愈伤组织诱导及观察

一.实验目的

通过愈伤组织诱导的操作，使同学们了解进行植物组织培养时的一些关键操作技术和方法，如外植体的选择、培养基母液配制、使用液配制、分装灭菌、外植体表面消毒、接种、培养、愈伤组织诱导原理和方法以及接种后污染率，愈伤组织诱导率的统计与观察。使同学们能够亲身体会、了解激素对外植体的作用，还使同学们了解无菌培养的无菌操作，清楚植物体的带菌部位等。

二.实验内容

（一）、实验原理

植物组织培养是指在无菌条件下，对离体植物组织（器官或细胞）分离并在培养基中培养，使其能够继续生长，甚至分化发育成一完整的植株的一门实验技术。组织培养的理论依据是植物细胞的全能性，即植物体的每个细胞携带着一套完整的基因组，因此具有发育成完整植株的潜在能力。植物组织当中原本已经分化的细胞，一旦脱离原有的机体环境，成为离体状态，在适宜的营养和外界条件下，就会表现出全能性，从已经分化定型的细胞，脱分化，成为恢复分裂能力的细胞，并能重新生长发育成完整的植株。愈伤组织就是指一个离体的细胞、一块组织或一个器官的细胞，通过脱分化不断分裂、增生子细胞，这些细胞分裂快，结构疏松，颜色浅而透明，逐渐形成了无序结构的一团细胞。在植物组织培养中，主要目标是诱导愈伤组织形成和形态发生，使一个离体的细胞、一块组织或一个器官的细胞，通过脱分化形成愈伤组织，并由愈伤组织再分化形成植物体。

愈伤组织的形成

从一块外植体形成典型的愈伤组织，大致要经历三个时期：起动期、分裂期和形成期。

起动期是指细胞准备进行分裂的时期。用于接种的外植体的细胞，通常都是成熟细胞，处在静止状态。起动期是通过一些刺激因素(如机械损伤、改变光照强度、增加氧等)和激素的诱导作用，使外植体细胞的合成代谢活动加强，迅速进行蛋白质和核酸的合成。机械损伤能诱导植物体细胞开始分裂，如伤口上会出

现愈伤组织。在植物组织培养中沿用了愈伤组织这一名词，但是植物组织培养中诱导外植体细胞分裂形成的愈伤组织，大都不是损伤的结果。外源的生长素类物质对诱导细胞开始分裂效果很好，因此生长素类物质在植物组织培养中得到广泛应用，常用的有2，4-二氯苯氧乙酸、萘乙酸、吲哚乙酸和细胞分裂素等。

分裂期是指外植体细胞经过诱导以后脱分化，不断分裂、增生子细胞的过程。处于分裂期的愈伤组织的特点是：细胞分裂快，结构疏松，颜色浅而透明。外植体的脱分化因植物种类、器官来源及其生理状况的不同而有很大差别。例如，烟草、胡萝卜等植物的脱分化比较容易，禾本科植物的脱分化比较难；花的脱分化比较容易，茎、叶的脱分化比较难；幼嫩组织的脱分化比较容易，成熟的老组织脱分化比较难。

分化期是指在分裂期的末期，细胞内开始出现一系列形态和生理上的变化，从而使愈伤组织内产生不同形态和功能的细胞。这些细胞类型有薄壁细胞、分生细胞、色素细胞、纤维细胞，等等。外植体的细胞经过起动、分裂和分化等一系列变化，形成了无序结构的愈伤组织。如果在原来的培养基上继续培养愈伤组织，会由于培养基中营养不足或有毒代谢物的积累，导致愈伤组织停止生长，甚至老化变黑、死亡。如果要让愈伤组织继续生长增殖，必须定期地(如2～4周)将它们分成小块，接种到新鲜的培养基上，这样愈伤组织就可以长期保持旺盛的生长。

愈伤组织的形态发生方式

经过起动、分裂和分化期产生的愈伤组织，其中虽然发生了细胞分化，但是并没有器官发生。只有满足某些条件，愈伤组织的细胞才会发生再分化，产生芽和根，进而发育成完整植株。愈伤组织的形态发生方式主要有不定芽方式和胚状体方式两种。不定芽方式是在某些条件下，愈伤组织中的分生细胞发生分化，形成不同的器官原基，再逐渐形成芽和根。胚状体方式是由愈伤组织细胞诱导分化出具有胚芽、胚根、胚轴的胚状结构，进而长成完整植株。这种由愈伤组织中的薄壁细胞不经过有性生殖过程，直接产生类似于胚的结构，叫做胚状体。在植物组织培养中，不定芽方式和胚状体方式是愈伤组织形态发生的两种最常见和最重

