农杆菌介导的转化所用基本培养基配方
农杆菌的活化培养及介导的遗传转化
农杆菌的活化培养及介导的遗传转化一、目的要求通过实验掌握农杆菌的活化与培养技术与农杆菌介导获得目的基因的转化植株。
二、基本原理农杆菌共培养法最早是由Marton 等（1979 年）以原生质体为受体建立起来的，经过一系列改进后，目前已经成为最常用的转化方法。
共培养法是利用Ti 质粒系统，将农杆菌与植物原生质体、悬浮培养细胞、叶盘、睫段等共同培养的一种转化方法。
三、材料及方法1.含目的基因共整合载体或双元载体的根癌农杆菌。
2.植物幼苗。
（一）细菌培养液直接浸染法操作︰（1）无菌受体材料的准备︰叶片、睫段、胚轴、子叶等均可做受体材料，有两种来源。
取自无菌试管苗。
取自田间或温室栽培植株︰叶片、睫尖、睫段用蒸馏水冲冼1 遍后，70％乙醇洗45 秒，0.1％升汞消毒6～8 分钟，无菌水冲洗三遍，无菌滤纸吸干水分。
（2）受体材料预培养︰将无菌叶片剪成0.5cm×0.5cm 的小块或用6mm 打孔器凿成圆盘，无菌胚轴、睫切成约0.8～1cm 长的切段，接种在愈伤组织诱导或分化培养基上进行预培养，注意叶片近轴面向下︰预培养2～3 天，材料切口处刚刚开始膨大时即可进行侵染。
（3）农杆菌培养︰从平板上挑取单菌落，接种到20mL 附加相应抗生素的细菌培养液体培养基（pH7.0）中，在恒温摇床上，于27℃, 180r/ min 培养至OD600 为0.6～0.8。
取OD600 为0.6～0.8 的菌液，按1％～2％的比例，转入新配制的无抗生素的细菌培养液体培养基中，可在与上相同的条件下培养6 小时左右，OD600 为0.2～0.5 时即可用于转化；或同时加入100～500μmol/的AS；（4）侵染︰于超净工作台上，将菌液倒入无菌小培养皿中（可根据材料对菌液的敏感情况进行不同倍数的稀释）。
从培养瓶中取出预培养过的外植体，放入菌液中，浸泡适当时间（一般1～5 分钟，不同材料处理时间不同）。
取出外植体置于无菌滤纸上吸去附着的菌液。
(整理)9311农杆菌介导转化体系
9311农杆菌介导转化体系（注：培养基“+”的为灭菌冷却到60℃后加）（一）诱导愈伤幼胚：取生长一致的植株，剥去主茎外层、叶鞘，将穗子剪成小段，在超净工作台上先用75％酒精浸5 min，用无菌水冲洗1次，再用次氯酸钠原液抽真空约10min至不冒气泡，再放于摇床振荡40min，无菌水冲洗4～5次，然后在灭菌滤纸上小心挤出幼胚，放于诱导培养基（NB）上。
每皿30粒，置于25~26℃下暗培养，以诱导愈伤组织。
除不能萌发的幼胚外，愈伤诱导率到达98%。
幼胚的萌发和污染受幼胚灭菌效果和接种操作的影响，所以请小心操作。
（大概一周左右能见愈伤从盾片中长出，视愈伤和芽生长情况选择掐芽、继代时间，如图1）图1 适合掐芽作继代的9311幼胚愈伤成熟种子：分别挑选健康籽粒剥去颖壳，置于37℃培养箱过夜。
种子取出后放入灭菌的三角瓶中，先用体积分数为75％的乙醇表面灭菌5min，用无菌水冲洗1次，0.1％HgCl2消毒12 min，用无菌水冲洗5次，再放入次氯酸钠原液消毒40 min，无菌水冲洗5次，于灭菌的滤纸上晾干，然后接种到诱导培养基上（9311为NB+ ABA 1mg/L），让胚的一半接触培养基。
每皿20粒，置于25~26℃下暗培养，以诱导愈伤组织。
（通过对四种基本培养基NBKNB、NB、MSTC、J0和NB+ ABA 0.5mg/L、NB+ ABA 1mg/L、NB+ NAA0.5mg/L、NB+ NAA1mg/L的研究表明，9311在NB+ ABA 1mg/L培养基中的诱导率是85%）大概在两周左右愈伤长出、芽也比较长的时候掐去芽或者直接继代，具体时间视愈伤和芽的生长情况定，如图2、3是比较好的时期。
图2 适合掐芽的9311成熟种子图3 掐了芽的9311成熟种子，继续放于诱导培养基中，这样状态的愈伤也可以去除谷粒和愈伤中的芽头直接转到继代J3中，但注意在去除谷粒和愈伤中的芽头时不要伤到愈伤也要去除干净（二）继代培养20天后，挑选表面干爽、结构致密的愈伤组织，去除谷粒和愈伤中的芽头转到继代培养基上J3，这时候谷粒中营养已经被吸收而变软，继代培养1~2次，每次20天。
根癌农杆菌介导的真菌转化
根癌农杆菌介导的真菌转化以下是为大家整理的根癌农杆菌介导的真菌转化的相关范文，本文关键词为根癌,杆菌,介导,真菌,转化,根癌,杆菌,介导,真菌,转化,，您可以从右上方搜索框检索更多相关文章，如果您觉得有用，请继续关注我们并推荐给您的好友，您可以在综合文库中查看更多范文。
根癌农杆菌介导的真菌转化(一)农杆菌电击感受态制备及电击转化A感受态的制备1)将农杆菌菌液划线于Yeb平板（50μg/mlkana），28℃，36-48h。
2)挑单菌落至3mlYeb试管（50μg/mlkana）中，28℃，200rpm培养过夜。
3)转1ml至50mlYeb中，28℃，200rpm培养至oD600=0.8。
4)于4℃，5000rpm，10min收集菌体。
5)用50mL10%的甘油（去离子水配置，湿热灭菌）洗沉淀3次（4℃，5000rpm，10min），洗涤时一定要把菌体悬浮均匀。
6)重悬于1ml10%甘油中（约1011个细胞/ml），可立即使用，或分装为每管50μl，液氮速冻后，-80℃保存备用。
b电击转化1)将1μl质粒加入到农杆菌感受态细胞中，混匀，转至无菌预冷的电击杯中。
2)将电击杯放入电转化仪的电极之间，16kv/cm，5ms。
3)取出电击杯，迅速加入200-300μlYeb（不加抗生素），并将混合液转入ep管中。
