牛乳中嗜冷菌的危害 牛乳中嗜冷菌的检测方法 - 养牛技术
嗜冷菌检测方法
嗜冷菌检测方法嗜冷菌检测方法嗜冷菌概念牛乳挤出来要经过冷却处理，降低乳温从而抑制细菌的生长繁殖，但在低温条件下有些细菌也能生长，而这类细菌即为低温菌。
低温菌又包括嗜冷菌和耐冷菌。
嗜冷菌主要存在于低温环境中，包括两类微生物，一类是专性嗜冷菌（Psychrophiles）最高生长温度不高于20℃，最适生长温度为15℃，在0℃仍然可以生长繁殖的微生物；另一类为兼性嗜冷菌（Psychrotrophics），又名耐冷菌，最高生长温度高于20℃，最适生长温度高于15℃，在0～5℃仍然可以生长繁殖的微生物。
专性嗜冷菌主要分布在常冷低温区，对温度的变化比较敏感，20℃以上即很快引起死亡；而兼性嗜冷菌分布范围较宽，从常冷到不稳定的低温环境中都能分离到。
方法一：基准法—6.5℃，培养10天（仲裁法）1 范围此方法用于原奶和巴氏杀菌奶的检验。
2 方法提要2.1 准备好倒有培养基和定量稀释适当倍数的被测样品的培养皿。
2.2 将培养皿在6.5℃条件下培养10天。
2.3 根据培养皿中的菌落数计算出每毫升样品中的菌落数，选择菌落数比较恰当的稀释倍数比较得当的培养皿进行菌落计数。
3试剂3.1 稀释液生理盐水：0.85％的氯化钠水溶液，灭菌。
3.2 培养基平板计数琼脂23.5g+脱脂奶粉1g，溶于1000ml水中。
必要时用滤纸过滤。
调节pH值为6.9±0.1。
将培养基分装倒入三角瓶中，每瓶100—150ml。
在121±1℃下灭菌15min，如果培养基马上要用，用水浴锅冷却到46±1℃。
如果不是，则为了不耽误培养基的使用，在实验开始前，将培养基放入沸腾水浴中使其完全熔化，然后再放入水浴中冷却到46±1℃。
注：其中脱脂粉应该不含有抑菌剂。
4 仪器及玻璃器皿微生物实验室常用仪器，制备和稀释样品所用仪器以及：4.1 培养箱，可以调节并保持到6.5±0.5℃4.2 pH计，带温度补偿，精度为0.14.3 水浴，可以保持到46±1℃4.4 三角瓶，250—300ml，带合适的塞子。
生乳中嗜冷菌的快速检测方法验证及运用
1 嗜冷菌的定义及危害 1.1 定义
牛 乳 挤 出 后， 经 冷 却 处 理 降 温 到 2 ～ 4 ℃，能抑制大部分的细菌生长， 但部分细菌在低温条件下也能生长， 这类细菌即为低温菌，低温菌又包括 嗜冷菌和耐冷菌，嗜冷菌又分为专性 嗜冷菌和兼性嗜冷菌。专性嗜冷菌最 适生长温度一般为 15 ℃，最高不超过 20 ℃，0 ℃时也能生长繁殖。兼性嗜 冷菌最适生长温度为 20 ℃，0 ～ 5 ℃ 时也能生长繁殖。 1.2 危害
对 于 生 乳 中 嗜 冷 菌 的 检 测， Soleris 仪器在设置 16 ℃条件下测试 结果与冰箱内培养、培养箱内培养的 平板计数结果相关性良好（与冰箱培养 计数结果吻合度高达 96%，与培养箱 培养计数结果吻合度为 88%），由表 2 数据可得同一设定条件下冰箱培养结 果和培养箱培养结果偏离程度不超 1.0 的吻合度为 92%，soleris 测试结果完 全可满足生乳嗜冷菌的定量检测要求。
