微生物的计数与活性污泥中生物相的观察

微生物的计数与活性污泥中生物相的观察
一、实验原理
利用血球计数板在显微镜下直接计数，是一种常用的微生物计方法。

此法的优点是直观、快速。

此法计得的是活菌体和死菌体的总和，故又称为总菌计数法。

由于计数室的容积是一定的（0.1mm3），当含有细菌的溶液滴在槽里时，通过水的表面张力扩散到计数室里，细菌也被分散到不同的格里，通过计算不同的格里的细菌数，最后就可以计算出，溶液里所含的细菌数量。

活性污泥中的生物相比较好照样，以细菌和原生动物为主，还有真菌、后生动物等。

在正常的成熟污泥中，细菌大多集中于菌胶团絮绒体中，游离细菌较少，此时，污泥絮绒体可具有一定状、稠密、扩光率强、沉强性能好。

原生动物常作为污水净化指标；当固着型纤毛虫占优势时，一般认为污水处理池运转失常；当后生动物轮虫等大量出现时，意味着污泥极度衰老。

所以可以通过观察原生动物，来评价活性污泥的状况，而且原生动物也较微生物要大，容易观察。

二、实验器材
活性污泥样品、菌种：浓缩酵母菌液
仪器：显微镜、血球计数板、盖玻片
三、实验步骤
1.检查与清洗血球计数板：在正式计数之前，如果沾有杂质或菌体要用95%
乙醇轻轻擦洗计数板的计数室，然后蒸馏水彻底清洗血球计数板，放在
显微镜下观察，调整好显微镜找到计数板刻度，检查有没有损坏。

2.加样：先将盖玻片放在计数室上，用吸管滴一滴已稀释好的菌液于盖玻
片边缘即是旁边的板槽里，让菌液自行渗入，多余的菌液用滤纸吸去；
稍等片刻，待酵母细胞全部沉降到计数室底部，再进行计数。

3.计数：先在低倍镜下找到计数板的大格位置，然后将其移到视野中间，
然后转到高倍镜，适当调节光亮度，不能太亮，也不能太暗，然后将计
数室要计数的格子移到视野中进行计数。

可以先用手机拍下，在手机里
进行点数，另一个人就可以继续移动计数板到另一计数区域，这样就可
以更快、更轻松地完成计数。

4. 计数:本实验用的是25*16型的计数板，所以应该要选择左上，右上，左下，右下，中间五个中格计数，如果有菌体落在双线上时，只计算一边，对应的另一边不算，对每个样品重复计数3次，取其平均值，按下列公式计算每毫升菌液中所含酵母菌的细胞数。

稀释倍数1000040080
小格内酵母菌细胞数80酵母菌的细胞数⨯⨯⨯= 5. 活性污泥的观察：将载玻片与盖玻片清洗干净，然后擦干。

直接用吸管吸取少量的活性污泥，滴一滴到载玻片中央，然后轻轻将盖玻片盖下，削除气泡，多余的水用纸吸干，要尽量将污泥散开，形成薄薄的一层，这样才有利用观察。

转到40倍的物镜，调整好亮度后即可以观察。

四、 实验结果
酵母菌细胞数的测定
原生动物的形态特征
线虫
红头飘体虫 轮虫 水雄虫
五、 思考题
1.说明用血球计数板计数的误差主要来自哪些方面？应如何尽量减少误差，力求准确？
误差主要来自于：
原溶液误差：稀释倍数：稀释的大致范围是每个中格中的细菌数10~50个是比较理想的情况！如果太多，细菌可能会重叠，相互之间有影响；浓度太低，则容易受到其他因素的干扰。

仪器误差：计数板是否清洁干燥，计数板、盖玻片、微量吸管及刻度吸管的规格应符合要求或经过校正，计数法最后的计数都是按照原定的板数据，再加上菌数来计算的，如果仪器本身出现问题而不准确会造成很大的误差。

操作误差：在滴溶液时操作不规范，溶液量滴得过多或过少都会对渗透的菌数造成影响的，个人经验所得滴两滴是最适合的，如果滴一滴则溶液太少了，连槽都还没填满，不容易扩散到计数室里。

一定不能多加，否则计数室内溶液量肯定会超过计数所限制的0.1mm 3，每个小格里都有可能出现上下层的细菌数，若出现部分细菌看不清，无论怎么调都总有一部分细菌看清，则证明所加的量已经超标了，出现了分层，此时应该清洗计数板，重新加液。

2.试述血球计数板的计数原理。

为什么用两种不同规格的计数板计数同一样钟虫 聚缩虫 斜管虫 变形虫
独缩虫 累枝虫
品，结果是一样的？
血球计数板是一种专门用于计算较大单细胞微生物的一种仪器，由一块比普通载玻片厚的特制玻片制成的玻片中有四条下凹的槽，构成三个平台。