4)于28℃，220rpm，2-3h。
5)将50-100μl菌液涂布于Yeb平板（50μg/mlcar和50μg/mlkana）上，于28℃培养2-3天后，挑斑鉴定。
(二)农杆菌化学感受态制备及化学法转化petentcells1)Inoculateasinglecolonyto5mlLb2)growat28℃tologphage,shakingat250rp m3)Inoculate2mlofthecultureto50mlLbmediumandgrowtooD600=0.5ca.8h ours4)chillonicefor10minutes5)spindownthecellsbycentrifugationat3000g(8000rpm)for10minutesat4℃6)Resuspendcellsin1mlof20mmcacl27)Aliquotsinto0.1ml,thenfreezeinliquidnitrogen,andstoreat-80℃bplasmid Transformation1)Thawcompetentcellsonice.2)Add1μgplasmid(5μl)tothecompetentcellsandmixwell.3)Freezeinliquidni trogenfor5min.4)heatshockat37℃for5min.5)Add1mlLbandgrowat28℃for3hrwithshakingat150rpm.6)spreadcellsontoLbplatescontaininganappropriateantibioticandincubate atroomtemperaturefor2-3days.(三）农杆菌介导的真菌转化1将已转入目的质粒的农杆菌接种于4mlYeb液体培养基（50μg/mlcar和50μg/mlkana）中，于28℃摇床中220rpm过夜培养（16-20h）。
农杆菌介导的烟草转化
准备菌液LB 300ml(加抗生素Kan,Rif)
1L MS, 分装300ml (SIM,无抗生素20个平板)，500ml(SIM,有抗生素，倒培养瓶)，200ml（液体，做悬浮液）
Kan,Rif / Basta,Rif
1.根癌农杆菌的活化
挑取单菌落，接种于含抗生素的LB 液体培养基（Rif 50μ g/ml和Kan 50-100μg/ml）中，28℃-30℃200rpm 振荡培养过夜。
2.农杆菌介导叶盘法转化植物
①农杆菌菌体处理
挑取农杆菌菌株接种于LB培养基中（含rif 50μg/ml和kan50μg/ml），200rpm，28℃培养24h，菌液OD600至1.0 左右，离心10min（3000rpm），沉淀菌体。
再用10ml左右的MS液体培养基悬浮，稀释菌体的OD600值为0.3-0.5。
②叶盘法转化转化植物程序
选取理想状态的外植体，在超净台上剪成小方块或者打成叶圆片（大小不限），在制备好的农杆菌菌液中浸染3-5min，置于无菌吸水纸吸干，平铺于SIM （MS+1mg/L6-BA+0.1mg/LNAA）培养基（无抗生素）上黑暗共培养2 天，2天后将外植体转移至含筛选因子的芽诱导培养基如SIM（MS+1mg/L6-BA+0.1mg/LNAA+Basta 5mg/L+500μg/ml的carb素或500Cef）上进行筛选。
待有芽生成（3~4周）后，继续培养到苗高2~3厘米时，转入生根培养基RIM（MS+ kan50μg/ml+500μg/ml的羧卞青霉素或500Cef）上，进行根诱导生长。
Cb: 羧卞青霉素; Cef:头孢霉素。
发根农杆菌培养基 配方
发根农杆菌培养基配方
发根农杆菌（Agrobacterium rhizogenes）是一种植物病原体，具有诱导植物发生根状结构的能力。
培养发根农杆菌需要使用特定的培养基，以下是一种常用的发根农杆菌培养基的配方，通常称为RMB （Rhizobium Meliloti Broth）培养基：
Rhizobium Meliloti Broth (RMB) 培养基配方：
成分：
1.卡拉胶（Carob bean gum）: 0.2g
2.酵母提取物（Yeast extract）: 0.5g
3.酵母膏（Yeast autolysate）: 0.5g
4.硫酸镁（Magnesium sulfate）: 0.2g
5.硫酸钙（Calcium sulfate）: 0.02g
6.葡萄糖（Glucose）: 1.0g
7.麦芽提取物（Malt extract）: 0.5g
8.氯化钠（Sodium chloride）: 0.1g
9.硫酸钠（Sodium sulfate）: 0.02g
10.磷酸二氢钾（Potassium dihydrogen phosphate）: 0.3g
pH值调整：
•使用氢氧化钠（NaOH）或盐酸（HCl）将培养基调整至pH 7.0。
注意：
•所有成分都需溶解在蒸馏水中，并在121°C高压蒸汽灭菌20分钟。
•在培养基中加入适当的抗生素，以选择性地培养Agrobacterium rhizogenes。
这个配方是用于培养发根农杆菌的基础培养基，具体的实验需求和菌株的特性可能需要根据实际情况进行一些微调。
在实验中使用培养基时，请根据具体实验目的和研究要求进行适当的修改。
农杆菌瞬时转化法
农杆菌瞬时转化法:一、本氏烟草的种植⑴配制基质中各成分比例如下,花卉营养土:蛭石:沙土=2:1:1，22℃16h/8h （光/暗）70%湿度（扣透明白盒2周保湿）⑵将基质浇透水后,烟草种子采用移液器点播在基质中,每盆播1，2粒种子,2-3天浇一次水。
