973项目固氮

项目名称：高效生物固氮作用机理及其在农业中的

应用

首席科学家：王忆平北京大学

起止年限： 2004年6月至2006年8月

依托部门：教育部农业部

一、研究内容和课题设置

1.项目计划任务书原定内容

主要研究内容有：

（1）提高生物固氮效率的研究重点是克服铵阻遏、氧敏感、温度效应和能量供应问题,拟开展以下研究：

（A）固氮基因的表达调控研究(以分子遗传学为主，与农学交叉)

以自生固氮的肺炎克氏杆菌和共生固氮的苜蓿根瘤菌为模式菌株,目前已基本查清其固氮基因结构和功能研究。有关铵、氧、温度的阻遏作用中固氮基因表达的调控机理研究虽然有所进展，可是对固氮基因启动子元件和相关蛋白因子之间的、以及相关调控蛋白因子之间的相互作用仍不清楚。研究和了解这些调控机制，可为构建高效固氮的基因工程固氮菌株奠定理论基础。本研究的主要内容是固氮基因表达的调控作用，研究DNA顺式元件和结合在上的蛋白因子及蛋白因子之间的相互作用机理，从而了解影响固氮效率提高的原因，为解决高效固氮提出研究策略、方法和技术。在此基础上构建克服限制因子的高效固氮工程菌株，从而达到提高固氮效率的目的。

（B）氮碳代谢和固氮作用与光合作用偶联关系研究（以分子生物学为主，与植物生理学交叉）

最近研究发现碳代谢基因调控系统对固氮及氮代谢基因的表达也有调控作用，即碳代谢与固氮基因在调控水平的偶联关系。氮碳（合成和分解）代谢是一切生命活动的两大根本问题。在属于氮代谢的固氮作用中，能量的供应，特别对豆科植物共生固氮是一个大问题。如何通过提高光合作用效率来提高固氮作用是必须考虑的一个重要问题。再深一层的出发点是由于每种生物都有氮代谢和碳代谢，对固氮生物还有固氮作用，这三者之间究竟存在着怎样的基因调控网络，是十分基础的根本问题。对它们的了解，将对提供碳源，提高固氮作用有重要意义。本研究主要阐明微生物体内碳代谢与固氮及氮代谢之间存在的基因调控网络及其调控机制，在国际上发表高水平学术论文，并在此理论基础上为水稻、玉米、小麦等作物构建可高效利用不同碳源的高效固氮联合固氮工程菌；为大豆等作物构建高光合高固氮的共生固氮体系。

（2）提高豆科牧草共生固氮体系对干旱、盐碱、酸性、高温等环境胁迫因子的适应能力(以分子遗传学为主，与农学交叉)

针对我国西南地区的酸性、高温生态环境和西北地区的干旱、盐碱生态环境，通过对豆科牧草及其根瘤菌的遗传结构改造，提高豆科牧草共生固氮体系的抗逆能力，扩大豆科牧草在我国西部的种植范围，提高共生固氮效率，增加牧草的产量和质量。

（3）提高共生根瘤菌与宿主植物相互作用效率、扩大根瘤菌宿主范围的研究(以分子遗传学为主，与农学交叉)

共生固氮体系根瘤菌与宿主植物的关系最紧密，效率最高，它是目前生物固氮研究的焦点之一。对它的研究主要有两个目的，一是揭示根瘤菌与宿主植物相互作用机理，二是扩大宿主范围，使非豆科植物，如水稻、小麦、玉米等粮食作物也能共生固氮。这一研究涉及根瘤菌与植物两者之间的分子对话，相互识别，信息传导和基因表达的网络调控。共生固氮体系中根瘤菌与宿主植物相互关系的关键问题是识别、根瘤发育和固氮。揭示根瘤菌与宿主植物相互作用的信号传导、参与的功能基因组的时空表达及其网络调控机理，将为高效共生固氮

提出(a)解决植物碳源供应问题；(b)为扩大根瘤菌宿主范围提出策略、路线和技术途经。关于非豆

科植物自主固氮研究是生物固氮研究最长远的目标。为达此目标，首先需要对豆科植物与根瘤菌相互作用的分子机理及两者与结瘤固氮作用相关的功能基因组有了解，同时探讨非豆科植物中有多少与结瘤固氮相关的基因存在。在此基础上，为非豆科植物的自主固氮提供研究的策略和路线创造了条件。（4）固氮酶结构、功能及其催化机理研究（生物化学与化学、物理学交叉）

