细胞转染成功与否的八大要素
细胞转染实验总结
细胞转染实验总结引言细胞转染是生物学研究中常用的实验技术，用于将外源DNA、RNA或蛋白质引入到目标细胞中。
通过细胞转染，可以实现基因表达、基因敲除、蛋白质定位等多种研究目的。
本文总结了细胞转染实验的基本原理、常用方法和注意事项。
基本原理细胞转染实验的基本原理是通过物理或化学方法将外源DNA、RNA或蛋白质传递到目标细胞内。
细胞内的转染物质可以在细胞内进行表达、干扰或定位，从而实现对目标细胞功能的研究。
常见的细胞转染方法包括：1.电穿孔法：通过应用电流使细胞膜发生临时孔洞，从而使转染物质进入细胞内。
2.化学转染法：利用聚合物、脂质体等化学物质，将目标物质载体化，并与细胞膜结合，实现内源化学转染。
3.病毒载体介导转染法：利用病毒（如腺病毒、逆转录病毒等）作为载体，传递目标物质到细胞内。
常用方法1. 电穿孔法电穿孔法是细胞转染中常用的物理方法之一。
通过应用高电压或脉冲电场，可以使细胞膜发生临时性孔洞，从而使外源DNA、RNA或蛋白质进入细胞内。
常用的电穿孔方法包括：•电转染：将转染物质与细胞悬浮液混合后施加电脉冲，使细胞膜发生孔洞并吸收转染物质。
•静电转染：将转染物质与带正电荷的载体（如聚乙烯亚胺）混合后，与带负电荷的细胞膜相互吸引，从而将转染物质导入细胞内。
2. 化学转染法化学转染法是一种通过化学物质介导的细胞转染方法。
常用的化学转染法有：•使用聚合物：聚合物（如聚乙烯亚胺、聚合丙烯酸等）能与转染物质结合成复合物，使其稳定且易于细胞摄取。
•脂质体转染：脂质体是由磷脂、胆固醇等成分构成的脂质双层结构，可以包裹转染物质形成脂质体-转染物复合物，通过与细胞膜融合实现内源转染。
3. 病毒载体介导转染法病毒载体介导转染法是细胞转染中较常用的方法之一。
常见的病毒载体包括：•腺病毒：腺病毒是一种双链DNA病毒，可以携带大片段的外源DNA，并有效地传递到目标细胞内。
•逆转录病毒：逆转录病毒（如 lentivirus、retrovirus等）可以将外源RNA逆转录成DNA，然后整合到宿主细胞基因组中。
细胞培养转染技术的使用注意事项
细胞培养转染技术的使用注意事项细胞培养转染技术是生物学、医学研究中常用的一种技术手段，它通过引入外源DNA或RNA分子到目标细胞中，实现对细胞功能的改变和基因表达的调控。
在进行细胞培养转染技术时，需要注意以下几个方面的事项，以确保实验结果的准确性和可重复性。
1.选择合适的细胞株和培养条件在进行细胞培养转染技术之前，需要选择适合的细胞株和培养条件。
不同细胞株对转染方法的适用性有差异，因此要根据实验目的选择合适的细胞株。
此外，要做好细胞的预处理工作，保证细胞的健康状况和培养环境的稳定性。
2.选择合适的转染试剂和方法在细胞培养转染技术中，选择合适的转染试剂和方法是非常重要的。
常见的转染试剂包括化学试剂、病毒载体和电穿孔等，每种方法都有其优缺点和适用范围。
在选择转染试剂时，要考虑到实验目的、细胞类型，以及试剂对细胞的毒性影响等因素。
同时，要根据实验需要选择合适的转染方法，如瞄准细胞核或质粒转染等。
3.优化转染条件转染过程中的能量和试剂浓度等条件对转染效率有重要影响。
因此，需要进行一系列的优化实验，以确定最佳的转染条件。
可以尝试不同的试剂浓度、转染时间和培养温度等参数，以提高转染效率并减少毒性和非特异性效应。
4.合理设计实验对照组在进行细胞培养转染技术时，应合理设计对照组。
对照组是用来验证实验结果的重要组成部分，它通常包括阴性对照组和阳性对照组。
阴性对照组是指未转染或使用空载体转染的细胞，用以排除实验结果中的背景噪音和非特异性效应。
阳性对照组是指已知有效的转染试剂或方法，用来验证实验的可行性和准确性。
5.合理设计实验时间和重复次数在进行细胞培养转染实验时，需要合理安排实验时间和重复次数。
通常情况下，要在不同时间点收集样本并进行分析，以确定转染效果的持久性和稳定性。
此外，为了提高实验结果的准确性和可靠性，建议进行适当的重复实验，统计分析结果的差异性。
6.正确选择检测方法和时间在转染后，需要通过合适的方法检测目标基因或蛋白的表达情况。
细胞转染成功与否的八大要素
细胞转染成功与否的八大要素摘要: 转染是否成功的影响因素很多，如需要转染的细胞类型(对于困难的细胞系尤其如此)，需要被转染的分子(DNA、RNA、寡核苷酸、蛋白质)，转染试剂等。
但无论在何种情况下，转染的成功均取决于知己知彼，方能百战不殆。
做细胞转染也一样道理。
细胞转染实验的影响因素很多，如需要转染的细胞类型(对于困难的细胞系尤其如此)，需要被转染的分子(DNA、RNA、寡核苷酸、蛋白质)，转染试剂等。
但无论在何种情况下，以下八个要素都不容忽视。
要素一：细胞分裂细胞相比较非分裂细胞——分裂细胞往往要比静止细胞更易于摄取并表达外源DNA。
因此对大多数转染操作而言，细胞都在转染当天或前一天种板。
同样重要的是细胞在种板进行转染时不应处于过度生长的状态;此外，还常用促有丝分裂刺激物(如，病毒转化，生长因子，条件培养基，以及滋养细胞)来活化原代培养细胞。
贴壁细胞相比较悬浮细胞——在转染效率方面贴壁细胞和悬浮细胞之间的差异显著。