二、农杆菌注射烟草叶片1、3周烟草(4 leaves stage)，选取生长状态良好，健壮的烟草叶片植株（年轻的、完全展开的4周大小）进行农杆菌侵染。
转化前将浇透水，转化后要控制浇水2、农杆菌准备:预培养：接种克隆至5ml LB+Antibiotics培养：用1mL预培养液接种至50ml LB+abtibiotics +Acetosyringon(final 20 µM)含Rif (100 mg/mL)、Str (100 mg/mL)和Kan (50mg/mL)三种抗生素的YEB液体培养基活化农杆菌（(GV3130)）。
检测菌液生长到指数后期 OD600=0.6，4000rpm，室温离心10min收获菌液3、配悬浊液:混匀后于4°C保存;4、重悬液（经常15ml）（10 mM MES-KOH，pH 5.6, 10 mM MgCl2, 100 μM acetosyringone乙酰丁香酮）重悬至OD600=1，（可以洗涤2次）5、同时也将同样培养的含有P19的农杆菌同样悬浮并调整悬浮液的浓度为OD600=16、根据实验设计,将以上三类农杆菌0.7:0.7:1.0体积混合,室温下静置3-4h，7、注射前烟草放在白色日光灯下1h，让气孔充分张开8、Agroinfiltration 注射：重悬菌体，用1 mL注射器（去针头）吸取菌液；避开叶脉，用注射器针在叶片上开小孔后，左手抵住叶片正面，右手轻轻将注射管口垂直压在叶片反面，右手拇指缓慢均匀用力推压，观察菌液在叶片表皮下缓慢移动，直至侵染整个叶片。
（一个植株可以注射2个叶片，不要用子叶）塑料薄膜覆盖，22℃、3天后撕取叶片下表皮于激光共聚焦显微镜下观察。
转基因的步骤
1.5 农杆菌介导的水稻快速转化1.5.1 各种培养基成分水稻快速转化的培养基成分如表2-1，N6D培养基用于愈伤组织诱导和筛选，2N6-AS 为共培养培养基，AAM 用于配制农杆菌浸染液，RE-III 为分化培养基，HF 为生根培养基，AB 培养基用于农杆菌的活化。
其中，配制固体培养基时，固定剂使用0.4%的Gerite。
1.5.2 种子的消毒（1）水稻成熟种子去壳；（2）置70%乙醇1min，弃乙醇，用无菌水清洗5 次；（3）在每50ml 的 2.5%次氯酸钠溶液中滴 1 滴吐温20 混匀，然后放入乙醇处理过的水稻种子，浸泡15min，无菌水清洗 5 次；（4）在 2.5%次氯酸钠溶液中再灭菌15min，无菌水清洗 5 次。
1.5.3 种子的接种和愈伤组织诱导将灭菌后的成熟种子平摆于诱导培养基上，在常光照、32℃条件下培养5-8d。
1.5.4 浸染液的制备（1）取出 1.4 中所保存的含有目标质粒的单克隆，吸取50μl 保菌液均匀涂布于固体AB培养基上，AB培养基中含50mg/L卡那霉素和50mg/L利福平，28℃条件下培养2-3d；（2）刮取AB 培养基上的农杆菌，用AAM 重悬农杆菌，用AAM 稀释至OD600为0.1。
1.5.5 愈伤组织侵染和共培养（1）取出诱导5-8d 的水稻愈伤组织，切去胚乳和芽鞘；（2）将生长状态良好的愈伤组织置于浸染液中，浸泡5-8min；（3）取出愈伤组织，置灭菌滤纸上，吸取愈伤组织表面的侵染液；（4）在2N6-AS 培养基上铺一层无菌滤纸，并用AAM 浸湿；（5）将浸染后的愈伤组织均匀平放于2N6-AS 培养基；（6）在25℃、黑暗条件下共培养3d。
1.5.6 抗性愈伤的筛选（1）共培养愈伤组织的洗涤：取出共培养的愈伤组织，放入含400mg/L 羧苄青霉素的抑菌液中清洗，共洗 5 次，每次浸泡6min左右；（2）倒去洗涤液，将愈伤组织移到无菌滤纸上，尽量蘸干愈伤组织表面的液体；（3）将愈伤组织均匀平放于N6D+培养基上，32℃、常光照条件下培养，直到新的愈伤组织长出，需两周左右。
水稻转基因方法及培养基配放个
根癌农杆菌介导的转化方法将水稻成熟种子去壳。
仔细剔除有霉菌点籽粒，取饱满清亮籽粒先用７０％乙醇浸泡（表面消毒）1min ，再用含2%活性氯含量的NaClO溶液（加1-3滴Tween20）浸泡30min以上（最长可至1小时左右），并不断摇动，然后用无菌水冲洗4-5次；将灭菌后的成熟种子置于无菌滤纸上吸干多余水分，直接接种于N2D6培养基上，于24-26ｏC暗培养7-10 天，诱导出初生愈伤组织；将上述从成熟胚诱导的初生愈伤组织直接用于与农杆菌的共培养转化；农杆菌的准备是在含有50mg/mL km的LB 平板上划线，培养含有重组质粒的农杆菌，28ｏC培养36h。
挑取活化的单个农杆菌菌落，在28ｏC于3mL 含km 的LB培养基中振荡培养过夜，第2天按1.5/50（V/V）接种量在AB液体培养基中培养，培养程度以稍早于生长对数期为宜（OD600约为0.6-0.8 ）。
离心回收新鲜培养的农杆菌，并重悬于约1/2-1/3体积的AAM（含100-400mol·L-1乙酰丁香酮）液体培养基中，至OD600约为0.8-1.0左右为宜；将愈伤组织切下，立即投入含农杆菌的AAM重悬液中，浸泡15-20分钟，并不断摇动。
将感染后的愈伤组织置于无菌滤纸上吸干多余的菌液，转入共培养基N6D2C上培养3天（26ｏC，暗培养）。
转入筛选培养基N6D2S1上与24-26ｏC 暗培养条件下筛选2周。
新鲜长出的抗性愈伤组织或不褐化的愈伤组织转入筛选培养基N6D2S2上，继续筛选培养2次，每次2周。