要的方式。胚状体方式比不定芽方式有更多的优点，如胚状体产生的数量比不定芽多，胚状体可以制成人工种子，等等。

（二）实验材料和用具

1植物材料

银杏种子

2实验仪器和试剂

1）仪器设备

超净工作台、高压灭菌锅、微波炉、人工气候箱、电子天平、移液器、恒温磁力搅拌器、酸度计、手术刀、手术剪、称量纸、皮筋、封口膜、三角瓶、量筒、烧杯（1000ml）、试剂瓶（1000ml、100ml）、长镊子、记号笔（或标签纸）、培养皿、酒精灯等。

2）试剂

75% 酒精、氯化汞、植物生长激素（NAA、BA1）、蔗糖、琼脂粉、HCl、NaOH、WS母液配方见表1。

（三）实验方法

1 培养基配制

1）. 培养基的选择

植物组织培养中应用的培养基，一般由无机营养物、碳源、维生素、生长调节剂和有机附加物等五类物质组成。无机营养物包括大量元素和微量元素。大量元素：C、H、O、N、P、S、K、Ca、Na、Mg等，微量元素：Mn、Zn、Cu、B、Mo、Fe等。碳源一般为蔗糖。维生素中只有硫胺素是必需的，而烟酸、维生素B6和肌醇对生长之起促进作用。常用的生长调节剂有IAA （吲哚乙酸）、IBA（吲哚-3-丁酸）、 NAA（萘乙酸）、NOA（萘氧乙酸）、 P-CPA（对氯苯氧乙酸）、2，4-D（二氯苯氧乙酸）、2，4，5-T（三氯苯氧乙酸）；BA P（苄氨基嘌呤）、6-BA （苄基腺嘌呤）、2-Zi（异戊烯氨基嘌呤）、 KT（激动素）等。有机附加物是指甘氨酸、水解酪蛋白、椰子乳等，可促进分化，但如培养基配方适当，则大多数组织是不需要的。培养基的种类、成份直接影响到培养材料的生长发育，故应根据培养植物的种类和部位，选择适宜的培养基。

2）. 培养基的配制

①先按表1配制WS培养基贮液。

②再将贮液与其他成分按比例混合。

③加入3%的蔗糖作为碳源，起支持作用的琼脂粉8 g/L，愈伤组织培养基配方为WS培养基+NAA1 mg/L +BA1 mg/L。

④将上述培养基加热溶解后，加蒸馏水使培养基达到终体积。

⑤ 再用L NaOH 或L HCl 调节培养基的pH值至。

⑥ 分装至三角瓶内，封口膜封口，等待灭菌后使用。

2灭菌

1）．培养基及器具灭菌

培养基、无菌水需要在高压灭菌锅中灭菌。灭菌作用取决于温度，常用的灭菌温度为121℃，所需时间20分钟，灭菌结束后待温度下降到50℃以下，才能取出已灭菌的培养基。

可用同样方法对器具同时进行灭菌，包括：培养皿、解剖刀、剪子、滤纸、镊子等。

2）．工作环境灭菌

接种前1ｈ打开超净工作台和棚面的紫外灯照射40min。杀菌结束后，先关掉棚面的紫外灯，再打开风机，最后关掉超净工作台上的紫外灯。在接种后休息时，要先打开台面的紫外灯，再关风机，最后打开棚面紫外灯。不能将风机与台面上的紫外灯同时关闭或先关闭风机再开紫外灯。

3） . 植物材料的灭菌

植株各部分的表面携带着各种微生物，他们是植物组培的污染源，所以在接种培养前必须进行彻底的表面消毒；组织内部侵染的真菌或细菌很难消除，这些组织一般淘汰不用。消毒前需用流水清洗植物材料表面污垢，再用无菌洁净滤纸吸干水分。

植物材料的灭菌需在超净工作台内进行，可选择不同的灭菌剂进行植物组织表面消毒。同时注意，表面消毒剂对植物组织也是有毒的。因此，应当选择消毒剂的浓度和时间，尽量减少组织的死亡。灭菌后，需用无菌水反复冲洗，彻底洗去表面消毒剂。

如：银杏种子消毒：将银杏种子去外种皮。进超净工作台后，在%氯化汞中浸泡