相对于贴壁细胞(如HEK，CHO)，悬浮细胞(如HL 60，Jurkat)非常难以转染，可能是因为细胞间膜结构的差异，但目前还没有分子水平上合理机制的解释。
分板方案——在对培养细胞进行分板传代培养之前，必须把贴壁细胞用胰蛋白酶消化使之脱离培养基质。
这个常规操作可导致正常细胞功能受到严重损害。
因此分批方案的不同(如，胰蛋白酶消化时间的长短，胰蛋白酶的灭活等)需要优化。
传代次数——传代次数是指对一个细胞系进行分批传代的频度(通常在一个实验室范围内)。
某些细胞系相比较其他细胞系而言较不稳定，可能会随着培养时间的延长而改变，视不同的细胞系和培养条件而定。
因此名称相同的同一细胞系在生理学和形态学(以及转染能力)性质也可能会有很大的差异。
一般而言，细胞在冻存复苏后的一两代之内或直到它们完全复苏之前都很难转染。
细胞数量(融合率)——只要培养基质(组织培养皿)尚有空间，细胞就会按指数规律分裂。
对于正常细胞而言，细胞生长的速度受细胞密度大小的抑制(接触抑制)，但癌细胞则不受此限制而会继续生长并可互相叠加。
细胞转染
磷酸钙法
即磷酸钙共沉淀转染法，先将DNA和氯化钙混合， 然后加入到PBS中慢慢形成DNA磷酸钙沉淀，最 后把含有沉沉淀的混悬液加到培养的细胞上， 通过细胞胞膜的内吞作用摄入DNA。磷酸钙似乎 还通过抑制血清中和细胞内的核酸酶活性而保 护外源DNA免受降解。
磷酸钙法
核酸以磷酸钙-DNA共沉淀物的形式出现时，可 使DNA附在细胞表面，利于细胞吞入摄取，或通 过细胞膜脂相收缩时裂开的空隙进入细胞内， 进入细胞的DNA仅有1%～5%可以进入细胞核中， 其中仅有不到1%的DNA可以与细胞DNA整合，在 细胞中进行稳定表达，基因转导的频率大约为 10-4，这项技术能用于任何DNA导入哺乳类动物 进行暂时性表达或长期转化的研究。此方法对 于贴壁细胞转染是最常用并首选的方法。
脂质体转染法
阳离子脂质体表面带正电荷，能与核酸的磷酸 根通过静电作用，将DNA分子包裹入内，形成 DNA脂复合物，也能被表面带负电的细胞膜吸附， 再通过融合或细胞内吞进入细胞。
脂质体转染法
脂质体转染法
1. 脂质体转染适用于把DNA转染入悬浮或贴壁培养 细胞，可用于瞬时转染和稳定转染。 2. 转染效率高，比磷酸钙法高5-100倍。 3. 能够把DNA和RNA转染到各种细胞。 4. 转染的稳定性好，可重复性高。 5. 转染时最好不加血清和抗生素。 6. 阳离子脂质体细胞毒性相对较高，对部分细胞可 能会干扰细胞的代谢。由于脂质体对细胞有一定 的毒性，所以转染时间一般不超过24小时。 7. 常用细胞类型：cos-7 、BHK、NIH3T3 、Hela等。
理想的细胞转染
转染效率高，不影响细胞正常生理活动 细胞毒性 重复性好 安全 方法简单 省时、经济
报告基因
可以直接做转染的质粒条件
可以直接做转染的质粒条件
做转染的质粒条件通常取决于所用细胞系和质粒的特性。
一般
来说，质粒转染需要考虑细胞的生长状态、转染试剂的浓度、转染
时间和转染温度等因素。
首先，细胞的生长状态对转染效率有很大影响。
通常情况下，
细胞应该处于对转染试剂敏感的状态，这通常是在对数生长期。
此外，细胞密度也需要考虑，过高或过低的密度都可能影响转染效率。
其次，转染试剂的浓度需要经过一定的优化。
例如，转染试剂（如lipofectamine）和质粒DNA的比例需要进行优化，以确保转
染试剂能够有效地将质粒DNA引入细胞内。
转染时间也是需要考虑的因素，通常来说，转染试剂和质粒
DNA的混合物需要一定的时间与细胞共培养，以确保质粒DNA能够
有效地进入细胞内。
最后，转染温度也需要注意，一般来说，37摄氏度是常用的转
染温度，但也有一些特殊的细胞系可能需要在不同的温度下进行转染。
总的来说，做转染的质粒条件需要综合考虑细胞状态、转染试剂浓度、转染时间和转染温度等因素，通过实验优化，以达到最佳的转染效果。
同时，也需要根据具体的实验要求和条件进行相应的调整和优化。
师姐整理之细胞转染技巧
师姐整理之细胞转染技巧1、细胞转染有脂质体转染，病毒转染、电转染、磷酸钙法、显微注射….下面主要讲最常用的脂质体lip2000介导的细胞转染。
2、转染效率影响因素：1、细胞种类，细胞状态，2、质粒大小，3、转染试剂。
3、转染前细胞的状态和密度都非常影响转染效率和后期的实验结果。
转染时细胞的密度为50%-80%较好，同时注意在转染后收细胞时的密度不要过爆。
比如转染质粒到细胞内，48小时后做WB，那么此时细胞的密度最好不要长满. 因为细胞长的过爆严重影响细胞的状态（周期进程阻滞，凋亡增加等）从而影响实验结果。
一般为前一天下午铺板，第二天上午进行转染，48小时候收细胞进行功能检测。
4、不同的质粒和脂质体最佳搭配比例不同，转染前，应该摸一个最佳配比。
质粒：脂质体=1：1， 1：1.5， 1：2， 1：2.5， 1：3，1：3.5的梯度比例来检测最佳转染比例（一般质粒有带荧光，可以通过观察每组荧光强弱来判断转染效率，没有荧光的只能通过qPCR来检测各组转染效率）。
5、质粒的纯度影响转染效率：1、脂质体转染基于电荷吸引原理，如果DNA不纯，如带少量的盐离子，蛋白，代谢物污染都会显著影响转染复合物的有效形成及转染的进行。
2、含有内毒素的质粒对细胞有很大的毒性作用。
建议使用QIAGEN公司的超纯质粒抽提试剂盒。