将抗性愈伤组织转入MSPR培养基上进行预分化处理14天，其中先在暗条件下培养7天，然后转入光条件下培养7天；经预分化处理的愈伤组织转入MSR培养基分化再生，在光下培养；再生的小苗在1/2MS0培养基上生根壮苗。
农杆菌介导转化水稻所用培养基-1-1 626蔗糖，2mg·L-1 2,4-D, 2.5g·L-1Phytagel( sigma) ,pH5.8N6D2S1N6D2，25mg·L-1潮霉素B（Roche），500mg·L-1头孢霉素（cefotaxime）N6D2S2N6D2，50mg·L-1潮霉素B，300mg/mL头孢霉素2424442 150mg·L-1KCl, 10mg·L-1CaCl2, 2.5mg·L-1FeSO4·7H2O, 5g·L-1葡萄糖，pH7.0AAM AA（Toriyama和Hinata，1985）盐分和氨基酸，MS（Murashige和Skoog 1962）维生素，0.5g·L-1酪蛋白水解物，36g·L-1葡萄糖，68.5g·L-1蔗糖，100-400µmol·L-1乙酰丁香酮，pH5.2N6D2C N6D2, 10g·L-1葡萄糖，100-400µmol·L-1乙酰丁香酮（用时现加），pH5.2预分化与分化再生MSPR MS（Murashige和Shog，1962）盐分和维生素，0.5g·L-1酪蛋白水解物，50g·L-1蔗糖，2mg·L-16-BA，1mg·L-1NAA, 5mg·L-1ABA ，3.0g·L-1Phytagel, pH 5.8，50mg·L-1潮霉素B，200mg·L-1头孢霉素。
农杆菌转化法操作流程
农杆菌转化法操作流程下载温馨提示：该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。
本文下载后可定制随意修改，请根据实际需要进行相应的调整和使用。
并且，本店铺为大家提供各种各样类型的实用资料，如教育随笔、日记赏析、句子摘抄、古诗大全、经典美文、话题作文、工作总结、词语解析、文案摘录、其他资料等等，如想了解不同资料格式和写法，敬请关注!Downloaded tips: This document is carefully compiled by the editor. I hope that after you download them, they can help yousolve practical problems. The documents can be customized and modified after downloading, please adjust and use it according to actual needs, thank you!In addition, our shop provides you with various types of practical materials, such as educational essays, diary appreciation, sentence excerpts, ancient poems, classic articles, topic composition, work summary, word parsing, copy excerpts,other materials and so on, want to know different data formats and writing methods, please pay attention!在现代生物技术领域，农杆菌转化法是一项广泛应用的重要技术，它被用于将外源基因导入到植物细胞中，从而实现对植物基因组的改良和调控。
农杆菌转化
农杆菌转化植物表达载体转化农杆菌操作步骤第一部分：农杆菌介导转化水稻1、农杆菌选择：LBA4404、EHA105、GV31012、农杆菌活化：将保存的农杆菌在固体LB培养基上画线（或加或不加抗生素，LBA4404:Rif 或Str；EHA105：Rif或Str；GV3103：庆大霉素。
如果不加抗生素就有可能造成这些菌株的Ti质粒丢失，导致农杆菌缺乏侵染性），抗生素浓度为：50μg/ml。
28℃培养。
3、农杆菌感受态细胞的制备：1）挑取单菌落接种于3ml LB液体培养基中，220rpm 28℃振荡培养至OD600 =0.5。
2）吸取1.5ml菌液于离心管中，冰浴10min；3）5000（13000）rpm离心30s，弃去上清液；4）沉淀用1.5 ml 0.5M NaCl悬浮,冰浴20min；5）5000（13000）rpm离心30s，弃去上清液；6）每管用100μl 20mMCaCl2悬浮，用于转化；制备好的感受态细胞可马上使用，也可按每管200ul分装于无菌离心管中，于4℃保存48小时内使用，长期贮存时必须在液氮中速冻后转一70℃保存。
使用时从一70℃取出，置冰上融化后使用。
4、DNA直接转化农杆菌：1）50μl农杆菌感受态细胞中加入质粒DNA 0.1～1μg（5－10ul），之后冰浴30 min；2）放入液氮中5min（或1min），然后立即放入37℃水浴锅中水浴5min；3）取出离心管，加入0.5mlLB，28℃、220rpm振荡培养3～5hr；4）取出菌液于含相应抗生素的LB平板上涂板，在培养箱中28℃条件下倒置培养。
2天左右菌落可见。
（pEmu载体：AMP+Rif/Str；pK载体：Kan＋Rif/Str；pTCK载体：Kan＋Rif/Str）5、重组农杆菌鉴定：1）挑取单菌落，接种于含相应抗生素的LB液体培养基中，28℃振荡培养过夜。