虽然已有固氮酶的三维结构的解析，但了解其催化机理和达到化学模拟还有一段距离。固氮酶有多样性，目前至少有三种固氮酶能固氮，现在仅仅对一种固氮酶作了三维结构研究，还有两种甚至多种固氮酶的结构不清楚。本题主要研究固氮酶结构、功能和催化机理。上述4个关键科学问题和主要研究内容，对高效生物固氮作用机理研究构成了一个系统，形成了一个整体。（具体说明每个课题的主要研究内容、目标、承担单位、课题负责人及主要学术骨干、经费比例等）

（1）共生固氮系统形成中的信号分子、信号传导及共生基因的诱导

共生固氮系统的建立是一个多相级发育过程，它受环境信号及共生双方产生的信号分子的调节，因此在逆境中使一些在实验条件下表现高固氮效能的菌株很难发挥其功效。本课题将充分利用我国共生固氮菌多样性的资源优势，研究环境信号分子及共生双方产生的信号分子的本质及信号分子的交换、识别，抗逆和共生固氮基因的顺序性表达。目的在建立高效抗逆共生固氮体系，同时也为扩大根瘤菌宿主范围和探索粮食作物自主固定提供科学依据。

主要研究目标：

•阐明共生双方产生的信号分子的本质，信号分子的交换、识别及传导途径和对共生基因的诱导。•阐明干旱、盐碱、酸性、高温及氧、铵等环境信号分子调节共生固氮作用机理，为建立抗逆共生系统提供理论基础。

研究内容：

•胞外多糖作为信号分子调节根瘤发育的研究：研究苜蓿根瘤菌胞外多糖化合物在调节根瘤发育特别是对根毛侵染中的功能，了解胞外多糖是系统信号抑或特定过程的信号；研究exo基因表达的调节机理，苜蓿根瘤菌的ChvI/ExoS双组份调节系统的调节特性；诱导苜蓿根瘤菌琥珀酰聚糖合成的环境信号，寻找和鉴定感应蛋白ExoS感应的环境信号分子。

•华葵中生根瘤菌共生固定信号分子的研究

以华葵中生根瘤菌7653R为代表，构建共生质粒的基因文库，用完全缺失与功能互补法筛选共生固氮突变株，比较研究野生型与突变株信号分子的产生与结构差异，以绿色荧光蛋白基因为报告基因构建共生融并在与紫云英共生的条件下比较研究有关信号分子的诱导、传递与时空表达关系。

•探讨根瘤菌结瘤因子信号传导途径及宿主基因的表达：

应用G－蛋白激活剂及抑制剂并结合转pENOD12-gus基因的苜蓿，证明G－蛋白及下游传导元件在结瘤因子传导过程中的存在及利用G－蛋白基因顺序及G－蛋白与结瘤因子受体相偶联的特性克隆结瘤因子受体。

•宿主植物共生结瘤基因的克隆及其表达:用苜蓿根瘤菌、紫云英根瘤菌及其突变株感染苜蓿和紫云英，从其侵染的根瘤和未侵染的根提取mRNA制得cDNA探针，以不同组合/用差异显示法从根瘤cDNA 文库筛选受信号分子诱导的宿主基因。研究这些基因的表达及信号分子对它们的诱导。

•固氮正调节基因nifA对豆科植物结瘤作用的反馈调节机制：研究nifA在结瘤过程宿主“自我调节”中的作用；nifA突变种引发的宿主过敏反应的特性，阐明nifA在根瘤菌引发的宿主防御反应中的作用及nifA突变提高根瘤数的原因；探讨nifA与多糖化合物包括结瘤因子合成及多糖化合物与宿主防御反应的关系，了解nifA在调节根瘤形成中的作用及作用机制。

•干旱、盐碱、酸性、高温地区根瘤菌的抗逆机理以从我国西部地区分离的根瘤菌为出发菌，用转座子突变筛选抗性缺失的突变株，克隆有关抗逆基因，比较研究供试菌的抗逆生理变化与作用机理，提出构建高效抗逆根瘤菌的方法与技术路线。