中间的平台较宽，其中间又被一短横槽隔为两半，每半边上面刻有一个方格网。

方格网上刻有9个大方格，其中只有中间的一个大方格为计数室。

这一大方格的长和宽各为1mm，深度为0.1mm，其容积为0.1mm3。

在血球计数板上，一个大格分400个小格，每小格面积是1/400 mm2。

16×25型：大方格内分为16中格，每一中格又分为25小格；
25×16型：大方格内分为25中格，每一中格又分为16小格。

但是不管计数室是哪一种构造，它们都有一个共同的特点，即每一大方格都是由16×25=25×16=400个小方格组成。

所以每个小格的面积都是1/400 mm2 16×25型的计数板：取四角：1、4、13、16四个中方格（100个小方格）计数，依下列公式计算：
酵母细胞个数／1mL=100个小方格细胞总数/100 ×400×10000×稀释倍数
25×16型的计数板：计数四个角和中央的五个中方格（80个小方格）的细胞数，依下列公式计算：
酵母细胞个数／1mL＝80个小方格细胞总数/80 ×400×10000×稀释倍数
由公式可以知，实质计的是平均到每个小格的细菌数，而两种型号的小格面积都是一样的，所以计算出来的结果，排除掉误差因素，理念上应该是一样的
3.根据实验观察结果，试对活性污泥的质量及运行情况作初步评介。

实验观察到，活性污泥中出现了大量的飘体虫，中量的轮虫、累枝虫、独缩虫和聚缩虫，还有少量钟虫、雄虫、线虫、变形虫和斜管虫。

出现轮虫代表污泥处理效果好，但如果大量出现则表明污泥已经极度衰老，出现污泥鼓胀。

大量的飘体虫，中量的轮虫、独缩虫和聚缩虫的出现都表明流动性污泥质量好，运行情况和出水效果好。

4.请说说平板菌落计数法和比浊法的实验原理和实验步骤。

平板计数法：将行测样品经适当稀释后，其中的微生物充分分散成单个细胞，取一定量的稀释样液接种到平板上，经过培养，由每个单眼细胞生长繁殖而形成肉眼可见的菌落，即一个菌落应代表原样品中的一个细胞。

（1） 将样品菌液稀释一系列的浓度梯度
（2） 将每个浓度的菌液涂布到三个平板上，然后培养一定时间
（3） 根据公式5⨯⨯=N M cfu 计算每个平板的菌落数，然后算每组浓度
三个平板的cfu 平均值。

cfu —每毫升中菌落形成单位；
M —同一稀释度3次重复的平均菌落数；
N —稀释倍数。

通过涂布的溶液难以完全分散成单个细胞，有些菌落可能是来自1个以上的细胞，而且无法没到死细胞的数量，所以所测数值偏小，而且操作麻烦，耗时耗材，但可以测到活细胞的数量；
比浊法：细菌分布在溶液里，会对所照射的光进行吸收或反射、散射。

所以当用分光去照射溶液时，所能透过的分光会因为菌液浓度的不同而不同，此时细菌悬液的浓度与光密度（OD ）值成正比，当与由已知菌落数的标准溶液所测的标准曲线计算，就可以得出相应的菌落数。

（1） 根据已知菌液浓度的标准液稀释成一系列浓度梯度的标准菌液，定容
到一定的体积；
（2） 将样品菌液稀释一定的浓度，定容一定的体积；
（3） 测标准菌液和样品菌液的Abs ，然后根据由标准菌液所得的标准曲线
算出样品菌液的浓度。

由于溶液里还有其物质会对紫外光有作用，例如细胞的残体、其他溶液物质、杂质等等，所以所测数值会偏高，但方法简单，易操作，每个样品只要很短时间就可以测出来。

总结：
微生物实验的核心就如老师第一节课所说的：消毒灭菌、无菌操作、纯种培养。

这三环是环环相扣的，贯穿整个微生物实验。

从第一个实验：培养基的制备与空气中微生物的检测，就要严格按照这三大核心来进行实验了，而第二个实验：细菌的革兰氏染色与显微观察，虽然没有以上步骤，但那是因为这只是实验中的一个环节被我们单独出来了，它所需要的菌种也都是要经过以上的步骤的，最后一个实验：微生物的计数与活性污泥中生物相的观察，也是如此，总之只要是微生物实验就要涉及到微生物，涉及到微生物就必须要经历过三大步骤，水中大肠菌群的检测法和土壤中四类微生物的分离纯化，就要严格执行这三个步骤了，因为其他微生物的污染要严重影响实验结果，甚至导致实验失败。

对于准确性，也严格测量所需要的试剂和样品的，微生物就没有像监测之类的那么严格了，除非是做定量的分析，可能就要比较严格了。

或许这也是我喜欢做微生物实验之一
微生物实验到此就完满结束了，虽然所做的实验并不是很多，但也学到不少东西，而且老师的教学方式也是第一次遇到，实验并不是一点点按老师那样做，而是要看自己的预习还有能力去完成，对比起来这样才更像实验，而且教学效果比起大一大二的那些所谓实验要好很多，相比于工程班的效果也要好点。

有次提前到实验室看到工班的同学还在实验，虽然那个实验老师很温柔，但对同学好像反而不太好，因为他们太放松了，同样的实验我们班做了3个半小时，他们接近4个半小时。

所以有时觉得实验真的要严格点，这样对我们专业才有帮助，而广工对于学习上的事放得太松了，这不利于学生的发展啊。

而且做了这么多实验，还是觉得微生物的实验最有趣，可能是因为不像其他实验那样，做得那么急，微生物的实验总会有时间停下来思考一下的。