（pEmu载体：AMP+Rif/Str；pK载体：Kan＋Rif/Str；pTCK载体：Kan＋Rif/Str）2）小量提取质粒DNA，加GTE同时加5μL溶菌酶（50μg "ml -1，贮藏浓度为50mg/ml 或10mg/ml）。
水稻农杆菌转化方法
方法1NB基本培养基(右边的为N6,大量相同,加glycine甘氨酸2 mg/L)KNO3 2830 mg/L(NH4)2SO4 463 mg/LKH2PO4 400 mg/LMgSO4.7H2O 185 mg/LCaCl2.2H2O166 mg/LFeSO4.7H2O 27.8mg/L 5.6Na2EDTA 37. 5 mg/L 7.5MnSO4.4H2O 10 mg/L 27.8H3BO3 3 mg/L 1.6ZnSO4.7H2O 2 mg/L 1.5Na2MoO4.2H2O 0.25 mg/L 0.25CuSO4.5H2O 0.025 mg/L 0.025CoCl2.6H2O 0.025 mg/L 0.025KI 0.75 mg/L 0.8盐酸硫胺素thiamine CHL VB1 10 mg/L 0.1盐酸吡哆醇pyridoxine-CHL VB6 1 mg/L 0.5烟酸nicotinic acid 1 mg/L 0.5肌醇myo-inositol 100 mg/L 100水解酪蛋白300 mg/L谷氨酰胺500 mg/L脯氨酸500 mg/L蔗糖30,000 mg/LPHytagel 2.6 mg/LpH 5.8Basic培养基B N6（大量）50ml （20倍）A Ms-Fe盐10-20ml（100倍）CH 0.3g/LS B5 macro 10ml （100倍）phytogel 4g/L或agar 8g/L I B5 vita 10ml （100倍）sucrose 30g/LC proline 0.5g/L glutamine 0.5g/LN6 (大量梗稻种子) 终浓度母液(20倍) 终浓度母液(20倍)培KNO32830mg/L56.6g/L Mg SO4.7H2O185 mg/L 3.7 g/L养(NH4)2SO4463 mg/L9.26 g/L CaCl2.2H2O 166 mg/L 3.32 g/L基KH2PO4400 mg/L8.00 g/L制备1 KNO3, (NH4)2SO4, KH2PO4同时倒入烧杯,加水搅拌, 使之完全溶解.2 Mg SO4.7H2O 先溶于加了100ML水的烧杯中溶解后再缓慢倒入1中,边倒边搅, 不能有沉淀.3 CaCl2.2H2O的配制同Mg SO4.7H2O4 配好后放于棕色瓶4℃保存MS(大量籼稻种子)终浓度母液(20倍) 终浓度母液(20倍)培KNO31900 mg/L38g/L Mg SO4.7H2O 370 mg/L7.4 g/L养NH4NO3 1650 mg/L33 g/L CaCl2.2H2O 440 mg/L8.8 g/L基KH2PO4170 mg/L 3.4 g/L制备1 KNO3, NH4NO3, Mg SO4.7H2O同时倒入烧杯,加水搅拌2 KH2PO4先溶于加了100ML水的烧杯中溶解后再缓慢倒入1中,边倒边搅,3 CaCl2.2H2O同KH2PO44 配好后放于棕色瓶4℃保存Ms(大量花药用)终浓度母液(20倍) 终浓度母液元素KNO32830mg/L56.6g/L Mg SO4.7H2O 370 mg/L7.4 g/L培养(NH4)2SO4 231 mg/L 4.62 g/L CaCl2.2H2O 160 mg/L3.2 g/L基KH2PO4641 mg/L12.82 g/L制备1 KNO3, (NH4)2SO4, KH2PO4同时倒入烧杯,加水搅拌2 Mg SO4.7H2O 先溶于加了100ML水的烧杯中溶解后再缓慢倒入1中,边倒边搅,不能有沉淀.CaCl2.2H2O的配制同Mg SO4.7H2O3 配好后放于棕色瓶4℃保存YM脓杆菌培养基KH2PO4 0.5g/L Mannitol 10g/L L-Glutamine2g/LNaCl 0.2g/L M g SO40.2g/L Yeast extract0.3g/LAgar 15g/L PH=7.0诱导愈伤、继代培养基basic+2,4-D(2mg/L) PH=5.8共培养培养基液体:N6(大)+Fe+B5(micro)+B5(vita)+ sucrose(前四项与basic相同)+ 肌醇2g/L+ CH500mg/L+phytogel+0.1%AS固体:N6(大)+Fe+B5(micro)+B5(vita)+ sucrose(前四项与basic相同) + 肌醇2g/L+ CH500mg/L+2,4-D (2mg/L)+ phytogel +0.1%ASPH=5.5 加2,4-D前后都要调PH值.灭完菌,温度降下来后加AS筛选培养基诱导愈伤+cef(300mg/L)+hyg(50mg/ml) PH=5.5一筛,二筛的cef,hyg的浓度依次逐渐下降分化1: basic+KT(4mg/L)+NAA(0.25mg/L)+cef(300mg/L)+hyg(50mg/L)培养2: basic+KT(0.5mg/L)+NAA(0.25mg/L)+6-BA(2mg/L)+cef(300mg/L)+hyg(50mg/L)基PH=5.8分化培养基NB培养基：6-BA,2.5mg,NAA,0.25mg,KT,0.5mg壮苗培养基(生根)sucrose 30g/L N6 25ml/L MS-Fe盐10ml/LB5vita 10ml/L agar 7g/LMS-Fe盐(必须单独配制,否则会沉淀,用鳌合铁)终浓度母液(100倍)FeSO4.7H2O 27.8mg/L 2.78g/LNa-EDTA 37.5mg/L 3.75g/L制备1 FeSO4.7H2O溶解于水, Na-EDTA溶解于热水,将两者混合定容,于微波炉中加热,煮沸,颜色变深,冷却到室温,补水, 棕色瓶4℃保存2,4-D母液(1g/ml) 用无水乙醇溶解2,4-D后缓慢加入到H2O中,搅拌,如产生沉淀,则重配.