6、转染时，小心轻柔的将lip2000加到培养基中并轻轻混匀（说明书上的用词为：Mix gently），避免粗暴用力吹打，会导致脂质体失效。
7、转染时各种培养皿添加的质粒和脂质体参考量见下表：8、虽然现在的大多数转染试剂可以使用带血清的培养基进行转染，但转染时建议用无血无抗生素的opti-MEM培养基提高转染效率。
转染后6小时更换培养基，一是lip2000具有一定毒性，二是培养基需要更换成有血清培养基。
9、支原体污染会严重影响细胞转染的效率，且支原体污染不会像细菌污染那么明显可见，转染前可以用环丙沙星杀一杀支原体。
转染效率低的原因
转染效率低的原因1.细胞类型：不同细胞株在基因转染上的敏感性和响应性各不相同。
一些细胞株对基因转染过程中用的化学试剂和转染载体的特异性反应较弱，从而导致转染效率低。
2.细胞状态：在基因转染前，细胞的状态也会对转染效率产生影响。
例如，细胞过度密集化时，细胞的生理状态可能会发生改变，从而降低了细胞对外源基因的摄取和表达能力。
3.细胞数量：正确选择合适的细胞数量进行转染也是一个重要因素。
如果细胞数量太少，可能会使细胞的可见表达效应降低。
4.转染试剂和载体的选择：不同的细胞株可能对不同的试剂和载体具有不同的敏感性。
因此，在选择试剂和载体时应根据细胞类型进行优化选择，以提高转染效率。
5.转染方法：转染方法不正确或不合适也是转染效率低的原因之一、例如，电穿孔法可能会导致细胞膜破裂，细胞死亡，从而影响转染效率。
6.微环境：转染过程中，细胞所处的微环境也会影响转染效率。
细胞培养温度、pH值、离子浓度、细胞培养液成分等都可能对细胞的生长和基因表达产生影响。
7.DNA质量：外源基因的质量也是影响转染效率的一个重要因素。
如果外源基因的质量不好，可能会导致转染效率低。
8.转染时间：转染的时间可能会影响转染效率。
如果转染时间太短，细胞未能充分与外源基因接触；而如果转染时间太长，则可能导致细胞受损或死亡。
9.细胞状态：细胞生长阶段也会影响转染效率。
例如，细胞处于分裂期或静止期时，可能不容易转染成功。
10.细胞培养条件：培养基的成分、温度、CO2浓度等因素都会影响细胞生长和基因表达，从而影响转染效率。
综上所述，基因转染效率低的原因有很多，包括细胞类型、细胞状态、细胞数量、转染试剂和载体的选择、转染方法、微环境、DNA质量、转染时间、细胞状态以及细胞培养条件等。
为了提高转染效率，需要对这些因素进行优化和调整，以满足实验要求。
细胞转染实验注意事项
细胞转染实验注意事项细胞转染是生物学研究中常用的实验技术之一，通过将外源DNA 或RNA导入目标细胞中，使其表达特定的基因或分子，从而研究基因功能和信号转导等生物学过程。
在进行细胞转染实验时，有一些注意事项需要遵守，以确保实验的准确性和可重复性。
一、选择合适的细胞系在进行细胞转染实验前，首先要选择合适的细胞系。
不同的细胞系对转染条件和效率有很大的差异，因此需要根据实验目的选择最适合的细胞系。
常用的细胞系包括HEK293、HeLa、CHO等，选择合适的细胞系可以提高转染效率和表达效果。
二、优化转染条件转染条件的优化对于获得高转染效率和表达水平非常重要。
转染条件包括转染试剂、转染时间、转染剂和DNA或RNA浓度等。
不同的细胞系和转染试剂可能需要不同的优化条件。
一般来说，转染时间不宜过长或过短，转染剂的浓度也需要合理调整，以获得最佳的转染效果。
三、验证转染效果为了确保转染实验的准确性，需要对转染效果进行验证。
常用的验证方法包括荧光显微镜观察、Western blot、实时定量PCR等。
荧光显微镜观察可以直接观察转染细胞中是否有荧光信号，Westernblot和实时定量PCR可以检测目标基因或蛋白的表达水平。
通过这些验证方法，可以判断转染实验是否成功，并对实验结果进行进一步分析。
四、对照组设计在进行细胞转染实验时，为了排除非特异性效应和误差，需要设计相应的对照组。
常用的对照组包括阴性对照组和空载体对照组。
阴性对照组是指不转染外源DNA或RNA的细胞，用来排除实验中可能存在的非特异性效应。
空载体对照组是指转染空载体的细胞，用来排除转染载体本身对目标基因或蛋白表达的影响。
五、注意细胞毒性某些转染试剂和转染条件可能对细胞产生毒性效应，影响实验结果。
因此，在进行细胞转染实验时，需要注意选择低毒性的转染试剂和合适的转染条件，以保证细胞的健康状态和实验结果的准确性。
六、合理设计实验方案在进行细胞转染实验时，应合理设计实验方案。
细胞转染实验中易出现的问题
细胞转染实验中易出现的问题
细胞转染是细胞生物学和分子生物学的一种常用的技术手段。
而转染效率低下却是实验人员经常遇到的问题，尤其是原代细胞转染，转染难度更大。
现分享几个细胞转染实验中易出现的问题，望实验人员能够注意。
1.准备不足
做细胞转染的时候，在开展正式实验前要多做预试验，优化转染条件。
优化转染条件包括：转染试剂的用量、DNA密度、细胞密度、试剂和DNA混合孵育时间等等。
2.细胞污染
细胞污染也是造成细胞死亡，转染效率低下的一大原因。
首先，转染细胞用的质粒必须保证无菌。
而现在市场上的一般的质粒提取试剂盒都做不到绝对无菌。
分享一个小秘诀：将提完质粒后或者提的最后一步，用75％乙醇沉淀，这样就除菌了。
