酵母感受态的制备(化学法)
毕赤酵母感受态制作及转化
毕赤酵母感受态细胞制作1、GS115活化：100ml三角瓶中装入20ml YPD培养基，接种100ul菌保，过夜活化。
2、转接：500ml三角瓶中装入100ml YPD培养基，取1ml活化菌液接种到100ml YPD培养基中，培养至OD约为1.3-1.5。
3、收菌：将菌放置冰上15min，或者放于4°冰箱冷却。
一般100ml菌液可以制备4份感受态细胞。
将无菌水和过滤除菌的山梨醇（1M）提前置于4°冰箱冷却。
4、用100ml离心管收集菌体，4000rpm/min离心5min去除YPD培养基。
5、用20ml预冷的无菌水洗菌体，4000rpm/min离心5min，重复一次。
6、用20ml预冷的山梨醇洗菌体，4000rpm/min离心5min。
7、每个离心管中加入3ml预冷的山梨醇，重悬菌体。
7、将菌体分装至1.5ml灭菌离心管中，分装4管，4000rpm/min离心5min，弃上清。
8、每管加入80ul预冷山梨醇，重悬菌体，置于冰上待用或加入10%DMSO保存于-80冰箱。
毕赤酵母电击法转化1、将感受态细胞在冰上融化，电转杯和山梨醇在冰上预冷。
2、将80ul感受态细胞与5-10ug线性化质粒混合，转移至0.2cm电转杯中，置于冰上5min。
3、根据电转仪选择合适的程序，进行电击。
4、电击后立即加入500ul预冷的山梨醇，将电击杯中液体全部转移至无菌的1.5ml离心管中，30℃水浴2h。
5、将菌体低转速离心5min，吸出多余上清，留100ul涂板即可。
6、将菌液均匀涂布于His缺陷型培养基，30℃培养1-2天。
要准备灭菌的有：水，1M山梨醇，滤器，大离心管，1.5ml离心管，大小枪头，所有的离心都是低温离心。
酵母感受态细胞的制备
酵母感受态细胞的制备以下是酵母感受态细胞的制备流程：一、基因突变1. 细胞外DNA转化：将基因要进行突变的DNA提取出来，放到细胞外，同时加入一定量的外源DNA去促进转基因的完成；2. 高效增幅：将一定的量外源DNA通过吞噬电穿孔的方法把外源DNA效率的转入细胞内，从而加快基因突变。
二、诱导表达和突变检测1. 选择表达载体：根据要转入突变要表达的基因，选择匹配的表达载体；2. 诱导表达：通过加入不同的诱导因子或者培养条件来促使载体的表达；3. 突变检测：通过筛选、测序和碱基错配检测等方法来检测是否发生了突变。
三、表达筛选1. 抗药基因筛选：对突变的酵母细胞，加入不同程度的抗药性因子，筛选出能够生存的突变细胞；2. 免疫细胞筛选：检验突变后的酵母细胞中能够产生免疫识别和反应细胞因子的存在，因为普遍认为有可能产生免疫细胞的能力。
四、选择迁移1. 抗药性筛选：对抗药性筛选出的突变酵母细胞进行对比，以确定是否能够开花；2. 免疫细胞筛选：通过检测免疫细胞因子的存在，筛选出产生免疫细胞的能力最强的突变细胞，并将其迁移至感受细胞中保存。
五、酵母感受态细胞的制备收尾1. 养殖酵母细胞：选择最佳突变细胞，把其分段离心至细胞密度稀释到一定水平；2. 生长管理：按照不同的培养环境加以调节，保证其正常的增殖和生长；3. 继代培养：当突变酵母细胞进行繁殖增殖后，可以进行继代繁殖，以不断增加细胞数量；4. 收尾清理：当满足实验要求时，对细胞进行收尾，进行清洗和分装，并保存细胞，以便后续使用。
总结：酵母感受态细胞的制备，主要分为基因突变、诱导表达和突变检测、表达筛选、选择迁移、酵母感受态细胞的制备收尾等步骤。
通过这些步骤，可以有效的制备可用于实验的突变的酵母感受态细胞，从而为对基因的研究和开发提供了非常有价值的材料。
酵母感受态制备流程
酵母感受态制备流程下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。
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酵母过程自己总结
一．准备过程(定容均用ddH2O)1，葡萄糖溶液用于给培养基提供碳源40%葡萄糖配100ml，即40g葡萄糖定容于100mlddH2O中。
1L培养基需要50ml葡萄糖溶液（葡萄糖溶液灭菌：115度，15分）2，10*LiAc溶液终浓度为1M用乙酸调PH7.5定容后高压灭菌3.10*TE溶液Tris 终浓度0.1M(Hcl调PH7.5)EDTA-Na 终浓度 0.01M二者混合定容后高压灭菌4.Trp—Leu终浓度8g/L（NaOH调PH6.0-6.5）加入Agar（20g/L）灭菌后倒板前加入灭好的55度预热的葡萄糖溶液5.Tre-Leu-His-Ura+3AT与4步骤相同，另3AT终浓度为25Mm6.x-gal solution溶液（注意现用现配）溶液包括 Z buffer 10ml10mg x-gal 溶于100ulDMF （避光）60ulẞ-巯基乙醇其中Z buffer(100ml装)包括Na2HPO4·12H2O 2.147g NaH2PO4·2H2O 0.591g MgSO4·7H2O 0.0246g Kcl 0.075g7.YPAD培养基1LYest extract 10gPeptone 20gDextrose 20gA 100mgAgar 20g(Hcl调PH6.0)二．