配好后4℃保存NAA母液(1g/ml) 用1N KOH 溶解NAA,用水稀释定容, 4℃保存PAA母液(1g/ml) 用无水乙醇溶解加H2O搅拌,定容,4℃保存6-BA母液(1g/ml) 用HCl溶解, 加少量HCl后,用玻棒研磨成糊状,再加HCl使之完全溶解AS（乙酰丁香酮）用DMSO直接溶解定容19.62mg/ml,分装到无菌小管KT 母液(5mg/ml)用1NKOH溶解，用水稀释定容到10ml，过滤灭菌后分装到EP管中，冰冻保存B5 vitamin终浓度母液(100倍) 终浓度母液(100倍)肌醇100mg/L 10g/l Nico-acid 1mg/l0.1g/lpyrido(B6) 1 mg/L 0.1 g/l thiamin(B1) 10 mg/L1 g/l棕色瓶4℃保存(每次配100ml为好), 肌醇在配培养基时,加入到培养基中B5(micro)KI 0.75mg/L H3BO3 3.0mg/L MnSO4 10mg/L ZnSO4 2.0mg/LNa2MnO4.2H2O 0.25mg/LCuSO40.025mg/L CoCl20.025mg/L程序1.种子去皮，挑成熟完整健康的种子2.用70%乙醇清洗浸泡2-3分钟，洗3-4次，用0.1%升汞浸泡20-40分钟3.无菌水洗3至4次4.置于虑纸上吹干,吹3小时以上5.摆放到诱导愈伤培养基上，黑暗中培养15-20天，直到长出黄色较大的愈伤6.剥下愈伤，转至继代培养基上，黑暗培养2周7.共培养。
农杆菌介导油菜转化实验
农杆菌介导的油菜遗传转化操作流程一、所需试剂母液配制方法1. MS母液配制方法见小孢子培养部分。
2. 6-BA（6-苄基嘌呤）：配制成0.1 mg/ml的母液拿来兑，称取0.1g 6-BA用微量HCl溶解，无菌蒸馏水定容至1000 ml。
3. NAA（α-萘乙酸）：配制成0.1 mg/ml的母液拿来兑，称取0.1g NAA用微量NaOH溶解，无菌蒸馏水定容至1000 ml。
4. 2,4-D（2,4-二氯苯氧乙酸）：配制成0.1 mg/ml的母液拿来兑，称取0.1g 2,4-D用微量NaOH溶解，无菌蒸馏水定容至1000 ml。
5. AgNO3：称取0.5 g AgNO3溶于无菌蒸馏水，定容至100 ml，0.22μm滤膜过滤。
6. AS（乙酰丁香酮）：溶解于DMSO（二甲基亚砜），母液浓度为100 mM，0.22 μm有机系滤膜过滤，分装成小份保存。
7. Kan（卡那霉素）：称取5 g溶于无菌蒸馏水，定容至100 ml，0.22μm滤膜过滤，分装成小份 -20℃长期保存。
8. Carb（羧苄青霉素）：称取5 g溶于无菌蒸馏水，定容至100 ml，0.22 μm滤膜过滤，分装成小份 -20℃长期保存。
9. Cef（头孢霉素）：称取5 g溶于无菌蒸馏水，定容至100 ml，0.22μm滤膜过滤，分装成小份 -20℃长期保存。
二、操作流程1. 无菌受体材料的准备选取饱满、干净的油菜种子用75%乙醇浸泡1 min，然后在0.1%升汞中灭菌10~15 min，无菌水冲洗4~5次，用无菌滤纸吸干多余的水分，接种于1/2 MS（添加10 g/L 蔗糖，0.7 % 琼脂，pH 5.8）培养基上，25~28℃下暗培养，待种子萌发再移至光下培养，光照16 h/d，强度2000 lx左右。
2. 受体材料的预处理取4~6 d的无菌苗子叶或下胚轴作为转化受体。
用解剖刀切下完整的子叶（带1~2 mm子叶柄）或下胚轴（5~10 mm），将切下的外植体置于预培养基（MS +30 g/L 蔗糖 + 0.7% 琼脂 + 1 mg/L 6-BA + 1 mg/L 2,4-D，pH 5.8）上进行预培养2~3 d，材料切口处刚开始膨大时即可进行接种浸染。
实验六、农杆菌介导转化拟南芥
• （1）形态个体小，生活力强,种子量大；
• （2）生长周期快，从播种到收获种子一般只需 6--8周；
• （3）基因组小(2n=10)，是目前已知植 物基因组中最小的，但是具有完成“复 杂”的植物生长发育的所有基因；
2. 取上述菌液0.1ml 接至50ml 新鲜YEB液体培养基（50 g/ml Kan，125 g/ml Rif）中，28℃ 220rpm培养2～4h， 使OD值达到0.8左右。
3.取上述菌液1ml于EP管中，室温22℃，5500g，离心15min， 弃去上清，用转化介质重悬沉淀至OD值达到0.8左右。
Hale Waihona Puke • 为了提高转化率，去除塑料袋3d后，用吸管吸 取适量重悬目的质粒的新鲜转化液，逐个醮沾 花蕾。
说明
• 转化后拟南芥的培养恢复正常管理，一旦再出现 侧蘖或主苔出现分枝，及时剪除。
• 转化5-6周后，为了加速拟南芥成熟可以适量少浇 营养液。待拟南芥个别角果开始枯黄后，可将其 角果剪下放于培养皿内干燥。拟南芥角果大部分 枯黄后，即可收取全部种子存于1.5ml 的EP管中 （在盖上扎一小孔以便干燥）。种子完全干燥后， 放于1.5ml 新EP管中4℃短期保存。如需要可放于 -20℃冰箱内长期保存。
