的GM 與藥物的混合液體，並加⼊100µl SDS-HCl 到每well中。

9. 將細胞移⼊37℃培養箱，培養24⼩時。

10. ⽤570 nm filter 的ELISA reader 來測定OD 值。

計算：OD TC0 ─OD TC100 =TC 50之OD, 再以內插法求得drug 的TC 502盤⾯設計： X X X X X X X X X XX X XX XX XX XX XX X X X X X X X X X X X XX X z X 的部分，加⼊200µl 無菌DDW z 灰⾊的部分為藥物處理組藥物：z MTT [3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide]為可溶於⽔的⿈⾊染劑，會被細胞中NADPH 還原為不溶於⽔的深藍⾊結晶(MTT-formazan)，此結晶必須先⽤DMSO 溶解後，才能⽤ELISA reader 讀取吸光值，若細胞活性越強，藍⾊越深，若細胞死亡，則呈現⿈⾊。

RAW264.7小鼠巨噬细胞protocol

RAW264.7细胞株的相关信息ATCC:美国模式培养物集存库(American type culture collection)的简写收到冷冻管细胞的处理方式1. 收到细胞株包裹时，请检查细胞株冷冻管是否有解冻情形，若有请立即通知。

细胞株请尽速开始培养，或立即冷冻保存(置于–70℃，隔夜后，移到液氮)。

2. 收到T25 flask细胞的处理方式于寄送过程中，为避免起泡造成细胞脱落死亡，T25 flask 均加满培养基。

2.1. 检查flask 外观，并于显微镜下观察细胞生长状况和有无污染现象，若有任何问题，不要打开盖子，请立即通知细胞实验室。

2.2. 将原封之T25 flask 静置于37℃， 5% CO2 培养箱中，使细胞回温至37℃，并让运送过程中少数脱落的细胞可再附着生长。

2.3. 隔天后，于无菌操作箱内取出flask内之培养基，(取出之培养基可以再使用)，仅留约5-10ml 培养基于flask 内，依一般培养方式再将细胞置入培养箱中，或细胞已长满盘，则将细胞做传代培养。