酵母感受态的制备(MAV203)1.划板挑菌摇菌，30度，16-18小时后扩摇3-5小时，OD值=0.42.室温离心，5分钟，3000g，去上清3，加入一半量得灭菌水，重悬沉淀，再次离心，条件同上4.再用一半量的1*TE/LiAC,重悬沉淀，离心，条件同上5.后再用少量1*TE/LiAC,重悬沉淀，每管分装40-50ul后待转化另25ml1*TE/LiAC包括2.5ml10*TE2.5ml10*LiAC20mlddH2O（一般扩摇1L MAV203可以制备20管左右的酵母感受态）（注意即做即用）三．转化1.将ssDNA放于沸水中10分钟，后放于冰上5分钟，可重复一遍，使其彻底变性2.将感受态 40-50ulssDNA 5ulBD 1-2ulAD 1-2ul以上四种混合与离心管中，轻弹是其充分混合3．将10*TE 300ul10*LiAC 300ul50%PEG3350 2.4ml以上三种混合，取300ul，加入到2中离心管，震荡混匀10秒4.30度200rpm，摇陪30分钟5.42度水浴热激15分钟后放冰上数分钟6.6000-8000g，20-30秒离心后，去上清。
酵母感受态细胞的制备及酵母转化
小 1.5ml 0.1μg 0.1μg 0.1mg 0.1ml 0.6ml 70μl
大 50ml 20-100μg 10-50μg 2-0.5mg 20mg 8ml 60ml 7.0ml
5S(14krpm)
5min (1000×g) 1.0ml1 为自激活 对照； pGADT7- T+pGBKT7-53 阳性对照；pGADT7-T+pGBKT7- lam 阴性对照。 为了检测每一个质粒的转化效率， 100μl 水稀释 1μl 转化子， 用 铺于 SD-Leu 和 SD-Trp 平板上；为了检测共转化效率，按不同比例（1:1000，1:100，1:10）稀释转化子，取 100μl 涂于 SD-Leu-Trp 平板上； 酵母培养基： YPD medium (1L) Dific peptone（可用 OXOID 公司的胰化蛋白胨）20g/L Yeast extract Agar（for plates only） 加蒸馏水 调 pH 6.5 高压灭菌，待冷却到 55℃左右，加 40％的葡萄糖 50ml 至终浓度 2％。 40％葡萄糖：40g 葡萄糖加 60ml 左右的蒸馏水溶解，然后定容至 100ml，过滤灭菌，4℃ 存放。注意，一定不能高压灭菌，因长时间高温会使葡萄糖变黑。 YPDA medium (1L) 在上面的 YPD 培养基中每升加 0.2% 的腺嘌呤半硫酸盐（adenine hemisulfate）15ml 至 终浓度 0.003%，高压灭菌。 0.2% adenine he misulfate： 0.2g 加 100ml 蒸馏水溶解即可。 注 ： 如果需要在 YPD(YPDA) 中 加抗生素 如 kanamycin， 在上面准备 的培养基 中加 50mg/ml 的 Km0.2-0.3ml 至终浓度 10-15mg/L SD medium (1L) 无氨基酸酵母氮源（yeast nitrogen base without amino acids, YNB） Dific 琼脂 10×DO 蒸馏水 浓度为 2％。 注：如果使用固体 DO，1L 中加 0.64g。 下面氨基酸成分是无缺陷 DO 中所需的所有氨基酸：
感受态细胞制备步骤及准备细节
制备感受态1、配制液体培养基（1L体系）：Nacl 10g酵母提取物5gTry 10g加入氢氧化钠调节PH值至中性，放入大烧杯，搅拌混匀；2、100ml 容量瓶：CaCl2 2H2O 0.88gPIPES 0.34g甘油15ml（量筒量）去离子水冲洗量筒和玻璃棒转移至容量瓶中，定容至100ml, 上下颠倒混匀，转移至蓝帽玻璃瓶中。
3、灭菌（20min）：以上配好的两瓶溶液（灭菌时瓶盖不能太紧）；5个5ml的大离心管（黄帽）至于铝饭盒中；1.5ml EP管装满至于铝饭盒中；干净锥形瓶（大且洗净）铝箔封口；两瓶液体灭菌后取出放于4℃，其他放于烘箱烘干待用。
4、于-80℃冰箱上层取一管2ml 菌种，与超净平台上冰浴溶解；5、取8个灭过菌的EP管装满无氨苄的培养液作空白对照；6、剩余培养液倒入锥形瓶中，将融化的菌种倒入，盖上铝箔封口，稍微摇晃混匀，然后放入摇床中摇菌约2hour，菌液出现明显浑浊。
摇床参数设置（200或260r/min）。