3.质粒质量问题
转染用的质粒首先要保证数量，一般为2μg以上。
质粒纯度不够或者含有细菌LPS或其他对细胞有毒害作用的物质，也会影响转染效率。
这个时候，就应该对质粒进行纯化和浓缩。
4.细胞状态不好
细胞状态不好，会导致转染效率低下。
一般进行转染的细胞应该处于对数生长期。
如果是贴壁细胞的话，贴壁率应该在70-80%；如果是悬浮细胞的话，应该是6×105个/孔（24孔板），一般是转染前一天换液，转染前用无血清培养基或PBS洗细胞一次。
5.转染试剂问题
脂质体试剂毒性较大，易造成细胞死亡和转染效率底下。
可选择非脂质体转染试剂，如Entranster试剂。
影响细胞转染成败的原因分析
影响细胞转染成败的原因分析转染是否成功的影响因素很多，如需要转染的细胞类型(对于困难的细胞系尤其如此)，需要被转染的分子(DNA、RNA、寡核苷酸、蛋白质)，转染试剂等。
但无论在何种情况下，转染的成功均取决于转染效率、低细胞毒性以及重现性这几个要素。
1、载体DNA总则：对纯化所得的载体进行质量鉴定。
确定维持其正常功能的基因序列是否适合于您的细胞体系。
在测定细胞体系的参数时，一定要选用一种已知具有功能的载体做对照。
·载体的完整性——载体是否具有功能取决于它结构的完整性。
转染效率受到质粒制备物的超螺旋结构和舒展结构之间比例、双螺旋断裂、核酸酶的降解，以及来自于储存和处理过程中的物理压力的影响。
·载体制备物——各种载体是按照不同的方案在细菌体系中制备并纯化。
制备产物中残余的污染物(如CsCl，内毒素)可能会影响转染效率。
·载体构造(启动子/增强子/ORI)——转染体系通常用带有强病毒调节元件(如，RSV，CMV，和SV40)的对照载体进行优化和比较。
然而，病毒启动子/增强子体系的相对有效性在不同细胞系间的差异可大到两个数量级。
例如，在某些细胞系中，由于自发的质粒扩增，SV40体系可高效表达large T抗原(如，COS)；而在其他许多细胞系中，则是CMV启动子更为有效。
除此之外，各种CMV载体的表达率也会有超过一个数量级的差异，这部分是由于载体中其他调节元件所引起的。
2、细胞·贴壁细胞相比较悬浮细胞——在转染效率方面贴壁细胞和悬浮细胞之间的差异显著。
相对于贴壁细胞(如HEK，CHO)，悬浮细胞(如HL 60，Jurkat)非常难以转染，可能是因为细胞间膜结构的差异，但目前还没有分子水平上合理机制的解释。
·分裂细胞相比较非分裂细胞——分裂细胞往往要比静止细胞更易于摄取并表达外源DNA。
因此对大多数转染操作而言，细胞都在转染当天或前一天种板。
同样重要的是细胞在种板进行转染时不应处于过度生长的状态；此外，还常用促有丝分裂刺激物(如，病毒转化，生长因子，条件培养基，以及滋养细胞)来活化原代培养细胞。
转染步骤及经验
转染步骤及经验
1.根据要进行体细胞转染的实验的特殊要求，选择适当的载体质粒，以及目标细胞。
2.制备转染的DNA样本：根据质粒的大小和实验的要求，严格控制样本的DNA浓度，并确保其质量良好，无杂质；
3.准备转染液：将转染的DNA样本和必要的添加剂放入适量的
PBS/DMEM中混合，形成转染液；
4.细胞放入转染液中：把细胞放入适量转染液中，使细胞与转染液充分混合；
5.细胞转染：细胞转染的方法有优化的转染技术（如脉冲转染）和非优化转染技术（如胞浆转染），根据实验对转染效果的要求，选择合适的转染技术；
6.细胞休眠：细胞休眠后，为后续实验提供了理想的条件，简化接下来的操作。
7.细胞筛选：有些载体质粒将特定的标记物（如GFP）植入细胞内，接着，使用不同颜色的染料或者发光技术，筛选出转染后的细胞，这将有助于后续的实验。
8.检测转染效率：使用细胞膜染色，PCR，蛋白表达分析来检测转染效率，以证实转染是否成功。
9.细胞接种：转染细胞分离后，接种到HMVEC或其他细胞上，以复制体系，以便进一步的研究。
细胞转染是一个复杂的过程，需要仔细地操作。
细胞转染的影响因素有哪些？
细胞转染的影响因素有哪些？
转染过程中许多因素会影响转染效率：如细胞种类、细胞密度；质粒大小、质粒纯度；血清；抗生素；转染试剂等。
转染实验中，以下几个因素需多加注意。
1. 转染前的细胞状态和密度转染时细胞密度以70~90%（贴壁细胞）或2×106~4×106细胞 / mL（悬浮细胞）为宜，细胞密度过高会严重影响细胞状态（周期进程阻滞，凋亡增加等）。
转染效率随着细胞传代次数不同会发生很大变化，因为传代次数少的细胞转染率非常低，而对传代次数较多的细胞而言，其转染最佳剂量差别较大。
同时支原体污染会严重降低细胞的转染效率，因此转染前可用环丙沙星处理细胞以除去支原体。
2. 转染时的质粒纯度假使质粒不纯，如带少量盐离子，蛋白、代谢物污染等都会显著影响转染复合物的有效形成；而含有内毒素的质粒对细胞存在很大的毒性作用。
抗生素一般对真核细胞无毒，但转染过程中细胞通透性增加，使抗生素进入细胞，从而降低细胞活性，导致转染效率低下。
3. 转染后的筛选时间转染后筛选不能太早或太晚，因为转染了外源基因的细胞代谢负荷大，增殖较慢，太晚会被没有外源基因转入的细胞所淹没，最终导致筛选不出阳性克隆。
一般要在转染 48 h 之后开始加抗生素筛选。
转染流程示意图
