CGH

一．织基因组DNA抽提：DNA抽提试剂盒抽提垂体腺瘤细胞DNA二、CGH（comparative genomic hybridization）1．探针标记：（Nick translation assay）1）按下列顺序加试剂：ddH2O Y ul 双蒸水2ug genomic DNA X ul 基因组DNASpectrumGreen (Bio-) 1 ul （标记标本）SpectrumRed （Dig-） 1 ul (标记正常对照)A4 Buffer 5 ul 缓冲液nick translation enzyme 10 ul 切口酶2 ) 混匀后快速短暂离心；3)15˚C 孵育1.5小时；4) 将探针置冰上，取10ul反应物，1％凝胶电泳（100V 30min）观察DNA大小，CGH要求为500－1500bp的smear为宜，电泳时将探针保存于－20˚C如探针大小合适，加入0.5M EDT A 2ul终止反应，加TE补充至100ul，保存于－20˚C。

2．探针纯化：（G－50过柱）1）轻轻颠倒G－50柱几次（注意勿产生气泡）；2）将柱放置于15ml离心管上，拧开底部套管及揭去上部盖子；3）待柱内原有液体流至与柱上平面齐平，加3ml TE/0.1% SDS 淋洗液；4）1900rpm×5min；5）倒去离心管内液体，在离心管内放置一去盖1.5ml eppendorf管；6）从柱中间加入100ul标记好的探针样品；7）1900rpm×5min；8）用微量移液枪测量纯化后的探针体积，根据过柱后的体积计算DNA的浓度: [（DNA总量2ug －电泳消耗DNA）÷过柱后体积＝DNA浓度(过柱时丢失不计)]3．探针的沉淀和溶解：Tumor DNA 400－700ngNormal DNA 400－700ngCot-I DNA (1ug/ul) Sample DNA量的70倍3M NaAC 前三项体积和的1/10100% EtOH 前三项体积和的2.5倍1) 将上述溶液置于1.5ml EP 中，混匀，－80˚C放置30min；2) 4˚C 离心10000rpm×30min；3) 弃上清，加500ul 70％EtOH；4) 4˚C 离心10000rpm×10min；5) 加2ul TE，8ul FD 溶解DNA，Vortex 上剧烈振荡30min。

4．探针变性：75˚C水浴变性10min，立即插入冰上>5min。

5．探针预杂交：37˚C水浴1h。

6．玻片Rnase处理：1）加80ul （100ug/ml）Rnase 于盖玻片上（22mm×50mm）;2）将玻片盖在盖玻片上，注意正面朝下；3）37˚湿盒孵育30min；4）RT用2×SSC洗5min×3次5）RT用70％、90％、100％EtOH 梯度脱水各2min；6）垂直风干7．玻片PK处理：1) PK buffer 50ml 置37˚C水浴>30min，温度计测缸内温度稳定在37˚C；2) 处理前将PK (1mg/ml) 5ul 加入PK buffer中（终浓度100ug/ml）；3) 玻片浸入7min；4) RT 70％、90％、100％梯度脱水各2min；5) 空气干燥（处理好的玻片可用锡纸包裹－20˚C储存备用）。

8．玻片变性：1）先配制好70％去离子甲酰胺/2×SSC 50ml，70˚C水浴>30min，用温度计测缸内温度稳定在70˚C；70％去离子甲酰胺/2×SSC(pH 7.0) 50mlFA 35ml20×SSC 5mlddH2O 10ml加浓HCl 30ul，调整pH 7.02）出玻片观察分裂相及染色体的形态，用铅笔作好标记；3）玻片置于预热的变性液中变性（变性时间需摸索，有较大个体差异和种属差异，且老化时间长，变性时间长）；4）分别用70％、90％(冰预冷的)、100％EtOH 梯度脱水。

各2min；5）垂直风干。

9．杂交：将10ul变性并预杂交的探针加至变性良好的玻片上，排出气泡，橡皮水泥封片，37˚C湿盒孵育3天。

10．杂交后洗片：1) 洗片：将3缸50％formamide/2×SSC，3缸0.1×SSC放入42˚C水浴中预热>30min；50％formamide/2×SSC：formamide 250ml20×SSC 50mlddH2O 200ml加浓HCl 调整pH 7.02) 取出杂交后玻片，去除橡皮水泥和盖玻片，RT置于2×SSC溶液中保湿；3) 42˚C洗片，6缸×5min；4) 玻片置4×SSC/0.1%T ween20 RT中保湿；4×SSC/0.1%T ween20：20×SSC 200mlT ween20 1mlddH2O 800mlpH 7.05) 封闭非特异本底：3％lait（脱脂牛奶粉）150ul 于37˚ 30min；3％lait：lait 0.15g4×SSC/0.1%T ween20 5ml6) 浸入4×SSC/0.1%T ween20中保湿。