（8管空白对照的菌液同样放入摇床摇菌）7、从摇床取出菌液，和空白对照，分别加入两只比色皿测OD值。
OD值在0.3-0.4之间表明摇菌完成。
以下冰上操作：8、将锥形瓶中200ml培养液分装到4个50ml离心管中，冰浴10min；9、4000r/min，8min，去上清，加10mlCaCl2(预冷)，用枪头轻轻吹打离心管壁上沉淀至完全；10、4000r/min，8min，4℃，去上清，加2ml CaCl2冰浴30min；11、4000r/min，8min, 去上清，加2mlCaCl2,120ul分装到1.5mlEP管（-20℃预冷），分装之后立刻-80℃保存。
酵母感受态的制备(化学法)
1、毕氏酵母氯化锂转化法（1）试剂1M LiCl（用去离子蒸馏水配制，滤膜过滤除菌；必要时用消毒去离子水稀释）50% PEG3350（Sigma P3640 用去离子蒸馏水配制，滤膜过滤除菌，用较紧的盖子的瓶子分装）2mg/ml salmon sperm DNA / TE（10mM Tris-Cl, pH8.0, 1.0mM EDTA）-20℃保存注：醋酸锂对毕氏酵母无效，仅氯化锂有效；PEG3350可屏蔽高浓度LiCl的毒害作用；（2）感受态毕氏酵母的制备接种Pachia pastoris到50ml YPD培养基中，30℃摇菌过夜（约24～28h）培养到OD值为0.8～1.0（约108 Cells/ml）；收获细胞，用25ml无菌水洗涤一次，室温下1500g离心10min；重悬细胞于1ml 100mM LiCl溶液中，将悬液转入1.5ml离心管；离心机最大速度离心15秒沉淀菌体，重悬菌体于400ul 100mM LiCl溶液中；按50ul/管分装，立即进行转化；注：不要将感受态酵母菌冰浴；（3）毕氏酵母的转化煮沸1ml鲑鱼精DNA 5min，迅速冰浴以制备单链担体DNA；将感受态酵母菌离心，以Tips去除残余的LiCl溶液；对于每一个转化，按以下顺序加入：50% PEG3350 240ul1M LiCl 36ul2mg/ml 单链Salmon sperm DNA 25ul5～10ug/50ul H2O 质粒DNA 50ul剧烈旋涡混匀直至沉淀菌体完全分布均匀（约1min）；30℃水浴孵育30min；42℃水浴热休克20～25min;6000～8000rpm离心收集酵母菌体；重悬酵母于1ml YPD培养基，30℃摇床孵育；1～4h后，取25～100ul菌液铺选择性培养基平板，于30℃培养2～3天鉴定；2、毕氏酵母PEG1000转化法（1）试剂缓冲液A：1.0M Sorbitol，10mM Bicine，pH8.35（sigma）,3%（v/v）ethylene gl ycol缓冲液B：40%（w/v）PEG1000（sigma），0.2M Bicine，pH8.35缓冲液C：0.15M NaCl，10mM Bicine，pH8.35未污染的新鲜、试剂级DMSO，-70℃保存注：缓冲液A、B、C均用滤膜过滤，-20℃保存;将DNA直接加在冻结的酵母细胞上是本实验的关键之处（即使在冰上解冻的待转化细胞，其摄取外源DNA的能力也在解冻过程中迅速下降；如进行多样品的转化，建议按6样品/组进行）;（2）待转化毕氏酵母的制备接种环接种Pachia pastoris于YPD平板，30℃培养2d;挑取单克隆酵母菌株于10mlYPD培养基中，30℃振荡培养过夜；取步骤2中小量菌液接种到100mlYPD培养基中振荡培养，待其OD值从0.1升到0. 5～0.8；室温下3000g离心收集酵母菌体，50ml缓冲液A洗涤一次；重悬菌体于4ml缓冲液A中，按0.2ml/管分装于1.5ml的离心管中，每管加入11ulD MSO，混合后迅速于液氮中冷冻，-70℃保存（3）毕氏酵母的转化将约50ug线性化质粒DNA溶于20ul TE或水中，直接加于冻结的酵母细胞中；加入担体DNA（40ug变性超声线性化鲑鱼精DNA）以获得最大转化率；37℃水浴孵育5min，中间混合样品1～2次；取出离心管，加入1.5ml缓冲液B，彻底混匀；30℃水浴孵育1h；室温下2000g离心10min，去除上清液，菌体沉淀重悬于1.5ml缓冲液C中；离心样品，去除上清液，轻微操作将样品重悬于0.2ml缓冲液C中；将所有转化液铺于选择性平板，于30℃孵育3～4天后，鉴定；3、毕氏酵母电转化法（1）E.coli TOP10F’感受态细胞的制备取10ul TOP10F’菌液，接种于200ml LB液体培养基中活化培养，37℃，200 rpm，16～18小时。
质粒载体转化酵母感受态方法
30℃200rpm温育30min 每10min轻拍混匀一次高速离心15s
3.弃上清用1ml 0.9%生理盐水重悬涂于DDO平板上，倒置培养3-5天待长出克隆计算转化率。
4.PEG/LiAc现用现配：
PEG 3350 8ml
10×TE buffer 1ml
10×LiAc 1ml
2.