11 21 2.44×103
12 28.8 2.08×102
GB 19301—2010 中 虽 然 没 有 对 生 乳 中 嗜 冷 菌 进 行 要 求， 但 T/DAC 003—2017 对学生饮用奶生牛乳中有 嗜 冷 菌 ≤ 1×104 cfu/mL 的 要 求。 结 合目前实际生产运用情况，当嗜冷菌 ≤ 20×104 cfu/mL 时用于长保质期产 品，当嗜冷菌≤ 40×104 cfu/mL 时用 于短保质期的产品生产未出现产品坏 包的现象。 3.2 检测方法运用
测试管
温度
阈值
跳跃值
休眠
检测时长
嗜冷菌
16 ℃
10
1
25
48
2.4 结果与分析 据绘制的标准曲线图得原奶嗜冷
双温度培养法快速检测乳与乳制品中嗜冷菌
原料奶 品质 的优质 与 否 ，直接 影响奶 制 品的质
本文 提 出的方 法 为双 温度 培养 法 ＿ ｌ ５ 】 ， 分别为 １ ７ ｏ 【 二 和 ６ ． ５℃。第一步培养时适 当提高嗜冷菌培养温度 ， 使 嗜 冷菌快速通过 生长延滞期 ， 便 于单个 嗜冷菌快 速繁殖
量 。原 料奶 品质 的关键在微生 物指标上 ， 乳 品厂会
Ｐ ｓ ｙ ｃ ｈ ｒ ｏ ｐ ｈ ｉ ｌ ｉ ｃ ｗｅ ｆ ｏ ｕｎ ｄ ｔ ｈ ｅ ｔ ｅ ｓ ｔ ｒ ｅ ｓ ｕ ｌ ｔ ｈ ａ ｓ ｈ ｉ ｇ ｈ ｃ ｏ ｎ ｓ ｉ ｓ ｔ ｅ ｎ ｃ ｙ ． Ａｎ ｄ ｔ ｈ ｅ ｐ ｒ ｅ ｃ ｉ ｓ ｉ ｏ ｎ ａ ｎ ｄ ｒ ｅ ｐ ｒ ｏ ｄ ｕ ｃ ｉ ｂ ｉ ｌ ｉ ｔ ｙ ｅ ｘ ｐ ｅ ｒ ｉ ｍｅ ｎ ｔ ｓ ｃ ｏ ｎ ｆ ｏ ｒ ｍ ｔ ｏ ｒ ｅ ｑ ｕ ｉ ｒ ｅ ｍｅ ｎ ｔ ｓ ．Ｔｈ ｅ ｔ ｉ ｍｅ ｔ ｈ ａ ｔ Ｄｕ ａ ｌ —Ｔ ｅ ｍｐ ｅ ｒ ａ ｔ ｕｒ ｅ Ｃｕ ｌ ｔ ｕ ｒ ｅ Ｍｅ ｔ ｈ ｏ ｄ ｔ ａ ｋ ｅ ｗａ ｓ ｓ ｈ ｏ ｒ ｔ ｅ ｒ ｔ ｈ ａ ｎ Ｓ ｔ ａ ｎ ｄ ａ ｒ ｄ
ｂ ｙ Ｄｕａ ｌ －Ｔｅ ｍ ｐｅ ｒ ａ ｔ ｕｒ ｅ Ｃｕｌ ｔ ｕ ｒ ｅ Ｍｅ ｔ ｈｏ ｄ
Ｌ Ｉ Ｕ Ｘ ｉ ａ ｏ － ｃ ｈ ｕ ａ ｎ ， ＹＵ Ｄ ｏ ｎ ｇ － ｗｅ ｉ ， Ｌ Ｉ Ｕ Ｚ ｈ ｉ — ｎ ａ ｎ， Ｌ Ｉ Ｈａ ｉ － ｊ ｉ ａ ｏ ， ＸＵ Ｅ Ｚ ｈ ｉ — ｑ ｉ ｎ ｇ ， ＤＵ Ｌ ｉ ，
１ 材 料 与方 法
前保持 低温冷藏很大程 度上抑制 了微生 物繁殖 ， 但是
嗜冷菌 在此条件下仍可 生长并 占主导地位 ， 成为影 响
嗜冷菌对乳制品加工及贮存的影响和控制措施
嗜冷菌对乳制品加工及贮存的影响和控制措施作者：韩秋红，李琴，李凯锋来源：《现代食品》 2018年第15期乳与乳制品有较高的营养价值，百姓对乳与乳制品的青睐和关注与日俱增。
乳中菌落总数的测定是在37 ℃进行，而嗜冷菌适宜在低温环境下生长繁殖，在35 ℃以上嗜冷菌已不能生长。
因此，在乳的加工和贮存过程中，人们很容易忽视了嗜冷菌，从而对乳制品的品质产生不好的影响，所以有必要全面了解嗜冷菌对乳制品加工及贮存的影响及控制措施。
