氨基酸分析--应用与实践

氨基酸分析技术的应用与实践

中国农科院饲料研究所

刘庆生

2005年6月28日

氨基酸测定方法的基本框架

¬氨基酸总量的测定(十八种氨基酸)常规酸水解氨基酸

氧化酸水解测含硫氨基酸

碱解测色氨酸

¬游离氨基酸的测定

添加氨基酸测定

生物材料中的游离氨基酸测定

蛋白水解氨基酸总量的测定

¬常规酸水解—测定除色氨酸、含硫氨基酸以外的蛋白水解氨基酸（15种）

¬氧化酸解

用HBr做终止剂—可测定除色氨酸、酪氨酸、组氨酸、苯丙氨酸以外的蛋白水解氨基酸（14种）

用偏重亚硫酸钠做终止剂—可测定除色氨酸、酪氨酸以外的蛋白水解氨基酸（16种）¬碱解

测定色氨酸

常规酸水解

¬原理: 蛋白质是氨基酸以α-氨基和α-羧基形成酰胺键，共价地结合形成的多聚物。因此测定氨基酸必须先水解，将氨基酸间的肽键打开，然后才能分离、测定。该法可测定15种氨基酸，但含硫氨基酸（主要是胱、半胱和蛋氨酸）水解中会被氧化，生成多级氧化

产物，难以测准，色氨酸则全部分解为NH

3和

CO2，而无法测定。¬基本程序

¬过程控制

基本程序

混匀,离心或过滤

取上清液, 测定

过程控制（1）

¬酸解法（常规酸解与氧化酸解-酸解）

¬样品粒度与称样量

样品均一性

谷物氨基酸测定标准：60目筛，30mg

饲料氨基酸测定标准：40目筛，100mg ¬氨基酸标准的0.3-2倍（预先测定粗蛋白含

量）。

¬对于粗脂肪含量≥5%的样品需先脱脂。

过程控制（2）

酸解剂(浓度，添加苯酚）

酸样比（可在40倍范围内变化）

欧洲：10mgN：20/500ml

北美：10mg蛋白：2/40ml 水解方式：真空（充N）封管/回流水解

水解温度与时间

110℃-22h，135 ℃-4h，165 ℃-1h

去酸方式

氧化酸解

¬原理:

样品用过甲酸处理使蛋白质中的胱氨酸和蛋氨酸分别氧化为磺基丙氨酸和蛋氨酸砜, 然后酸解,打开肽键形成单一氨基酸的混合液, 用色谱分离、测定。

¬基本程序

¬过程控制

基本程序

过程控制

¬过甲酸用量

10mg N：0.3-33ml；7.5-25mg N：2-10ml ¬冷氧化(0℃-16h)与热氧化(55℃-15min)

¬不同终止剂

HBr: Trp、Tyr、His 、Phe

偏重亚硫酸钠：Trp、Tyr

¬酸解方式

¬蒸干与调pH

¬根据需要选择方法

¬高盐样品（NaCL含量≥3％，3mg/mL AgNO3）

色氨酸的测定

¬基本程序50～100mg 样品置聚四氟乙烯管中

110±1℃水解20h

＋1.5mL 4mol/L LiOH , 液N 2冷冻,

抽真空至≤7Pa(或充N 2), 封管

冷却开管转移至25mL

调pH 至约4, 用水定容

离心或过滤,上机

过程控制

¬碱解剂

NaOH、LiOH、Ba(OH)2 KOH

¬水解时间

¬是否用内标

¬不同测定方法

比色法

离子交换色谱

HPLC—UV 、Fluro

游离氨基酸的测定

¬饲料、食品中添加的游离合成氨基酸的测定¬氨基酸肥料当中的游离氨基酸的测定

¬生物材料中游离氨基酸的测定

动、植物组织中的游离氨基酸的测定

--提取与除去蛋白

生理体液中游离氨基酸—沉淀蛋白

尿中的游离氨基酸

游离氨基酸的测定当中的问题

¬这些样品无需水解，但必须从固体样品中完全提取出来

¬除去干扰测定的其他物质（蛋白、金属离子）

去除蛋白方法：化学沉淀法、高速离心法、超滤法和离子交换法

去除金属离子方法：化学沉淀法（EDTA）

蛋白沉淀剂的选择

¬蛋白沉淀剂的选择：应用较多的有苦味酸、磺基水杨酸（SAA）、三氯乙酸、乙醇等，Ohara曾比较上述沉淀剂和丙酮、硫酸锌、氢氧化钡、钨酸钠等九种沉淀剂的测定效果，证明苦味酸、SAA和乙醇效果最好。

随着柱前衍生HPLC法的应用，甲、乙醇沉淀、高速离心和超滤法以及这些方法的结合日趋广泛：Davey等用PITC/HPLC测定生理体液，认为血浆、羊水用乙腈做沉淀剂最适宜，脑脊髓液用超滤法最佳。农业研究中，植物的根、茎、籽实、浆液常用80%的乙醇沉淀蛋白。

游离氨基酸的提取

¬用0.02mol/L浓度的酸反复提取，然后过滤或离心，汇集上清至预定体积；

¬用0.1mol/L浓度的酸提取一次，而后用水反复提取，汇集上清至预定体积，并使最终盐酸浓度达到约0.02mol/L。

实验证明后者优于前者。

添加的游离合成氨基酸的测定

一般食品饲料中添加的合成氨基酸

赖氨酸蛋氨酸

苏氨酸色氨酸

1～2g样品＋0.1mol/LHCl 30mL, 搅拌提取

15min,用水定容,过滤, 无需去蛋白,可直接上机测定。

蛋白、脂肪含量高的样品仍需脱脂和沉淀蛋白

含氨基酸叶面肥料当中的

游离氨基酸的测定

¬称取试样1-5g，置于250mL容量瓶中，加水至刻度，摇匀，取上层清液2mL，加入5%磺基水杨酸溶液2mL，混匀，放置1h，使蛋白质沉淀。再加入1%EDTA溶液1mL和0.06mol/L盐酸溶液1mL，用离心机离心15min。