小规模1.5ml 注意事项
yeastmaker Carrier DNA 5μl
PEG/LiAc500μl 轻轻混匀
质粒DNA 100ng 轻轻混匀
酵母感受态50μl
30℃200rpm温育30min 每10min轻拍混匀一次DMSO 20μl 轻轻混匀
42℃热激15min 每5min轻拍混匀一次高速离心15s
弃上清用1ml09生理盐水重悬涂于ddo平板上倒置培养35天待长出克隆计算转化率
质粒载体转化酵母感受态方法
质粒载体转化酵母感受态方法:
一、材料
1.酵母感受态细胞
2.PEG/LiAc
3.0.9%生理盐水
4.DMSO5.YPDBiblioteka 养基6.Carrier DNA
二、方法
1.变性Carrier DNA：沸水浴5min后马上冰浴10min，使用前重复一次。
毕赤酵母感受态细胞制备
毕赤酵母感受态细胞制备
1.毕赤氏酵母GS115感受态细胞制备
(1)从YPD平板上挑取单菌落2~3个于含25mL YPD的250mL 三角瓶中，220r/min，30o C过夜（下午5点接，到第二天9点转接）;
(2)取1mL 过夜培养物，接种含50mL 新鲜培养基（YPD）的250mL 摇瓶（接种两瓶，共100mL培养液），生长至OD600~1.3-1.5(4h左右）；
(3)将100mL培养液分装于3个50mL离心管中，4o C，5000g 离心5min，用少许预冷的灭菌水悬浮细胞后并于1管中，加预冷的灭菌水至20mL；
(4)如上离心，用10mL 预冷的灭菌水悬浮细胞；
(5)如上离心，用10mL 预冷的1 mol/L山梨醇溶液悬浮细胞；
(6)如上离心，用0.5mL 预冷的1 mol/L山梨醇溶液悬浮细胞。
2.转化（电击转化）
(1)取80μL上述细胞与10μL 线性化DNA混合，转入预冷的0.2cm电转杯中；
(2)在冰上放置5min；
(3)根据所使用电转仪制造商推荐的酿酒酵母参数进行电击细胞（1.5KV，6ms）；
(4)立即加入0.9 mL 预冷的1 mol/L山梨醇溶液至杯中，将内容物转移至灭菌离心管中；
(5) 5000g离心5min，剩余200μL菌液吹吸重悬细胞，涂布1块MD平板；
(6)在30o C孵育平板至菌落明显形成（大约3~4天）。
酵母感受态yih制备
酵母感受态YIp的制备是一个复杂的过程，涉及到细胞培养、细胞分离、基因转化等多个步骤。
下面将详细介绍酵母感受态YIp的制备过程、注意事项以及可能遇到的问题及其解决方法。
一、准备工作1. 器材和试剂：培养箱、离心机、灭菌锅、移液器、细菌培养皿、显微镜、PCR仪、氯化钙溶液、甘油、感受态细胞质提取液、酵母基因组DNA提取液等。
二、制备步骤1. 酵母细胞培养：选择酵母菌株，将菌株接种到适宜的培养基中，培养酵母细胞。
当酵母细胞生长到适当的密度时，停止培养，用移液器将酵母细胞收集到离心管中，进行离心操作。
2. 细胞分离：将离心后的酵母细胞用氯化钙溶液悬浮，并通过梯度离心法或其他分离方法，将细胞分离得到感受态细胞。
3. 基因转化：将目的基因或质粒DNA与酵母感受态细胞混合，在一定的温度下进行转化。
转化过程中，DNA分子进入酵母细胞并被复制，最终形成基因组整合。
4. 筛选鉴定：通过PCR或酶切等方法对转化细胞进行筛选鉴定，确定是否成功转化。
三、注意事项1. 培养基和环境的控制：要保证培养基的质量和适宜的温度、pH值等环境条件，以保证酵母细胞的正常生长和增殖。
2. 细胞的收集和离心：要确保收集到的酵母细胞数量和质量，以保证感受态细胞的制备效果。
3. 感受态细胞的制备：要保证细胞的活性，避免长时间离心或暴露在空气中，以保持细胞的感受态状态。
4. 转化过程的控制：要确保DNA进入酵母细胞并成功整合，需要控制转化过程中的温度、时间等因素。
5. 筛选鉴定的准确性：要确保筛选鉴定的准确性，需要建立有效的筛选方法和标准，并对筛选结果进行反复验证。
四、可能遇到的问题及其解决方法1. 酵母细胞生长不良：检查培养基的质量和配方，调整培养条件，如温度、pH值、渗透压等。
2. 感受态细胞活性不足：制备过程中要保证细胞的活性，可以尝试增加细胞的离心时间和温度等。
3. 转化效率低：可以尝试增加DNA的浓度、延长转化时间、优化转化条件等方法来提高转化效率。
感受态的制备方法
感受态制备方法二、实验过程：1.感受态溶液的制备（过滤除菌）（500ml体积）Tfb1：KAC 30mol/l 98.14 1.4721g Kcl 100mol/l 74.55 3.7275gCaCl2 10mol/l 110.99 0.55495gMncl2 50mol/l 197.91 4.94775g甘油15% 75mlPH：5.8Tfb2：Tris-cl（Base）10mol/l 121.14 0.6057g CaCl2 10mol/l 110.99 0.55495gKcl 10mol/l 74.55 0.37275g甘油15% 75mlPH：6.52.培养基的制备（高压灭菌）SOB培养基（1L）蛋白胨20g酵母提取物5gNacl 1mol/l 0.5gKcl 1mol/l 2.5ml需单独配置成溶液在加入培养集中高压灭菌后，每100ml中加入1ml灭过菌的1mol/l的Mgcl2（203.3）溶液三、制备感受态的操作步骤1. 实验前准备：冰水，冰盒，10ml移液管，1.5ml灭菌的EP管，100ml量程的移液器，50ml无菌离心管，将所有要用的东西放入-20℃内遇冷。