1 嗜冷菌的生长环境有一部分微生物，它们能够耐受很低的温度，并在很低的温度环境下生长，这些低温环境包括长期低温的深海、地球两极的土壤、冰川和高空以及冬季等短期低温环境。
2 嗜冷菌嗜冷菌是一类菌的总称，这类菌一般是在0 ～20 ℃最适宜生长，由于这个温度范围与其他菌的最适宜生长温度范围相比要低很多，故此得名嗜冷菌[1]。
2.1 嗜冷菌的分布嗜冷菌在地球上的分布极其广泛，它们的踪迹遍布在高山、极地地区，以及大洋的深处。
除细菌外，在寒冷地区也发现有放线菌、霉菌、酵母和低温藻类[2]。
2.2 嗜冷菌的分类嗜冷菌按生活环境温度分类主要包括两大类微生物：专性嗜冷菌，兼性嗜冷菌（又名耐冷菌）[3]。
①专性嗜冷菌最高生长温度不超过20 ℃，最适生长温度为15 ℃或者更低，在0 ℃依然可以生长繁殖[1]。
专性嗜冷菌对热极度敏感，很难能分离到专性嗜冷菌。
②兼性嗜冷菌的最高生长温度可以超过20 ℃，最适生长温度高于15 ℃，0 ～ 5 ℃也能生长繁殖，适应的温度范围更广，在环境中存在更为广泛[1]。
兼性嗜冷菌在0 ℃生长繁殖极其缓慢，往往需要在数周以后方能在培养基上肉眼看到兼性嗜冷菌。
2.3 嗜冷机制因为拥有特殊的脂类细胞膜结构，嗜冷菌才能存活于冰点下并进行生长繁殖。
这种细胞膜中有很多不饱和脂肪酸，它使菌内蛋白质呈现“抗冻能力”，在低温时仍然保持其内部为液态环境，并保护细胞膜具有通透性和较好的流动性，不仅有利于物质的运输，而且能够保护嗜冷菌的DNA 免受伤害。
生牛奶中的主要微生物检测方法及其控制
生牛奶中的主要微生物检测方法及其控制生牛奶是一种营养丰富的饮品，但是由于其含有丰富的营养物质和水分，使得它成为微生物生长和繁殖的理想介质。
必须采取有效的方法来控制生牛奶中的微生物，以确保其安全性和质量。
本文将介绍生牛奶中的主要微生物检测方法及其控制措施。
1. 细菌生牛奶中的细菌可分为好氧菌、厌氧菌和嗜冷菌。
好氧菌包括乳酸菌、酵母菌和霉菌等，它们在常温下就能生长繁殖，对牛奶的质量有直接影响；厌氧菌会在贮藏和加热过程中大量繁殖，造成牛奶变质；嗜冷菌则在低温下能够生长，甚至在冷藏条件下也难以被彻底消灭。
2. 病原微生物生牛奶中可能存在的病原微生物包括沙门氏菌、霍乱弧菌、变形杆菌等，它们会对人体健康造成危害。
1. 好氧菌总数检测好氧菌总数是评价牛奶卫生质量的一个重要指标，通常采用平板计数法进行检测。
具体操作步骤如下：- 取少量样品，加入平板计数培养基中，均匀涂抹在培养基表面。
- 将培养皿倒置，放入恒温箱中，培养时间为24-48小时。
- 经培养后，统计菌落的数量，计算出好氧菌总数。
2. 乳酸菌检测乳酸菌是一种益生菌，但也有一些乳酸菌会引起牛奶变质，因此需要进行检测。
目前常用的方法包括PCR法、荧光显微镜法和光学显微镜法等。
病原微生物的检测通常需要专业实验室进行，采用培养法、PCR法等技术进行检测。
1. 严格控制生产和加工环节生产和加工过程是控制牛奶微生物的关键环节，必须严格遵守相关的卫生标准和操作规程，保持生产设施和设备的清洁卫生，确保原料的卫生质量。