Vir区
2.3 双元表达载体系统
•
双元表达载体系统主要包括两个部分：
•
一部分为卸甲Ti质粒，这类Ti质粒由于缺失了T
－DNA 区域，完全丧失了致瘤作用，主要是提供Vir
基因功能，激活处于反式位置上的T－DNA的转移。
农杆菌介导的转化所用基本培养基配方
农杆菌介导的转化所用基本培养基配方
1. 无机盐基础培养基：无机盐主要提供细胞生长所需的元素和离子。
常用的基础培养基包括Murashige和Skoog培养基（MS培养基）。
MS培
养基中含有较高浓度的无机盐，可以促进农杆菌的生长和转化效率。
2.碳源：碳源为农杆菌提供能量和碳源。
常用的碳源包括葡萄糖、果糖、蔗糖等。
3.氮源：氮源为农杆菌提供氮元素，促进细胞生长和代谢活性。
常用
的氮源包括氨态氮（氨水、胆固醇等）和硝酸态氮。
4.维生素：维生素是促进细胞生长和代谢活性的必需物质。
常用的维
生素包括硫胺素、核黄素、叶酸等。
5.激素：植物生长激素可以促进植物细胞的增殖和分化，常用的植物
生长激素包括激动素、生长素等。
除了基本培养基成分外，为提高农杆菌介导的转化效率，还可以添加
一些辅助物质，例如：
1.亚硫酸类：亚硫酸类物质可以抑制农杆菌生长，同时也可以促进DNA转化和表达。
例如，L-半胱氨酸和亚硫酸钠等。
2.胆盐：胆盐可以增加细胞膜的通透性，提高DNA转化效率。
常用的
胆盐有胆固醇和胆酸钠等。
3.缓冲剂：缓冲剂可以维持培养基的pH稳定，常用的缓冲剂包括葡
萄糖酸和磷酸盐等。
总结起来，农杆菌介导的转化所用的基本培养基配方包括无机盐基础
培养基、碳源、氮源、维生素和激素等成分。
为提高转化效率，还可以添
加亚硫酸类物质、胆盐和缓冲剂等辅助物质。
不同实验室和实验目的可能会有些许差异，在实际操作中可以根据需要进行相应的调整。
农杆菌培养基配方
农杆菌培养基配方哎呀，说到农杆菌培养基配方，这可真是个技术活儿。
我得说，这玩意儿可不简单，得精确到毫克，还得注意无菌操作，不然一不留神，培养基就废了。
不过，别担心，我这就给你细细道来。
首先，咱们得准备一些基本的原料。
这农杆菌培养基，主要成分得有葡萄糖、酵母提取物、牛肉提取物、琼脂、还有各种矿物质和维生素。
这些东西，你在网上或者专业的生物试剂店都能买到。
咱们先从葡萄糖开始说。
葡萄糖是农杆菌的能量来源，就像我们人吃饭一样，农杆菌也得“吃饭”。
一般咱们用20克葡萄糖，溶解在1000毫升的水中，这比例得把握好，不然农杆菌“吃不饱”或者“吃撑了”都不行。
接下来是酵母提取物和牛肉提取物，这两个东西是农杆菌的“蛋白质大餐”。
酵母提取物咱们用5克，牛肉提取物用10克，这俩东西混合在葡萄糖溶液里，搅拌均匀。
然后是矿物质和维生素，这些是农杆菌的“微量元素”。
咱们得用一些特定的配方，比如MgSO4、KH2PO4、CaCl2等等，每种都得精确到毫克。
这些矿物质和维生素，你得按照比例加到培养基里，这可是个精细活儿。
最后，别忘了加琼脂。
琼脂是让培养基凝固的东西，就像咱们做果冻一样。
一般咱们用15克琼脂，加到培养基里，加热到沸腾，让琼脂完全溶解。
等这些都准备好了，咱们还得注意无菌操作。
你得在无菌室里，或者用酒精灯火焰消毒过的条件下，把培养基倒进培养皿里。
倒的时候得小心，别让培养基溅出来，也别让细菌进去。
倒好培养基后，等它冷却凝固，就可以放到恒温箱里培养农杆菌了。
记得，恒温箱的温度得控制在28度左右，这是农杆菌最喜欢的温度。
这就是农杆菌培养基的配方和制作过程。
虽然听起来挺复杂的，但只要你细心，一步步来，肯定能成功。
就像做菜一样，调料配比、火候掌握好了，做出来的菜自然就美味。
农杆菌培养基也是这样，配方和操作都到位了，农杆菌就能茁壮成长。
希望我的分享对你有所帮助，祝你实验顺利！。
农杆菌介导的水稻转化
农杆菌介导的水稻转化实验目的学习农杆菌介导的将目的基因导入水稻的方法。
实验原理随着分子生物学的发展，越来越多的参与植物抗病有关的基因被分离出来，如防卫反应有关的基因、参与抗病信号传导的基因，参与对病原物识别的基因等，要鉴定这些基因在植物抗病性中的作用和地位，就要构建转化植物的双元载体如超量表达、反义和RNA干涉的双元载体转化植物，来明确该基因在植物抗病中的作用。
水稻上常用的遗传转化方法分为DNA直接导入法和农杆菌介导的转化法。
DNA直接导入法主要包括PEG（polyethylene glycol）介导的转化法、电击转化法、基因枪转化法和花粉管通道转化法。
其中PEG法、电穿孔法以原生质体为受体，由于对原生质体再生的依赖而在应用上受到很大限制。
基因枪法优点是受体广泛，不受寄主范围的限制，转化率较高，但和其它DNA直接导入法一样存在共同的缺点：外源DNA的整合方式复杂，常常是多拷贝插入，较易出现转基因沉默现象，转化的外源基因片断不能太大（上限是16-20kb），转入基因的分离有时呈非孟德尔遗传等。
同DNA直接导入法相比，农杆菌介导的转化法不需要原生质体的培养，简便易行，能有效地转入较大的外源DNA片断；转化效率高，转化的外源基因整合位点比较稳定（一般在T-DNA 25bp处与植物基因组整合），整合的外源基因基本上保持其结构的完整性；整合的外源基因多为单拷贝或低拷贝；整合的外源基因在转基因植株中的显性表达率较高，共抑制现象相对较少；转入的外源基因通常以孟德尔遗传规律遗传。
所以已成为转化单子叶植物的首选方法。
一、目标基因对农杆菌的转化1.1农杆菌感受态细胞的制备1.取-70℃保存的农杆菌EHA105于含50μg/ml利福平YM平板划线，28℃黑暗培养。