2. 实验步骤：1.将甘油保存的菌种（E,coli DH5α）用接种环在无抗性LB平皿上划线，37℃培养过夜2.挑取单菌落接至5mlLB无抗性培养基内，37℃培养过夜3.以1:20的比例转接菌液至37℃以预热的SOB培养基内，至OD=1（OD值根据不同的感受态情况而定）左右结束培养4.将培养后的菌液置于冰水中遇冷5min，分装配平于50ml离心管中，4000g4℃10min5.弃上清，用40ml的以遇冷的Tfb1溶液重新悬浮细胞，并置于冰水中5min4000g 4℃10min6.弃上清，用4ml 以遇冷的Tfb2溶液重选细胞，并置于冰水中5min：以每管100ml的量分装于1.5ml灭过菌的EP管中，于-80℃内保存7.取制备好的感受态2支，一支为空白对照检测是否有污染，另一只转化质粒检测感受态效率。
酵母菌感受态细胞的制备
1．接种5ml液体YPAD或10ml SC，30℃下振荡培养过夜。
2．计数过夜培养物细胞密度，以最终5×106个/ml的细胞密度接种50ml YPAD培养液。
3．置30℃，200r/min振荡培养至2×107个细胞/ml，通常需要3～5小时，该培养物的细胞足够供十次转化用。
4．用50ml无菌离心管以3000g（2500r/min）离心5分钟，收获细胞。
5．弃培养液，把细胞悬浮在25ml无菌水中，再同上离心。
6．弃水，把细胞悬浮在1ml的100mmol/L醋酸锂中，转悬浮物到一个无菌1.5ml离心管。
7．高速离心5秒钟沉淀细胞，用微量移液器吸出醋酸锂。
8．悬浮细胞到最终500μl体积其中大约含400μl的100mmol/L醋酸锂。
9．将1ml单链载体DNA样品煮沸5分钟，快速在冰水中冷却。
10．振荡细胞悬浮液，取50μl样品加到标记的离心管中，离心沉淀细胞，用微量取样器除去醋酸锂。
11．基本“转化混合液”由下列成分组成，小心按下列顺序如下：240μl PEG（50% w/v）36μl 1.0mol/L 醋酸锂25μl 单链载体DNA（2.0mg/ml）50μl 水和质粒DNA（0.1～10μg）12．剧烈振荡每个反应管每个反应管直到细胞完全混匀，通常需要1分钟左右。
13．置30℃保温30分钟。
14．置42℃水浴中热激20～25分钟。
15．以6000～8000r/min离心15秒，用微量移液器除去转化混合液。
16．吸0.2～1.0ml无菌水加到每个反应管中，用移液器上下轻轻抽提以悬浮沉淀。
17．用等份的200μl转化混合液涂选择平板。
酵母菌感受态制作及转化
Y187 酵母感受态制作及转化1）挑新鲜单菌落Y187 于 8 ml YPDA 培养液， 30℃，250 rpm 培养 16-18h；2）至 OD600＞ 1.5， 1： 10 转接，此时OD600≈ 0.3；3）30℃， 250 rpm，4-7 h，每 2 h 检测一次，直到OD600=0.4-0.6；4）转入 2 个 50 ml 离心管， 5100 rpm,5 min,弃上清；5）加入 1/2 V ddH2O, 洗涤细胞， 5100 rpm,5min,弃上清；6）每管中分别加 1 ml 1 ×TE/LiAc ，冰上混匀， 10000 rpm，15 s，去上清；7）每管中分别加 0.5 ml 1 TE/LiAc×，冰上混匀， 10000 rpm，15 s，去上清；8）每管中分别加0.5 ml 1 TE/LiAc×，冰上混匀， 10000 rpm，15 s，去上清；9）每管中分别加0.4 ml 1 TE/LiAc×，每管 100 ul 分装；10）分别加入 100 ng 左右 DNA（ plasmid）和 0.1 mg 鲑鱼 DNA（10 mg/ml,10 ul） ,移液器抽吸混匀溶液；11）分别加入600 ul LiAc/PEG ，高速混匀（ 10 s-1 min 内）；12）30℃摇床恢复30 min；13）超净台（无菌条件下）加入70 ul DMSO, 轻轻颠倒混匀；14）42℃热激 15 min；15）冰上放置1-2 min；16）14 000 rpm,15 s,去上清；17）300 ul TE 重悬细胞；18）100 ul/1 ul 分别涂布于YPDA 平板；100 ul/1 ul 分别涂布于SD/-Trp 单缺陷平板；100 ul/1 ul 分别涂布于SD/ -Trp/ -His 双缺陷平板上， 30℃倒置培养48-72 h可见转化菌落。
毕氏酵母(Pichia_pastoris)感受态细胞制备及转化 (1)
毕氏酵母（Pichia pastoris）感受态细胞制备及转化1、毕氏酵母氯化锂转化法（1）试剂1M LiCl（用去离子蒸馏水配制，滤膜过滤除菌；必要时用消毒去离子水稀释）50% PEG3350（Sigma P3640 用去离子蒸馏水配制，滤膜过滤除菌，用较紧的盖子的瓶子分装）2mg/ml salmon sperm DNA / TE（10mM Tris-Cl, pH8.0, 1.0mM EDTA）-20℃保存注：醋酸锂对毕氏酵母无效，仅氯化锂有效；PEG3350可屏蔽高浓度LiCl的毒害作用；（2）感受态毕氏酵母的制备接种Pachia pastoris到50ml YPD培养基中，30℃摇菌过夜（约24～28h）培养到OD 值为0.8～1.0（约108 Cells/ml）；收获细胞，用25ml无菌水洗涤一次，室温下1500g离心10min；重悬细胞于1ml 100mM