2. 严格控制储存和运输条件牛奶在储存和运输过程中，应保持适宜的温度和湿度，避免微生物的生长和繁殖。
在运输中，应采取措施避免交叉污染。
3. 采用适当的杀菌技术在生产过程中，应采用适当的杀菌技术对牛奶进行处理，如加热灭菌、紫外线辐照和过滤等，以确保牛奶的安全性和卫生质量。
4. 严格控制产品质量生产企业应建立健全的质量管理体系，制定严格的产品标准和质量控制程序，严格把关生产环节，确保产品的卫生安全。
乳业嗜冷菌
3
3.9X 10 4
4
3.3X 5 10
6
1.2X 10 6
+
8
3.2X 10 8
--10 C保藏
。
日数 项目 P.f 菌 数/ml
苦味
0
30
1
2.7X 10 3
2
3.7X 10 5
3
3.5X 10 7
5
5.5X 10 8
7
3.0X 10 9
+
8
4.0X 10 9
25 C保存
。
日数 项目 P.f 菌 数/ml
37 C/48hr 6.5 C/10days
。
。
。
嗜冷菌与嗜温菌生长曲线
。 . 说明:牛乳中细菌总数的测定是在37 C下培养48hr. 。
37 C时嗜冷菌不能生长,在生产实践中往往被忽略.
低温储藏时使其它菌种失去生存的能力.为嗜冷菌的
生长创造条件.
2014-9-10
奶牛 挤奶
奶户和牧场
奶站和运输环节可通过设备的
嗜冷菌对UHT乳的 危害及相关因素分析
。研究背景 。嗜冷菌对UHT的危害 。对UHT的危害的重要因素分析 。对某地区奶源的调查结果 。在农户和牧场环节对嗜冷菌的检测 。分析与结论
2014-9-10
研究背景
1涨包变质
2 未涨包却 有白色沉淀物 或有絮状物
3开始正常，十天后 其中一包有苦味， 组织状态不变
项目
百分率
人工榨 机械榨 自来水 贮奶 乳 乳
90% 10% 90%
深井水 贮奶 9.5%
缺少水 奶户 10%
冰箱贮 牧场奶 养3-5头 奶
0.5% 8% 80%
生鲜牛乳微生物的检测与分析
胰 蛋 白胨 ５０克 ， 脂 奶 粉 １ ． 脱 ． ， ． ０克 Ｇ１ ０克 ， 脂 １ － 琼 ０
余一 半 中菌落分 布又 很均匀 ，即可计 算半 个平 板后 乘 ２以代表 全皿 菌落数 。平皿 内如有链 状 菌落 生长
琼脂 培养基 倾人加 有 １ 毫升 生理盐 水 的灭 菌平皿 内 作空 白对照 。待琼脂凝 固后 ， 翻转平 板 ， 于 ３ ＋ ℃ 置 ６１
① 试验样 品
奶站、 ４家 农 户 。
试验样 品来 源于 ４个 奶牛 场 、 ４个
保温 箱 内培养 ４ ＋ ８ ２小 时。
选 取菌 落数 在 ３ ￣ ０ ０ ３ ０之 间 的乎 板 作 为 菌 落 总
时（ 落 之 间无 明显 界 线 ）若 仅 有 ｌ条 链 ， 视 为 １ 菌 ， 可 个菌 落 ； 如果 有不 同来 源 的几条 链 ， 应 将 每条链 作 则
为 １个菌落计 。
ｌ ５克 ， 馏水 １ ０ 蒸 ０毫升 。 以上 比例 配制成 嗜冷菌 ０ 按
快 速检 测培 养 基后 ，分 装 ，２ ￣ ５分钟 高 压灭 菌 。 １１ １ Ｃ