RAW264.7细胞株的Cell Culture一、RAW264.7细胞培养的特点1、RAW264.7细胞一般为圆形或椭圆形，功能活跃时，可呈多突形。

细胞核为圆形或椭圆形，染色较深。

贴壁特别牢固。

2、RAW264.7具有很强的吞噬能力，当吞噬抗原后，细胞会释放趋化因子，进一步促进细胞伸出伪足，增强粘附攀爬能力。

细胞吞噬抗原过多、培养环境恶劣都会促进该细胞呈现梭形、长梭形，镜下会看到具有细长伪足的小细胞被类似上皮的梭形大细胞取代。

3、每次传代都很难消化下来。

用力过大则对细胞损伤较大，这种细胞传代时接种密度要大，否则容易使巨噬细胞向终末细胞分化，细胞变成长形，并且不能回复，这是培养这种细胞时最需要注意的问题。

4、对于RAW264.7细胞他的声场时喜欢结伴。

正常生长状态应该是一小片一小片的生长，片片之间不连接，等到长到更多更密的时候会连成大片，并且会叠加成层。

钛颗粒对RAW264.7巨噬细胞增殖及炎性因子表达的影响

钛颗粒对RAW264.7巨噬细胞增殖及炎性因子表达的影响李燕;陈德胜;郭凤英;夏根;付斌;周芙标【摘要】目的观察钛(Ti)颗粒对RAW264.7巨噬细胞增殖及肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、基质金属蛋白酶-9(MMP-9)表达的影响.方法 Ti颗粒设0、0.125、0.25、0.5和1 pg·mL-1浓度组,观察RAW264.7巨噬细胞不同时段对各浓度Ti颗粒的吞噬作用;MTT法检测各浓度Ti刺激后RAW264.7巨噬细胞增殖能力;ELISA法检测0.125pg·mL-1 Ti刺激RAW264.7巨噬细胞前后分泌TNF-α、MMP-9的变化.结果 RAW264.7巨噬细胞出现吞噬Ti颗粒现象.MTT法检测表明所用各浓度Ti颗粒均不影响RAW264.7巨噬细胞增殖;RAW264.7巨噬细胞在0.125pg·mL-1 Ti颗粒的刺激下分别培养6、24和96h均可使NF-α、MMP-9表达增高(P<0.01).结论Ti颗粒可引起RAW264.7巨噬细胞吞噬反应,促进TNF-α、MMP-9表达,但不影响RAW264.7巨噬细胞的增殖.%Objective To observe the vitality of RAW264.7 macrophages and the expression of TNF-α, MMP-9by wear particles stimulating.Methodsthe morphological changes ofRAW264.7 macrophages that titanium particles stimulated were observed for the different time duration. RAW264.7 macrophages viability was observed using the inverted microscope and the vitality of RAW264.7 macrophages was detected by titanium particles stimulated through methyl thiazolyl tetrazolium(MTT)colorimetric assay. Expression of TNF-αand MMP-9 were monitored by ELISA assay.Results Injecting titanium particles,RAW264.7 macrophages engulfed them with the increased concentration of titanium particles and RAW 264.7 macrophages proliferation declined. The cell viability of Titanium particles stimulatingshowed no significant difference, compared with control group. RAW264.7 macrophages vitality of titanium particles could cause RAW264. 7 macrophages phagocytosis reaction and promted by titaniumparticles(P<0.01). The expression of TNF-α,MMP-9 increased significantly by titanium particles stimulating for 6,24 and 96 hours(P<0.01). Conclusion RAW264.7 macrophage phagocytosis and cell viability were promted by wear particles stimulating. The expression of TNF-α,MMP-9 increased with wear particles stumulation while it did not affect cell viability.【期刊名称】《宁夏医科大学学报》【年(卷),期】2016(038)012【总页数】5页(P1357-1359,1365,封4)【关键词】磨损颗粒;RAW264.7巨噬细胞;Ti颗粒;肿瘤坏死因子-α;基质金属蛋白酶-9【作者】李燕;陈德胜;郭凤英;夏根;付斌;周芙标【作者单位】宁夏医科大学,银川 750004;宁夏医科大学总医院,银川 750004;宁夏医科大学,银川 750004;宁夏医科大学总医院,银川 750004;宁夏医科大学总医院,银川 750004;宁夏医科大学,银川 750004【正文语种】中文【中图分类】R318人工关节置换术是治疗终末期骨性关节炎、晚期类风湿关节炎及严重的创伤性关节炎等疾患最为行之有效的治疗方法，通过手术治疗可以重建关节功能、恢复关节活动度、减轻疼痛和改善患者生活质量[1]。

mtt试验的诸多问题分析

MTT试验中的诸多问题细胞：1.选择适当的细胞接种浓度。

一般情况下，96孔培养板的一内贴壁细胞长满时约有105个细胞。

但由于不同细胞贴壁后面积差异很大，因此，在进行MTT试验前，要进行预实验检测其贴壁率、倍增时间以及不同接种细胞数条件下的生长曲线，确定试验中每孔的接种细胞数和培养时间，以保证培养终止致细胞过满。

这样，才能保证MTT结晶形成酌量与细胞数呈的线性关系。

否则细胞数太多敏感性降低，太少观察不到差异。

2.药物浓度的设定。

一定要多看文献，参考别人的结果再定个比较大的范围先初筛。

根据自己初筛的结果缩小浓度和时间范围再细筛。

切记！否则，可能你用的时间和浓度根本不是药物的有效浓度和时间。

3. 时间点的设定。

在不同时间点的测定OD值，输入excel表，最后得到不同时间点的抑制率变化情况，画出变化的曲线，曲线什么时候变得平坦了（到了平台期）那个时间点应该就是最好的时间点（因为这个时候的细胞增殖抑制表现的最明显）。

4.培养时间。

200ul的培养液对于10的4～5次方的增殖期细胞来说，很难维持68h，如果营养不够的话，细胞会由增殖期渐渐趋向G0期而趋于静止，影响结果，我们是在48h 换液的。

5.MTT法只能测定细胞相对数和相对活力，不能测定细胞绝对数。

做MTT时，尽量无菌操作，因为细菌也可以导致MTT比色OD值的升高。

6.理论未必都是对的。

要根据自己的实际情况调整。

7.实验时应设置调零孔，对照孔，加药孔。

调零孔加培养基、MTT、二甲基亚砜。

对照孔和加药孔都要加细胞、培养液、MTT、二甲基亚砜，不同的是对照孔加溶解药物的介质，而加药组加入不同浓度的药物。

8.避免血清干扰。

用含15％胎牛血清培养液培养细胞时，高的血清物质会影响试验孔的光吸收值。

由于试验本底增加，会试验敏感性。

因此，一般选小于10％胎牛血清的培养液进行。

在呈色后，尽量吸净培养孔内残余培养液。

实验步骤贴壁细胞：1.收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，每孔加入100ul,铺板使待测细胞调密度至1000-10000孔，（边缘孔用无菌PBS填充）。