LiCl溶液中，将悬液转入1.5ml离心管；离心机最大速度离心15秒沉淀菌体，重悬菌体于400ul 100mM LiCl溶液中；按50ul/管分装，立即进行转化；注：不要将感受态酵母菌冰浴；（3）毕氏酵母的转化煮沸1ml鲑鱼精DNA 5min，迅速冰浴以制备单链担体DNA；将感受态酵母菌离心，以Tips去除残余的LiCl溶液；对于每一个转化，按以下顺序加入：50% PEG3350 240ul1M LiCl 36ul2mg/ml 单链Salmon sperm DNA 25ul5～10ug/50ul H2O 质粒DNA 50ul剧烈旋涡混匀直至沉淀菌体完全分布均匀（约1min）；30℃水浴孵育30min；42℃水浴热休克20～25min;6000～8000rpm离心收集酵母菌体；重悬酵母于1ml YPD培养基，30℃摇床孵育；1～4h后，取25～100ul菌液铺选择性培养基平板，于30℃培养2～3天鉴定；2、毕氏酵母PEG1000转化法（1）试剂缓冲液A：1.0M Sorbitol，10mM Bicine，pH8.35（sigma）,3%（v/v）ethylene glycol 缓冲液B：40%（w/v）PEG1000（sigma），0.2M Bicine，pH8.35缓冲液C：0.15M NaCl，10mM Bicine，pH8.35未污染的新鲜、试剂级DMSO，-70℃保存注：缓冲液A、B、C均用滤膜过滤，-20℃保存;将DNA直接加在冻结的酵母细胞上是本实验的关键之处（即使在冰上解冻的待转化细胞，其摄取外源DNA的能力也在解冻过程中迅速下降；如进行多样品的转化，建议按6样品/组进行）;（2）待转化毕氏酵母的制备接种环接种Pachia pastoris于YPD平板，30℃培养2d;挑取单克隆酵母菌株于10mlYPD培养基中，30℃振荡培养过夜；取步骤2中小量菌液接种到100mlYPD培养基中振荡培养，待其OD值从0.1升到0.5～0.8；室温下3000g离心收集酵母菌体，50ml缓冲液A洗涤一次；重悬菌体于4ml缓冲液A中，按0.2ml/管分装于1.5ml的离心管中，每管加入11ulDMSO，混合后迅速于液氮中冷冻，-70℃保存（3）毕氏酵母的转化将约50ug线性化质粒DNA溶于20ul TE或水中，直接加于冻结的酵母细胞中；加入担体DNA（40ug变性超声线性化鲑鱼精DNA）以获得最大转化率；37℃水浴孵育5min，中间混合样品1～2次；取出离心管，加入1.5ml缓冲液B，彻底混匀；30℃水浴孵育1h；室温下2000g离心10min，去除上清液，菌体沉淀重悬于1.5ml缓冲液C中；离心样品，去除上清液，轻微操作将样品重悬于0.2ml缓冲液C中；将所有转化液铺于选择性平板，于30℃孵育3～4天后，鉴定；3、毕氏酵母电转化法（1）E.coli TOP10F’感受态细胞的制备取10ul TOP10F’菌液，接种于200ml LB液体培养基中活化培养，37℃，200 rpm，16～18小时。
酵母感受态制备
酵母感受态制备是一种通过培养酵母菌并在特定条件下进行处理，以获得酵母菌感受态的方法。
感受态酵母菌具有更高的DNA吸收能力，可以用于遗传转化或基因编辑等实验操作。
以下是一种常见的酵母感受态制备方法：
准备培养基：制备合适的培养基，例如YPDA培养基（酵母蛋白胨培养基加入葡萄糖和酵母提取物）。
培养酵母：在含有培养基的培养皿中培养酵母菌，通常在30°C温度下培养过夜，直到达到合适的生长阶段（一般为对数生长期）。
洗涤酵母：用无菌蒸馏水或缓冲液洗涤培养皿中的酵母菌，以去除培养基中的营养物质和代谢产物。
悬浮酵母：将洗涤后的酵母用合适的缓冲液悬浮均匀。
处理酵母：向悬浮酵母中加入聚乙二醇和DNA（转化质粒或目的基因），并进行短暂的热冲击（热激）。
恢复酵母：将处理后的酵母菌悬液进行恢复培养，可以在含有完整营养物质的培养基上进行培养，以让酵母菌恢复生长。
通过上述步骤，酵母菌就可以在感受态下吸收外源DNA，并进行转化。
这种方法常用于酵母菌基因组编辑、基因敲除、基因表达和功能研究等实验中。
不同实验目的和酵母菌菌株可能需要略微调整上述步骤中的条件和参数。
酵母感受态制备
1，(1)从YPD阴性培养板上挑取单个菌落ppastorisGslls，接种于YPD 2mL培养基中，30℃振荡培养过夜(225r/mln)。
(2)取过夜活化的GS115菌液100微升接种于培养基YPD10mL中，30℃下摇床过夜。
(3)当菌液的OD600为0.8一1.2时，取出，用预冷的无菌水多次洗涤，4℃离心(3000r/mln)5min，最后沉淀以冰冷的lM的D一山梨醇重悬细胞沉淀，4℃离心(3000r/mln)5min(4)该沉淀溶于冰冷的1M的山梨醇200微升，以备转化。
醋酸钠溶液20林L、冰冷的无水乙醇40林L，于一20，r/min)20而n，弃上清，待乙醇挥干后，以nDw(2)将新鲜制备的GS115感受态细胞80微升与质粒10微升充分混匀，转入电转杯，冰浴5Min，1500v，25uf, 250电击。
(3)立即加入冰冷的1mo比山梨醇1ml,，转移入一无菌EB管中，30℃下静置2h,然后从中分别取出20微升，50，100，200微升涂板于含有抗生素的YPDS板上。
(4)30℃避光保存3天后，挑取单克隆至YPD2 ml中，30℃摇床震荡避光培养至对数生长期，冻存。
(4)与此同时，以不含目的基因Tal一TPS的空质粒电转化感受态GS115，操作方法同上。
