微生物数量的测定

光电比浊计数法优缺点
❖ 优点：简便、快速、连续测定、适合自动化。
❖ 缺点：
➢ 光密度受细胞大小、形态、培养液成分以及选用的 波长的影响；
➢ 对于不同微生物的菌悬液要选择相应的菌株和培养 条件制作标准曲线；
➢ 对于颜色太深的样品或含其它具有吸光值的物质不 能用此法。
器材
❖菌种 酿酒酵母培养液
❖仪器或其他用具 分光光度 计，血细胞计数板，显微 镜，试管，吸水纸，无菌 吸管，无菌生理盐水等。
❖ 每个方格网共分为九个大方格， 中间的大方格即为计数室。
❖ 血球计数板是一块特制的载玻片 ，其上由四条槽构成三个平台； 中间较宽的平台又被一短横槽隔 成两半，每一边的平台上各列有 一个方格网。
❖ 每个方格网共分为九个大方格， 中间的大方格即为计数室。
❖ 计数室的刻度一般有两种规格： 一种是一个大方格分成25个中方 格，而每个中方格又分成16个小 方格；另一种是一个大方格分成 16个中方格，而每个中方格又分 成25个小方格。
• 血球计数板
Petroff-Hauser计菌器
•Hawksley计菌器
❖ 血球计数板是一块特制的载玻片 ，其上由四条槽构成三个平台； 中间较宽的平台又被一短横槽隔 成两半，每一边的平台上各列有 一个方格网。
❖ 血球计数板是一块特制的载玻片 ，其上由四条槽构成三个平台； 中间较宽的平台又被一短横槽隔 成两半，每一边的平台上各列有 一个方格网。
3、将菌悬液摇匀，用无菌滴管吸取少许，沿盖玻片边缘摘 入一小滴，让菌悬液利用毛细渗透作用充满计数区。
4、加样后静止5min，将计数板置显微镜载物台上，先用 低倍镜找到计数区，然后换高倍镜计数。（光不宜太强 ）
5、计数完毕，将血球计数板在水龙头下流水冲洗干净，用 电吹风吹干，镜检确认计数区无残留菌体或其它沉淀。
活材料：
实验器材
酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）培养液
。
其他器材：
显微镜、血球计数板 、电吹风、盖玻片（ 22mm×22mm）、 吸水纸、计数器、滴 管、擦镜纸。
实验方法
1、用无菌生理盐水将待测菌稀释成适当浓度的菌悬液（以 每个小方格中5～10个菌为宜）。
2、取洁净的血球计数板一块（事先镜检），盖上一块盖玻 片。
❖无论是哪一种规格的计数板，每一个大方格中的小方格都是 400个。每一个大方格边长为lmm，则每一个大方格的面积为 lmm2，盖上盖玻片后，盖玻片与载玻片之间的高度为0.lmm ，所以计数室的容积为0.lmm3(万分之一毫升)。
计数方法
❖使用血球计数板计数时，通常数5个中方格的总菌 数A，然后求每个中方格的平均值，再乘上大方格（ 计数室）中方格的数量，就得出一个大方格中的总 菌数。数两个大方格总菌数，平均后，再换算成每 毫升菌液中微生物细胞的数量。
➢ 不能区分死菌与活菌，所得为总数； ➢ 不适于对运动细菌的计数。
常用计菌器
❖常用计数器有血球计数板(血细胞计数板) 、Petroff-Hauser计菌器以及Hawksley 计菌器等。
❖各种计数板的计数原理相同，只是血球计 数板较厚，不能使用油镜观察，只能计数 较大的霉菌孢子和酵母菌；而后两种计菌 器细菌，可以使用油镜观察，因此可以直 接计数细菌。
•作业
•结果（填表） P55
•实验十二、光电比浊计数法
Leabharlann Baidu
•目的要求
❖了解光电比浊计数法的原理。 ❖学习、掌握光电比浊计数法的操作方法。
基本原理
❖ 当光线通过微生物菌悬液时，由于菌体的散射 及吸收作用使光线的透过量降低。
❖ 在一定范围内，微生物细胞浓度与透光度成反 比，与光密度成正比，而光密度或透光度可以 由光电池精确测出。因此，可用一系列已知菌 数的菌悬液测定光密度，作出光密度-菌数标准 曲线。然后，以样品液所测得的光密度，从标 准曲线中查出对应的菌数。
❖ 计算：
➢ 1mL菌液中总菌数 =A/5*25*104*B=50000*A*B
➢ 1mL菌液中总菌数 =A/5*16*104*B=32000*A*B
其中B为稀释倍数。
注意事项
❖ 对于出芽的酵母菌，芽体 达到母细胞大小一半时， 即可作为两个菌体计算。
❖ 对于压线酵母，按照数上 不数下、数左不数右的原 则计数
3、测OD值：以无菌生理盐水作为对照，于波长 560nm处用1cm比色杯测定上述各菌液的OD值 。
4、以OD值为纵坐标，每毫升菌数为横坐标，绘制 标准曲线。
样品测定
1、稀释样品：将待测菌悬液用无菌生理盐 水适当稀释。
2、在560nm波长用1cm比色皿测定稀释 后菌悬液的光密度。
3、计算：根据所测得的光密度值，从标准 曲线查得每毫升的含菌数，乘以稀释倍 数就得到原液中细菌数。
实验十一、显微镜直接计数法
目的要求
❖了解血球计数板的构造、计数原理和计 数方法；
❖掌握显微镜下直接计数的技能。
❖显微镜直接计数法是将小量待测样品的 悬浮液置于一种特别的具有确定面积和 容积的载玻片上，于显微镜下直接计数 的一种简便、快速、直观的方法。
直接计数法优缺点
❖ 优点：直观、快速、操作简单。 ❖ 缺点：
❖ 血球计数板是一块特制的载玻片 ，其上由四条槽构成三个平台； 中间较宽的平台又被一短横槽隔 成两半，每一边的平台上各列有 一个方格网。
❖ 每个方格网共分为九个大方格， 中间的大方格即为计数室。
❖ 计数室的刻度一般有两种规格： 一种是一个大方格分成25个中方 格，而每个中方格又分成16个小 方格；另一种是一个大方格分成 16个中方格，而每个中方格又分 成25个小方格。
微生物数量的测定
❖微生物的生长通常以群体的生长作为指标。群体生长表现 为细胞数目的增加或者细胞物质的增加。
❖测定微生物数量的主要方法：
•显微镜直接计数法（不辨死活） •平板菌落计数法（形成菌落的微生物） P32 •光电比浊法（不用于颜色太深的样品） •测定细胞重量法（测定丝状真菌生长量） •测定细胞总氮量或总碳量（适于浓度较高的样品） •。。。。。。
•光密度值
操作步骤
❖ 标准曲线的制作 ❖ 样品测定
•每毫升细胞数
标准曲线的制作
1、血球计数板直接计数：首先采用血球计数直接计 数酿酒酵母菌悬液。（ 2×108菌/mL ）
2、稀释菌液：将上述已知浓度的酿酒酵母菌悬液用 无菌生理盐水进行两倍梯度稀释,共稀释6个浓度: 1×108、 5×107、 2.5×107、 1.25×107、 6.25×106、 3.125×106。