4. DNA 与转染试剂的比例许多转染方法需要优化 DNA 与转染试剂的比例。
不同细胞系转染效率通常不同，细胞系的选择通常根据实验需要确定。
在转染前应根据实验要求和细胞特性选择合适的转染试
剂，不同转染试剂转染效率差别很大，好的转染试剂能让您事半功倍。
进行转染实验时需要注意的因素
转染——让克隆的核酸进入真核细胞中，已经成为研究和控制真核细胞基因表达的重要手段。
比如表达纯化特定的蛋白；鉴定一个基因的生物学特性；突变分析；研究基因表达对细胞生长的影响，研究基因表达的调控机制等等，等等。
如今广义的转染不单包括了DNA、RNA，还有蛋白质等生物大分子。
很多因素会影响转染效率，细胞株本身啦，细胞培养环境啦，转染的DNA、RNA或者蛋白的质量和特性啦，转染方法啦，等等。
每个转染高手也必然有自己的独门心经，只可惜大家都为实验或者生活而疲于奔命，没有几个人愿意静下心情来仔细总结经验汇集成文字——那些曾经用无数失败的痛苦烦恼换回来的宝贵经验，那些曾经以为会永远铭刻于脑海的教训，随时间的流逝而终于渐渐褪色，到模糊。
即使偶尔有珠玉掩埋于浩瀚的口水中，也难以汇串成珠。
试剂盒的盛行，让实验更快，更简单，也更机械化，相信更多人更愿意先抓起Protocol 123地往下做，直到碰壁再苦思原因。
其实等碰得遍体鳞伤回头一看就会醒悟，很多坑，只要事前注意了就不会陷进去的。
DNA转染后，转入基因的表达可以在1－4天内检测到——仅有一部分转入细胞的DNA被转运到细胞核内进行转录并最终输出mRNA到细胞质进行蛋白合成。
几天内，大部分外源DNA 会被核酸酶降解或随细胞分裂而稀释；一周后就检测不到其存在了。
因此转染也可以分为瞬时转染和稳定转染。
瞬时转染（transient transfection）指的是转染的核酸不整合到染色体上，结果是短暂的高水平表达，可在24—96小时内检测表达效果，表达水平与位置无关，不会受到周围染色体元件的影响。
瞬时表达分析所需的人力和时间比稳定表达少，但因为DNA摄入效率和表达水平在不同实验中差异较大，不长久也不稳定。
超螺旋质粒转染更倾向于瞬时表达。
瞬时表达适合研究启动子等调控元件——不过，诱导型的启动子除外。
稳定转染，就是转染的质粒DNA整合到染色体上，或者相当于附加子（episome）可持续存在，使得转染的细胞可长期表达。
293t细胞电转染条件
293t细胞电转染条件
293T 细胞电转染条件的成功率和效率往往受到多种因素的影响，包括转染试剂、细胞状态、电场强度、电脉冲时间、转染时间、转染浓度等等。
因此，不同的实验室可能会有不同的电转染条件，需要根据实际情况进行摸索和优化。
其中，细胞状态是影响电转染成功率的关键因素之一。
如果细胞状态不佳，例如饥饿、衰老或感染等情况，可能会影响转染效率和品质。
因此，在进行电转染之前，需要对细胞状态进行评估，并进行相应的处理，以提高转染成功率和效率。
此外，电场强度、电脉冲时间、转染时间等因素也会影响电转染的成功率和效率。
一般来说，较高的电场强度和较短的电脉冲时间可以提高转染效率，但过长的电脉冲时间可能会影响细胞状态和寿命。
同时，转染时间也需要根据具体的转染试剂和目标基因进行优化，以提高转染效率和品质。
总结起来，293T 细胞电转染条件需要进行充分的实验和摸索，
并结合具体情况进行优化和调整。
同时，需要注意保持实验的标准化和规范化，以确保实验结果的可靠性和可重复性。
原代细胞转染条件
原代细胞转染条件
原代细胞转染是一种将外源DNA或RNA转移到原代细胞内的技术，可以用来研究细胞功能、基因表达和信号传导等方面。
然而，原代细胞转染技术因为细胞的易损性和复杂性而非常具有挑战性。
以下是一些常见的原代细胞转染条件和技巧：
1. 转染试剂的选择：选择适当的转染试剂是成功的关键。
有许
多转染试剂可供选择，如脂质体、聚合物、病毒和电穿孔等。
各种试剂的效果因细胞类型而异，因此需要根据实验目的和细胞类型进行选择。
2. 细胞密度：细胞密度也是影响转染效率的因素之一。
通常，
细胞密度应该适中，太多或太少都会影响转染效率。
一般来说，最佳细胞密度是在80-90％的细胞对数生长期。
3. 转染时间：转染时间也是影响转染效率的重要因素。
转染时
间过长或过短都会导致低转染效率。
通常，最佳转染时间取决于转染试剂的类型和细胞类型。
4. 转染浓度：转染浓度也是影响转染效率的因素之一。
通常，
过高或过低的转染浓度都会影响转染效率。
一般来说，最佳转染浓度应该是根据细胞类型和转染试剂的类型进行优化。
5. 转染前的细胞处理：在转染之前，需要对细胞进行处理，以
提高转染效率。
例如，可以预处理细胞，将其暴露于低渗透压的缓冲液中，以增加细胞膜通透性。
总的来说，原代细胞转染技术需要根据不同的细胞类型和实验目
的进行优化。
正确选择转染试剂、控制细胞密度和转染时间、调节转染浓度和进行细胞前处理等技巧都可以提高转染效率并确保实验成功。
细胞实验：影响转染实验的因素
细胞实验：影响转染实验的因素细胞实验:影响转染实验的因素转染技术是指将外源分子如DNA，RNA 等导入真核细胞的技术。
随着分子生物学和细胞生物学研究的不断发展，转染已经成为研究和控制真核细胞基因功能的常规工具。
在研究基因功能、调控基因表达、突变分析和蛋白质生产等生物学试验中，其应用越来越广泛。