电转化的单克隆冻存菌10微升经过夜活化后，接种于含有抗生素的YPD培养液2ml中，，30℃振荡避光培养过夜，次日分别于含zcocin高浓(1000ug/mL)的YPDs平板上进行培养，挑取20个单克隆菌落，YPD扩增培养4d。
(3)收集上清500ul，8000r/min离心5min后除去菌体，获得的上清加2倍体积冰冷的无水乙醇，-20℃放置30min，12000r/mln离心5min，弃去上清，获得的沉淀即为浓缩的蛋白。
(4)获得的浓缩蛋白溶于样品缓冲液20ul中，100℃变性3min，并按表2-6进行电泳。
(5)电泳分2个阶段进行，浓缩胶中:电压60V，电流13mA，lh;分离:电压150V，电流20mA，l.5h。
感受态的制备
实验准备及操作流程图胡建和19-7-16感受态细菌的制备试剂准备：(1)JM109 or DH5α：-70℃保存；(2)LB培养基：(LB平板及LB培养基500ml)胰蛋白胨(Tryptone,5g)，酵母提取物(Yeast Extract,2.5g)，NaCl(5g)，1mol/L NaOH 0.5ml，加蒸馏水至500ml，调pH至7.0，(若制备平板时，加7.5g琼脂或琼脂糖后再调整pH至7.0，在倒板之前加入氨苄，氨苄加至终浓度为1µg/µl)，最后151bf/in2(1.034×105pa)高压灭菌20min。
(3)0.1M CaCl2：用量约30ml，取5M CaCl2(-20℃保存)母液0.6ml，加无菌水稀释至30ml；(4)50ml离心管：一支，高压灭菌；(5)50ml量筒：高压灭菌。
(6)100ml 灭菌蒸馏水。
（7）三角瓶：高压灭菌。
(8)5ml枪头：高压灭菌。
实验操作流程图：注意：实验操作过程中，应于无菌操作台内，严格无菌操作，实验过程中的灭菌链瓶、离心管、细菌均需在冰浴内，且冰浴界面须没过菌液面。
取一支-70℃贮存的DH5α或JM109，于室温融化（如用保存菌种挑斑，需于4ml LB，220转/分，振培过夜）↓吸取500µl菌液＋4ml LB，220转/分，振培3-4小时，4℃保存(复苏细菌)↓取上述LB菌液1ml＋50ml LB(pH7.0)，37℃，220rpm，振培3小时(存菌种时，与50%甘油LB等体积混合，于-70℃冻存)↓将培养瓶置冰浴中10分钟（或4℃1小时）↓于超净台内，倒入50ml体积的离心管中(注意无菌操作)↓4℃，4000-5000rpm，7min↓于超净台内，弃上清，在吸水纸上控干细菌沉淀呈团块状沉淀(中间配0.1M CaCl2冰浴)↓空干后，先加少量0.1M 预冷的CaCl2,吹打混匀后，加至25ml，轻轻吹打混匀↓冰浴45分钟(50-60分钟)↓4℃,5000rpm，8min↓弃上清(此时细菌沉淀呈空心，半圆状)↓加入0.1M CaCl2 2ml(或2-3ml)，(温和)吹打混匀↓按200µl体积分装于无菌的1.5ml eppenforf管中，4℃过夜(此步必需，以充分打开细胞膜通道)↓不用时，次日加等体积的30%甘油LB，-70℃保存。
感受态的制备 revised
感受态的制备所有的操作必须在严格的无菌条件下操作一．实验前的准备：1.配置培养基及试剂：（1）LB液体培养基（100ml）胰蛋白胨 1g酵母提取物 0.5gNaCl 1g摇动容器直至溶剂溶解，用5mol/LNaOH调pH7.0，用去离子水定容至100ml，灭菌。
（2）LB固体培养基（50ml不加抗生素）胰蛋白胨 0.5g酵母提取物 0.25gNaCl 0.5g琼脂糖（15g/L） 0.75g灭菌（3）0.1M CaCl2无水氯化钙（111）0.555g溶于50ml水中灭菌（4）0.1M CaCl2+15% 甘油灭菌2．将（1）（2）（3）（4）（5）溶液灭菌，溶液#3，#4，#5均保存于4C冰箱3.在-20C冰箱预冷几个15/50 ml及30个1.5 ml灭菌的离心管，1ml/200ul枪头各一盒3．倒平板4．接种待平板冷却后，用接种环蘸取少许感受态细胞之子划线，37℃过夜培养（16-20h）二．感受态的制备1．从 37℃培养 16～20h 的新鲜平板中挑取一个单菌落到1ml LB液体培养基中过夜摇菌。
2．将此1ml菌转到一个含有 100mlLB 培养基的500ml烧瓶中。
于 37℃剧烈振摇培养约 2～3h，每隔20～30min测量OD600值≈0.4。
3．在无菌条件下将细菌转移到于-20C冰箱预冷的50ml？聚丙烯离心管中4． 4℃，以4000r/min离心7min，以回收细胞。
5．在超净工作台中倒出培养物，将管倒置15秒以使最后残留的痕量培养液流尽。
6．每50ml初始培养液用20ml预冷的0.1mol/L CaCl2溶液重悬每份细胞沉淀。
先加少量CaCl2溶液将沉淀吸打均匀，再加入剩下的溶液。
充分混匀7． 4℃以3000r/min离心5min，以回收细胞。
8．倒出培养液，将管倒置5秒以使最后残留的痕量培养液流尽。
9．每50ml初始培养物用20ml冰预冷的0.1M CaCl2重悬每份沉淀，冰上静置30分钟10. 4℃以3000r/min离心5min，以回收细胞，倒出培养液，使最后残留的痕量培养液流尽。
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1、毕氏酵母氯化锂转化法
（1）试剂
1M LiCl（用去离子蒸馏水配制，滤膜过滤除菌；必要时用消毒去离子水稀释）
50% PEG3350（Sigma P3640 用去离子蒸馏水配制，滤膜过滤除菌，用较紧的盖子的瓶子分装）