③ 耐 热芽孢 数检 测 要 检 测原 料乳 中耐 热芽 孢
农 技 ２ｌ １ ５ 村科 Ｏ（ １） ９
Ｎ ｇ —ｕ —Ｃ ｎ
数 只需将 １ ０毫 升原料 奶样 品加 热至 Ｉ０Ｃ 并 在此 Ｏ ￣，
吸管 吸取 原料 乳 １ 升 ，沿管 壁徐 徐注 入 含有 ９毫 毫
升 灭 菌生理盐 水 的试管 内（ 注意 吸管尖 记 。 在 每个 含 样 品 的培养 皿 中加 入 约 １ ０毫 升冷 却 无菌 液态 营养琼 脂 ，转动培 养皿 使样 品 与液体 琼脂
嗜冷菌数检测培训内容
嗜冷菌数检测培训内容一、引言嗜冷菌是一类适应低温环境生长的微生物，它们在低温下能够正常繁殖和代谢。
嗜冷菌的检测对于食品、水质、环境等领域具有重要意义。
本文将介绍嗜冷菌数检测的培训内容，包括检测方法、样品处理、培养条件等方面的知识。
二、嗜冷菌数检测方法1. 嗜冷菌数量的测定方法主要有平板计数法和膜过滤法。
平板计数法适用于嗜冷菌数量较多的样品，膜过滤法适用于嗜冷菌数量较少的样品。
2. 平板计数法的步骤：（1）将样品取适量加入培养基中，均匀涂布在富含营养物的琼脂平板上；（2）将琼脂平板放入低温环境，使嗜冷菌生长；（3）经过适当时间后，通过计数器对琼脂平板上的菌落进行计数，得到嗜冷菌的数量。
3. 膜过滤法的步骤：（1）将样品通过膜过滤装置过滤，将过滤膜放置在富含营养物的琼脂平板上；（2）将琼脂平板放入低温环境，使嗜冷菌生长；（3）经过适当时间后，通过计数器对琼脂平板上的菌落进行计数，得到嗜冷菌的数量。
三、样品处理1. 样品的收集和保存（1）对于食品样品，应在低温条件下采集，并尽快送至实验室进行处理；（2）对于水质样品，应使用无菌容器采集，并尽快送至实验室进行处理；（3）对于环境样品，应选择合适的采样点和采样工具，并尽快送至实验室进行处理。
2. 样品的预处理（1）对于食品样品，应先进行均质处理，以确保样品的均匀性；（2）对于水质样品，应先进行过滤处理，以去除杂质；（3）对于环境样品，应先进行稀释处理，以适应检测方法的要求。
四、培养条件1. 嗜冷菌的适宜生长温度一般在0℃-15℃之间，不同的嗜冷菌对温度的要求有所不同，因此在培养过程中应根据具体的嗜冷菌种类来调整温度。
2. 嗜冷菌的培养基应选择适合其生长的培养基，一般含有蛋白胨、酵母粉、葡萄糖等成分，以提供必要的营养物质。
3. 嗜冷菌的培养时间一般较长，需要在适宜温度下培养数天甚至数周，以获得足够的菌落数量。
五、结果分析与报告1. 根据实验结果，可以计算出嗜冷菌的数量，并进行统计分析。
乳和乳制品中嗜冷菌及其耐热酶的危害与控制研究
嗜冷菌 （ Ｐ ｓ ｙ ｃ ｈ ｒ ｏ ｔ ｒ ｏ ｐ ｈ ｉ ｃ ｂ ｃｔ ａ ｅ ｒ ｉ ａ ） 是 指在 ６ ． ５ ｏ Ｃ 条件
作者简介 ： 王娇（ １ ９ ８ ７ 一） ， 女（ 汉） ， 硕士研究生 ， 研究方 向 ： 乳品质量
安全 。
摘 要： 嗜 冷茵是乳低 温贮藏 中的主要腐败 茵， 嗜冷茵及 其代谢酶的存在 直接 影响原料乳的质量 ， 阐述 了嗜冷 茵及