影响转染效率的因素有很多，细胞株本身的特性和活性，细胞培养条件，转染的DNA 或RNA 的质量，转染方法，转染试剂的选择等。
常规转染技术可分为两大类，一类是瞬时转染，一类是稳定转染（永久转染）。
前者外源DNA/RNA 不整合到宿主染色体中，因此一个宿主细胞中可存在多个拷贝数，产生高水平的表达，但通常只持续几天，多用于启动子和其它调控元件的分析。
一般来说，超螺旋质粒DNA 转染效率较高，在转染后24-72 小时内（依赖于各种不同的构建）分析结果，常常用到一些报告系统如荧光蛋白，β - 半乳糖苷酶等来帮助检测。
后者也称稳定转染，外源DNA 既可以整合到宿主染色体中，也可能作为一种游离体（episome）存在。
尽管线性DNA 比超螺旋DNA 转入量低但整合率高。
外源DNA 整合到染色体中概率很小，大约1/104 转染细胞能整合，通常需要通过一些选择性标记，如来氨丙基转移酶（APH；新霉素抗性基因），潮霉素B 磷酸转移酶（HPH），胸苷激酶（TK）等反复筛选，得到稳定转染的同源细胞系。
转染效率受多种因素影响，主要因素有下面几个：1．转染试剂不同细胞系转染效率通常不同，但细胞系的选择通常是根据实验的需要，因此在转染实验前应根据实验要求和细胞特性选择适合的转染试剂。
每种转染试剂都会提供一些已经成功转染的细胞株列表和文献，通过这些资料可选择最适合实验设计的转染试剂。
当然，最适合的是高效、低毒、方便、廉价的转染试剂。
2．细胞状态一般低的细胞代数（<50）能确保基因型不变。
最适合转染的细胞是经过几次传代后达到指数生长期的细胞，细胞生长旺盛，最容易转染。
细胞DNA转染效率影响因素
细胞DNA转染效率影响因素
1，质粒的大小和质量
线性化还是超螺旋会影响转染结果：超螺旋质粒的转染效率比线性DNA高得多，特别是瞬时转染。
而线性化DNA转染的整合几率高。
质粒太大了转染会困难一些。
毕竟，相对致密、较小的外源异物被细胞内吞的几率要大一些。
如果你的质粒正好比较大，又没有经验，选择特别注明可以转大质粒的转染试剂成功几率会高一些。
有的转染试剂还会提供一些促进DNA凝聚的成分，使得DNA形成转染复合物时更致密一些，更容易转染一些。
纯化质粒的质量也会影响转染效率，一定要选择高质量的质粒。
2，质粒DNA的浓度和量
既然质粒纯化已经不成问题，初学者通常都不会在乎甚至愿意多加点DNA，但是要注意的是，DNA量过少固然转染效率不高，DNA 量过多同样会降低转染效率。
所以预实验需要按照说明书的要求，按一定比例混合适量的质粒DNA和转染试剂。
有的转染试剂要求DNA 的量多些，有的转染试剂效率高只要很少DNA。
3，转染试剂的选择
在确定了质粒的质量之后，就要考虑转染试剂的选择了。
目前大多数用的是脂质体类的转染试剂，但这类试剂的毒性较大，转染效率低，最好选择非脂质体的转染试剂，如Entranster试剂。
影响转染效率的因素.doc
影响转染效率的因素转染效率收多种因素影响，主要因素有下面几个：1. 细胞培养物健康的细胞培养物是成功转染的基础。
不同细胞有不同的培养基，血清和添加物。
低的细胞代数（<50）能确保基因型不变。
高的转染效率需要一定的细胞密度，一般的转染都会有专门的说明。
推荐在转染前24 小时分细胞，这将提供正常细胞代谢，增加对外源DNA 摄入的可能。
一定要避免细菌，支原体或真菌的污染。
2. 血清大多数培养基在使用前需要加血清。
胎牛血清（FCS）经常用到，便宜一点的有马或牛血清。
通常的，血清是一种包含生长因子及其它辅助因子的不确切成分的添加物，对不同细胞的生长作用有很大的差别。
血清质量的变化直接影响转染效率。
因此在转染前建议先测(转右) 试出对细胞生长良好的血清批号，转染时用同一批号的血清，并同时做负对照（不加转染试剂及外源DNA）以测试细胞生长是否正常。
有些转染技术如脂质体转染在有血清存在情况下效率很低，因此在转染前要除血清。
但有些对此敏感的细胞如原代细胞会受到损伤，甚至死亡导致转染效率极低。
3. 载体构建转染载体的构建（病毒载体，质粒DNA，RNA，PCR 产物，寡核苷酸等）也影响转染结果。
病毒载体对特定宿主细胞感染效率较高，但不同病毒载体有其特定的宿主，有的还要求特定的细胞周期，如逆转录病毒需侵染分裂期的宿主细胞，此外还需考虑一些安全问题（如基因污染）。
除载体构建外，载体的形态及大小对转染效率也有不同的影响，如前面提到的超螺旋及线性DNA 对瞬时和稳定转染的影响。
如果基因产物对细胞有毒性作用，转染也很难进行，因此选择组成或可调控，强度合适的启动子也很重要，同时做空载体及其它基因的相同载体构建的转染正对照可排除毒性影响的干扰。
4. DNA 质量DNA 质量对转染效率影响非常大。
一般的转染技术（如脂质体等）基于电荷吸引原理，如果DNA 不纯，如带少量的盐离子，蛋白，代谢物污染都会显著影响转染复合物的有效形成及转染的进行。
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细胞转染成功与否的八大要素摘要: 转染是否成功的影响因素很多，如需要转染的细胞类型(对于困难的细胞系尤其如此)，需要被转染的分子(DNA、RNA、寡核苷酸、蛋白质)，转染试剂等。