2.挑取单菌落接种于5ml YM液体培养基中，220rpm 28℃振荡培养12-16小时。
3.取2ml菌液转接于100ml YM液体培养基中，28℃，220rpm振荡培养至OD600=0.5。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
农杆菌介导的转化所用基本培养基配方
一、NB培养基配方（基本培养基）
N6大量：（mg/l）母液：10X，1L（mg）
硝酸钾KNO3
硫酸氨（NH4）2SO4 磷酸二氢钾KH2PO4 硫酸镁MgSO4·7H2O 氯化钙CaCl2·2H2O 2830
463
400
185
166
28300
4630
4000
1850
1660
B5微量：（mg/l）母液：100X，1L（mg）
硼酸H3BO4
硫酸锰MnSO4·H2O
硫酸锌ZnSO4·7H2O 碘化钾KI
钼酸钠Na2MoO4·2H2O 硫酸铜CuSO4·5H2O 氯化钴CoCl2·6H2O 3
7.58
2
0.75
0.25
0.025
0.025
300
758
200
75
25
2.5
2.5
铁盐：（mg/l）母液：100X，1L（mg）
硫酸亚铁FeSO4·7H2O
乙二胺四乙酸二钠Na2EDTA 27.8
37.3
2780
3730
肌醇：（mg/l）母液：100X，1L（mg）肌醇Myo-inositol 100 10000
有机成分：（mg/l）母液：50X，1L（mg）
盐酸硫胺素ThiamineHCl
盐酸吡哆醇PyridoxineHCl 尼克酸Niacin
水解酪蛋白Casamino acids 谷氨酰胺Glutam
脯氨酸Proline ine
甘氨酸Glycine 10
1
1
300
250
500
2
500
50
50
15000
12500
25000
100
蔗糖Sucrose 30000mg/l
琼脂Phytagel 2400mg/l
pH 5.8-5.9
注意：有机成分不能高压灭菌，须用滤器抽滤，分装后-20℃保存
二、AAM培养基配方
大量：（mg/l）母液：10X，1L（mg）
磷酸二氢钾KH2PO4 硫酸镁MgSO4·7H2O 氯化钾KCl
氯化钙CaCl2·2H2O 170
370
2940
440
1700
3700
29400
4400
微量：（mg/l）母液：100X，100ml（mg）
硫酸锰MnSO4·H2O
钼酸钠Na2MoO4·2H2O 硼酸H3BO4
硫酸锌ZnSO4·7H2O 碘化钾KI
硫酸铜CuSO4·5H2O 氯化钴CoCl2·6H2O 7.58
0.25
3
2
0.75
0.0387
0.025
758
25
300
200
75
3.87
2.5
铁盐：（mg/l）母液：100X，1L（mg）
硫酸亚铁FeSO4·7H2O
乙二胺四乙酸二钠Na2EDTA 27.8
37.3
2780
3730
肌醇：（mg/l）母液：100X，1L（mg）肌醇Myo-inositol 100 10000
维生素：（mg/l）母液：100X，1L（mg）
盐酸硫胺素ThiamineHCl 盐酸吡哆醇PyridoxineHCl 尼克酸Niacin 0.5
0.5
0.5
50
50
50
氨基酸：（mg/l）
甘氨酸Glycine
精氨酸Arginine
谷氨酰胺Glutamine 7.5 174 876
水解酪蛋白Casamino acids 500mg/l
乙酰丁香酮Acetosgringone 100μΜ
葡萄糖Glucose 68500mg/l
蔗糖Sucrose 30000mg/l
pH 5.2
注意：AAM培养基不能高压灭菌，须用滤器抽滤，分装后-20℃保存
三、YEB固体培养基
(pH 7.0)
酵母提取物
蛋白胨
牛肉膏
蔗糖
硫酸镁
添加： Kan 50 mg/L Rif 50 mg/L 1.0g／Ｌ5.0g／Ｌ5.0g／Ｌ5.0g／Ｌ0.5g／Ｌ
四、LB固体培养基(pH 7.0-7.2)
酵母提取物
蛋白胨
NaCl
添加： Kan 50 mg/L Rif 50 mg/L 5g／Ｌ10g／Ｌ10g／Ｌ
五、MS培养基配方
大量：（mg/l）母液：20X，1L（mg）
硝酸铵NH4NO3
硝酸钾KNO3
磷酸二氢钾KH2PO4硫酸镁MgSO4·7H2O 氯化钙CaCl2·2H2O 1650
1900
170
370
440
33000
38000
3400
7400
8800
微量：（mg/l）母液：100X，1L（mg）
硫酸锰MnSO4·4H2O 硫酸锌ZnSO4·7H2O 硼酸H3BO4
碘化钾KI
钼酸钠Na2MoO4·2H2O 硫酸铜CuSO4·5H2O 氯化钴CoCl2·6H2O 22.3
8.6
6.2
0.83
0.25
0.025
0.025
2230
860
620
83
25
2.5
2.5
铁盐：（mg/l）母液：100X，1L（mg）
硫酸亚铁FeSO4·7H2O
乙二胺四乙酸二钠Na2EDTA 27.85
37.25
2785
3725
肌醇：（mg/l）母液：100X，1L（mg）肌醇Myo-inositol 100 10000
维生素：（mg/l）母液：100X，1L（mg）
盐酸硫胺素ThiamineHCl 盐酸吡哆醇PyridoxineHCl 尼克酸Niacin 0.4
0.5
0.5
40
50
50
甘氨酸Glycine 琼脂Phytagel 蔗糖Sucrose pH 5.8-5.9 2 mg/l 8000 mg/l 30000mg/l。