2mg/ml salmon sperm DNA / TE（10mM Tris-Cl, pH8.0, 1.0mM EDTA）-20℃保存
注：醋酸锂对毕氏酵母无效，仅氯化锂有效；PEG3350可屏蔽高浓度LiCl的毒害作用；
（2）感受态毕氏酵母的制备
接种Pachia pastoris到50ml YPD培养基中，30℃摇菌过夜（约24～28h）培养到OD值为0.8～1.0（约108 Cells/ml）；
收获细胞，用25ml无菌水洗涤一次，室温下1500g离心10min；
重悬细胞于1ml 100mM LiCl溶液中，将悬液转入1.5ml离心管；
离心机最大速度离心15秒沉淀菌体，重悬菌体于400ul 100mM LiCl溶液中；
按50ul/管分装，立即进行转化；
注：不要将感受态酵母菌冰浴；
（3）毕氏酵母的转化
煮沸1ml鲑鱼精DNA 5min，迅速冰浴以制备单链担体DNA；
将感受态酵母菌离心，以Tips去除残余的LiCl溶液；
对于每一个转化，按以下顺序加入：
50% PEG3350 240ul
1M LiCl 36ul
2mg/ml 单链Salmon sperm DNA 25ul
5～10ug/50ul H2O 质粒DNA 50ul
剧烈旋涡混匀直至沉淀菌体完全分布均匀（约1min）；
30℃水浴孵育30min；
42℃水浴热休克20～25min;
6000～8000rpm离心收集酵母菌体；
重悬酵母于1ml YPD培养基，30℃摇床孵育；
1～4h后，取25～100ul菌液铺选择性培养基平板，于30℃培养2～3天鉴定；
2、毕氏酵母PEG1000转化法
（1）试剂
缓冲液A：1.0M Sorbitol，10mM Bicine，pH8.35（sigma）,3%（v/v）ethylene gl ycol
缓冲液B：40%（w/v）PEG1000（sigma），0.2M Bicine，pH8.35
缓冲液C：0.15M NaCl，10mM Bicine，pH8.35
未污染的新鲜、试剂级DMSO，-70℃保存
注：
缓冲液A、B、C均用滤膜过滤，-20℃保存;
将DNA直接加在冻结的酵母细胞上是本实验的关键之处（即使在冰上解冻的待转化细胞，其摄取外源DNA的能力也在解冻过程中迅速下降；如进行多样品的转化，建议按6样品/组进行）;
（2）待转化毕氏酵母的制备
接种环接种Pachia pastoris于YPD平板，30℃培养2d;
挑取单克隆酵母菌株于10mlYPD培养基中，30℃振荡培养过夜；
取步骤2中小量菌液接种到100mlYPD培养基中振荡培养，待其OD值从0.1升到0. 5～0.8；
室温下3000g离心收集酵母菌体，50ml缓冲液A洗涤一次；
重悬菌体于4ml缓冲液A中，按0.2ml/管分装于1.5ml的离心管中，每管加入11ulD MSO，混合后迅速于液氮中冷冻，
-70℃保存
（3）毕氏酵母的转化
将约50ug线性化质粒DNA溶于20ul TE或水中，直接加于冻结的酵母细胞中；加入担体DNA（40ug变性超声线性化鲑鱼精DNA）以获得最大转化率；
37℃水浴孵育5min，中间混合样品1～2次；
取出离心管，加入1.5ml缓冲液B，彻底混匀；
30℃水浴孵育1h；
室温下2000g离心10min，去除上清液，菌体沉淀重悬于1.5ml缓冲液C中；
离心样品，去除上清液，轻微操作将样品重悬于0.2ml缓冲液C中；
将所有转化液铺于选择性平板，于30℃孵育3～4天后，鉴定；
3、毕氏酵母电转化法
（1）E.coli TOP10F’感受态细胞的制备
取10ul TOP10F’菌液，接种于200ml LB液体培养基中活化培养，37℃，200 rpm，16～18小时。
取100ul菌液接种于200ml液体LB培养基中。
37℃，200 rpm，培养16～18小时。
灭菌500 ml离心管，4℃，4000 rpm，20 min。
得菌体沉淀。
弃上清，菌体用10％甘油重悬并洗涤。
重复洗涤3次。
第三次离心后，弃绝大部分上清，留下约1ml 液体用于重悬菌体。
从制得得感受态细胞中，取200ul于灭菌EP管中，加入连接反应产物5ul，混匀，不要产生气泡，在冰上放置5min。
将混匀后得200ul菌液移入电击杯中。
使用电击穿孔仪进行转化，设置为电压2500 V，时间 5 ms。
电击后，往电击杯中加入800ul SOC培养基，冲洗出菌体，转移至灭菌1.5 ml EP 管中。
37℃，150 rpm ，轻摇45～60 min。
取全部均匀涂布于含Zeocin 25 ug/ml 的LLB－Zeocin平板上，正放，待涂布液不在流动，37℃培养12～16小时。
（2）线性化质粒DNA对Pichia pastorisGS115的转化
取新鲜制备的（或－70℃冻存的）感受态细胞置于冰浴中，使其完全解冻；
1）将100μl菌体移出至一新的无菌Eppendorf管中，加入5－20μg线性化质粒（5～10μl），轻弹混匀，尽数吸出转移到0.2cm型的电穿孔转化杯中；
2) 转化杯置于冰浴中5～10分钟，保持低温。
3) 电穿孔转化电击条件：电压：1500V；电阻：400Ω；电容：25μF；脉冲时间：10 mS；一次电击。
4) 电击后，马上在电击转化杯中加入1ml 4℃预冷的1M的山梨醇溶液，用微量移液枪吹打均匀，置于冰浴中；
5) 取30℃烘至表面半干的MD培养基平板，在超净工作台上无菌操作涂布平板，400μl/板。