但无论在何种情况下，转染的成功均取决于知己知彼，方能百战不殆。
做细胞转染也一样道理。
细胞转染实验的影响因素很多，如需要转染的细胞类型(对于困难的细胞系尤其如此)，需要被转染的分子(DNA、RNA、寡核苷酸、蛋白质)，转染试剂等。
但无论在何种情况下，以下八个要素都不容忽视。
要素一：细胞分裂细胞相比较非分裂细胞——分裂细胞往往要比静止细胞更易于摄取并表达外源DNA。
因此对大多数转染操作而言，细胞都在转染当天或前一天种板。
同样重要的是细胞在种板进行转染时不应处于过度生长的状态;此外，还常用促有丝分裂刺激物(如，病毒转化，生长因子，条件培养基，以及滋养细胞)来活化原代培养细胞。
贴壁细胞相比较悬浮细胞——在转染效率方面贴壁细胞和悬浮细胞之间的差异显著。
相对于贴壁细胞(如HEK，CHO)，悬浮细胞(如HL 60，Jurkat)非常难以转染，可能是因为细胞间膜结构的差异，但目前还没有分子水平上合理机制的解释。
分板方案——在对培养细胞进行分板传代培养之前，必须把贴壁细胞用胰蛋白酶消化使之脱离培养基质。
这个常规操作可导致正常细胞功能受到严重损害。
因此分批方案的不同(如，胰蛋白酶消化时间的长短，胰蛋白酶的灭活等)需要优化。
传代次数——传代次数是指对一个细胞系进行分批传代的频度(通常在一个实验室范围内)。
某些细胞系相比较其他细胞系而言较不稳定，可能会随着培养时间的延长而改变，视不同的细胞系和培养条件而定。
因此名称相同的同一细胞系在生理学和形态学(以及转染能力)性质也可能会有很大的差异。
一般而言，细胞在冻存复苏后的一两代之内或直到它们完全复苏之前都很难转染。
细胞数量(融合率)——只要培养基质(组织培养皿)尚有空间，细胞就会按指数规律分裂。
对于正常细胞而言，细胞生长的速度受细胞密度大小的抑制(接触抑制)，但癌细胞则不受此限制而会继续生长并可互相叠加。
营养物质的耗竭以及代谢废物的积聚会影响所有的细胞生长。
细胞会因受到营养物质匮乏的压力而不适于转染。
报告基因的表达率与转染开始时的细胞数量和细胞健康以及细胞溶解之前的生长情况相关。
培养物污染——培养物可被细菌、酵母、真菌、病毒、支原体、甚至其他细胞种类所污染。
各种污染都会导致产生错误的结果。
支原体污染——支原体污染在所有培养细胞中的比例为5-35%，它可改变细胞生长特性，酶的作用途径，细胞膜的组成，染色体结构，以及转染效率。
特别是，支原体对采用脂质、DEAE-右旋糖酐、磷酸钙或腺病毒介导的转染技术有所干扰，其结果致使非典型转染或转染效率偏低。
这些影响会导致实验结果的不可靠以及时间和珍贵细胞系的损失。
和细菌及真菌不同，支原体污染无法通过视觉检查发现。
它们非常小甚至能够通过大多数的无菌滤膜;它们还对常用抗生素有抗药性。
所以必需进行支原体污染的常规筛查。
要素二：载体DNA一般原则：对纯化所得的载体进行质量鉴定。
确定维持其正常功能的基因序列是否适合于您的细胞体系。
在测定细胞体系的参数时，一定要选用一种已知具有功能的载体做对照。
载体的完整性——载体是否具有功能取决于它结构的完整性。
转染效率受到质粒制备物的超螺旋结构和舒展结构之间比例、双螺旋断裂、核酸酶的降解，以及来自于储存和处理过程中的物理压力的影响。
载体制备物——各种载体是按照不同的方案在细菌体系中制备并纯化。
制备产物中残余的污染物(如CsCl，内毒素)可能会影响转染效率。
载体构造(启动子/增强子/ORI)—转染体系通常用带有强病毒调节元件(如，RSV，CMV，和SV40)的对照载体进行优化和比较。
然而，病毒启动子/增强子体系的相对有效性在不同细胞系间的差异可大到两个数量级。
例如，在某些细胞系中，由于自发的质粒扩增，SV40体系可高效表达large T抗原(如，COS);而在其他许多细胞系中，则是CMV启动子更为有效。
除此之外，各种CMV载体的表达率也会有超过一个数量级的差异，这部分是由于载体中其他调节元件所引起的。
要素三：组织培养试剂一般原则：优化您的细胞生长条件。
只使用新鲜配制的培养基和添加剂，并尽可能减少所用试剂的变更。
基础培养基——培养基的成分包括营养物质(氨基酸，葡萄糖)，维生素，无机盐，和缓冲物质。
有些成分非常不稳定，因此如果在使用时不是新鲜，加入就可能会产生问题。
配置时要使培养基务必避光保存;因为已知有一些组分和缓冲物质，如HEPES，当暴露于光照下就会分解产生细胞毒性物质。
胎牛血清——血清是一种含有白蛋白、球蛋白、生长促进因子和生长抑制因子的极为复杂的混和物。
采集血清所用动物的年龄、营养水平和健康状况可影响到血清中这些成分的数量和质量，从而引起显著生物学变化。
添加剂——某些细胞的生长依赖于一些对生命力或细胞分裂必不可少的物质(如，生长因子，微量元素，必需代谢物和蛋白等)。
CO2培养箱——细胞生长所需环境为37℃、相对湿度为95%的CO2培养箱。
用CO2是为了控制pH值，细胞生理对pH的变化非常敏感，因此多数细胞培养基都含有碳酸氢盐缓冲体系。
有些培养基需要CO2 浓度为5%来有效控制pH值，而另一些则需要10%的CO2。
需要向您的培养基供应者核对一下适当的CO2浓度。
如果培养箱内培养条件与所需条件不一致(温度、湿度和CO2)则会导致实验结果的板间变异。
来自于培养箱内的污染物、化学物质，或真菌/细胞的污染也都可能影响到细胞生理。