11．加抗体系统：1) 配制1％lait：3％lait 3ml4×SSC/0.1%T ween20：6ml2）依下列次序加抗体(大盖玻片加150ul，两张小盖玻片加40ul)，每加一次，37˚C 孵育30min，然后洗片（4×SSC/0.1%T ween20 3缸×5min，42ºC）：①Avidin T exas Red （1％lait 500ul ＋Avidin T exas Red 1.25ul,混匀）；②Anti-dig-FITC (1% lait 500ul+ anti-dig-FITC 5ul,混匀)；③Anti-avidin-antibody (1% lait 500ul+AAA 5ul,混匀)；④Anti-FITC (1% lait 500ul+AF 2ul,混匀)；⑤同①；⑥Anti-mouse-FITC (1% lait 500+anti-mouse-FITC 2ul)。

13．DAPI复染：将DAPI于Vortex上剧烈振荡，加10ul于玻片上，－20ºC过夜。

TE（TE Buffer）组成浓度：10mM Tris-HCl 1mM EDTA PH=8.0配制量：500ml配制方法：量取下列溶液于500ml烧杯中1M Tris-HCl Buffer PH=8.0 5ml0.5M EDTA PH=8.0 1ml向烧杯中加入约400mldd H2O均匀混合；将溶液定容到500ml后，高温高压灭菌；室温保存.）SSC: salt-sodium citrate 柠檬酸钠缓冲液20x浓缩液配置方法：3 M NaCl (175.3 g/liter)0.3 M Na3citrate·2H2O (88.2 g/liter)Adjust pH to 7.0 with 1 M HCl.先加3M的氯化钠再加0.3M的柠檬酸钠最后用1M盐酸把pH调整到7.0Formamide 甲酰胺Tween20为聚氧乙烯去水山梨醇单月桂酸酯和一部分聚氧乙烯双去水山梨醇单月桂酸酯的混合性状:为聚氧乙烯去水山梨醇单月桂酸酯和一部分聚氧乙烯双去水山梨醇单月桂酸酯的混合物。

作用与用途:为司盘和环氧乙烷的缩合物，由于其分子中有较多的亲水性基团一聚氧乙烯基，故亲水性强，为一种非离子型去污剂。

常作为水包油（O/W）型乳化剂；可与其他乳化剂如月桂醇硫酸钠或司盘类合用，能增加乳剂的稳定性。

也可作某些药物的增溶剂。

Tween-20有复性抗原的作用，可提高特异性的识别能力。

在做westen blot时，用惰性蛋白质或非离子去污剂封闭膜上的未结合位点可以降低抗体的非特异性结合。

封闭剂应该封闭所有未结合位点而不替换膜上的靶蛋白、不结合靶蛋白的标委、也不与抗体或检测试剂有交叉反应。

最常见的封闭剂是BSA、脱脂奶粉、酪蛋白、明胶和Tween-20（0.05 - 0.1%）稀溶液。

Tween 和同类型的Triton X-1OO(聚乙二醇辛基苯基醚)非离子型去污剂在乳化蛋白时，不破坏蛋白的结构，可减少对蛋白质之间原有的相互作用的破坏。

离子型去污剂如SDS则破坏蛋白的结构。

产品系列:吐温20(TWEEN-20)、吐温21(TWEEN-21)、吐温40(TWEEN-40)、吐温60(TWEEN-60)、吐温61(TWEEN-61)、吐温80(TWEEN-80)、吐温81(TWEEN-81)、吐温85(TWEEN-85)。

包装储存:50kg/桶、200kg/桶。

阴凉干燥处密封保存。

吐温-80 吐温-60 吐温-40 吐温-20外观浅黄色粘稠液体淡黄色粘稠液体至膏状物浅黄色粘稠液体浅黄色粘稠液体活性物 98-99% 98-99% 98-99% 98-99%溶解性溶于水、乙醇、油脂等溶于水、乙醇、油脂等溶于水、乙醇、油脂等溶于水、乙醇、油脂等闪点>150℃ >150℃ >150℃ >150℃浊点97℃ >100℃ >100℃ >100℃HLB 15 14.9 15.6 16.7水份≤1% ≤1% ≤1% ≤1%羟值 65-80 81-96 85-93 96-108皂化值 45-55 45-55 46-52 40-50酸值≤1.0 ≤1.0 ≤1.0 ≤1.0砷≤3ppm ≤3ppm ≤3ppm ≤3ppm重金属≤10ppm ≤10ppm ≤10ppm ≤10ppm。