要素四：使用瞬时转染来生产蛋白瞬时转染表达蛋白以往为了获得蛋白质的高表达产量，必须先转染细胞，然后挑选一个稳定的转染细胞系进行蛋白的扩增和富集。
而挑选这样一个细胞系往往需要花费数周甚至数月的时间，这既可能是由于试剂的细胞毒性也可能是由于转染的低效率。
如果是因为转染试剂具有细胞毒性，那么只有少数细胞能够存活，从而导致蛋白质的产量很低。
而如果是因为转染成功的细胞太少，那么那些未转染的细胞生长速度大大超过转染成功的细胞，其结果同样也只能产生少量的目标蛋白。
使用一种温和的可以转染大多数细胞的转染试剂，就可获得蛋白质的高表达。
现将一些影响蛋白高效表达的关键因素分列如下：细胞系(有些类型的细胞比其他细胞产量高)质粒骨架(例如：增强子，启动子，转录调控元件)目的蛋白(有些蛋白很难获得高表达量)目的蛋白的cDNA序列(例如：密码子的优化)培养条件(营养物，代谢废物，转染抑制物)当这些因素都得到优化，并加入合适配比和数量的转染复合物(转染试剂-质粒)后，就可获得至少达到平均表达水平的稳定表达克隆。
要素五：瞬时转染和稳定转染制备一种稳定细胞系的第一步是选择一种同时含有选择性标记物和目的基因的载体。
选择性标记物通常是可以产生一种蛋白质或者酶来帮助细胞在某些毒性物质存在下存活的基因。
一旦选好了质粒载体，无论瞬时或者稳定表达都采用一样的转染方法。
在加入选择性试剂之前，被转染的细胞至少要在标准培养基中培养过夜。
这样就使细胞有时间表达足量的蛋白使之能够耐受选择性试剂的作用。
细胞于是在加有选择性试剂的培养基中生长。
那些未成功转染质粒的细胞即被杀死。
而只有那些成功转染的细胞能够生长。
有的时候，还可以将选择性试剂持续加入到培养基中，以维持对细胞的选择压力。
要素六：转染方案一般原则：建立一套适当的转染方案;首先从一种标准方案开始，然后通过改变试剂/DNA的配比和复合物的剂量进行优化。
转染复合物的制备——诸如转染试剂/DNA配比，离子强度，缓冲液pH值，以及温度等变量都会影响到转染复合物的组成和功能。
质粒可用无菌水或TE缓冲液稀释。
如果您要使用一种市售的转染试剂，就应当仔细阅读该试剂所提供的使用说明。
在不含血清或其他蛋白的培养基中制备转染复合物;如果制备复合物所使用的培养基含有血清，它就会对转染产生抑制。
制备转染复合物的最佳孵育时间是一个非常关键的环节，对于不同的转染试剂而言可能差别很大。
转染试剂/DNA配比(负载比)——所有的转染试剂都会在某一个试剂/DNA配比时最为有效。
有时候这种最佳配比的所在范围非常狭窄;而且对于每种实验体系都必须进行优化才能得到最佳配比。
形成转染复合物所用的稀释剂——对于多数试剂而言，很关键的一点是要使转染复合物能在普通基础培养基或盐溶液中形成。
转染复合物的加入——有两种替换方法可用来将转染复合物加入转染细胞：1.将复合物浓缩液逐滴加入培养基，或者2.将转染复合物先用培养基稀释，然后进行培养基更换操作。
第一种方法更简便，而第二种方法则更因为避免了试剂在局部浓聚而产生毒性，所以会使结果的一致性更好。
要素七：时间进度一般原则提示：要确保最终结果的成功;建立一个合适的时间进度进行转染实验以保证您所需要的目的蛋白能得到最佳表达。
转染的开始——在转染前12小时，将细胞分种于培养板中。
在细胞达到50-80%的融合率时开始转染，这样就可以使它们在实验结束时达到接近100%的融合。
细胞对转染复合物的摄取通常在0.5-6小时的时间内完成。
在这段时间后，就不会再发现转染效率有所增长。
培养基更换——某些转染试剂在摄取阶段之后需要更换培养基。
如果转染必须在没有胎牛血清存在的条件下进行，那么这一步骤就必不可少。
而对于可在血清存在的情况下使用的无毒性转染试剂时，如果有足够的培养基用于后续表达阶段，就可以省略这一步。
如果将转染复合物留在培养基中直到进行检测，那么对有些细胞系而言转染效率会有所提高，而另外一些细胞在转染开始几个小时之后其转染效率就不会再有升高。
虽然在转染步骤之后转染试剂/DNA复合物通常不一定要从培养体系中清除，但在此后的长期生长阶段换用新鲜的培养基却是必须的。
如果转染细胞需要生长3-7天，换培养基就尤其重要，这样一来就使它们有时间达到最高的蛋白表达量。
时间测定——转染开始后的24-48小时内，报告基因产物的浓度逐渐增加;而这种增加取决于增强子的强度、表达外源蛋白中所涉及的细胞反应，存活细胞的健康状态，以及营养因素等。
在转染后等待3-7天收集蛋白进行纯化较为常见了。
最后就是平时可能会忽略的转染试剂本身的脱靶效应off-target effect，转染试剂本身对基因表达水平(高表达或低表达)的影响，有时候可能会造成假阳性的结果。
我自己的体会是，一般的细胞，用脂质体2000和fugeneHD转染效率相差不大，虽然最近有文献说脂质体2000脱靶效应很高，但国内在乎的人貌似不多;但是干细胞，原代细胞和肿瘤细胞等一些比较难转的细胞系，Fugene HD比较温和，细胞毒性很低，转染效率明显要好;悬浮细胞，各有千秋，不敢说一定可以，重在尝试，要是都不行，就电转吧。
要素八：交叉污染如果同一个实验室同时培养不同种类的细胞，那就有可能发生交叉污染，即使遵循最严格的分离操作规程这种情况也有可能发生。