其耐热酶类对乳及乳制品的危害 ， 并 通 过 分 析 嗜 冷 茵 的适 冷 机 理 和 影 响 酶 活 的 因素 ， 探 讨 控 制 嗜 冷 茵及 其代 谢 酶 的 方法 。 以保 障原 料 乳 质 量 。
关键词 ： 嗜冷茵； 耐热 ｙ ｓ ｉ ｓ ａ ｎ ｄ Ｃｏ ｎ ｔ ｒ ｏ ｌ ｏ ｆ Ｐｓ ｙｃ ｈ ｒ ｏ ｔ ｒ ｏ ｐｈ ｉ ｃ Ｂａ ｃ ｔ ｅ ｒ ｉ ａ ｓ ｎｄ ａ Ｈｅ ａ ｔ Ｒｅ ｓ ｉ ｓ ｔ ａ ｎ ｔ Ｅｎ ｚ ｙ ｍｅ ｓ ｉ ｎ Ｒａ ｗ Ｍｉ ｌ ｋ ａ ｎ ｄ Ｄａ ｌｒ ｙ Ｐｒ ｏ ｄ ｕｃ ｔ ｓ
原料奶嗜冷菌的危害及其控制方法
原料奶嗜冷菌的危害及其控制方法杨亚军概要质量数据对比分析显示，原料乳中微生物数量和嗜冷菌数量不存在有效的正反关联，即微生物合格率高的原料奶，其嗜冷菌数量未必低，反之，微生物合格率低的原料奶，其嗜冷菌数量未必就高（详见附件1），因此本文简述了低温菌的概念、来源及其危害，着重介绍嗜冷菌控制措施。
一、嗜冷菌概念牛乳挤出来要经过冷却处理，降低乳温从而抑制细菌的生长繁殖，但在低温条件下有些细菌也能生长，而这类细菌即为低温菌。
低温菌又包括嗜冷菌和耐冷菌。
嗜冷菌主要存在于低温环境中，包括两类微生物，一类是专性嗜冷菌（Psychrophiles）最高生长温度不高于20℃，最适生长温度为15℃，在0℃仍然可以生长繁殖的微生物；另一类为兼性嗜冷菌（Psychrotrophics），又名耐冷菌，最高生长温度高于20℃，最适生长温度高于15℃，在0～5℃仍然可以生长繁殖的微生物。
专性嗜冷菌主要分布在常冷低温区，对温度的变化比较敏感，20℃以上即很快引起死亡；而兼性嗜冷菌分布范围较宽，从常冷到不稳定的低温环境中都能分离到。
乳的低温菌污染被认为是影响乳制品保质期的最为重要因素之一。
二、嗜冷菌的危害嗜冷菌广泛存在牛乳的外部环境中，如：土壤、灰尘、空气、水、草料、粪便等中，而牛体乳房部位、挤奶设备管道容器内以及挤奶现场环境中的嗜冷菌最有可能进入牛奶当中，对原料乳造成污染。
这种细菌可以在冷藏温度下的牛乳中大量繁殖，并产生可以侵害乳中营养成分的热稳定酶类，如耐热性蛋白酶、脂肪酶、磷脂酶等，不但引起产品酸包、苦味包、乳清分离、变色发粘，脂肪分离等变质现象发生，而且还会影响乳制品的加工。
乳中所含嗜冷菌极其胞外酶浓度的大小直接影响着牛乳的货架期，加工过程中一般采用的热杀菌只能杀灭乳中细菌包括嗜冷菌，但其所产生的耐热性胞外酶却仍然能够保持活性，最终会导致超高温灭菌奶的苦味、凝结等不良腐败现象的发生。
降低嗜冷菌在生长繁殖过程中产生的耐热性胞外酶的浓度，以确保奶制品的质量及其货架期。
试验牛乳中细菌的检查
标准平板计数法：
? 广泛应用的常规方法。 ? 此方法较为敏感，牛乳中含有少量细菌时，
能得出比较正确的结果。我国消毒牛乳的卫 生标准是细菌总数 <30 000个/ml。
三、器材
1. 牛乳样品和培养基 亚奥特巴氏消毒牛奶样品
2. 溶液或试剂 美兰溶液（ 1：250 000），无菌水等
殖。 牛乳样品的细菌含量可反映母牛的健康状
况和牛乳生产与保藏条件
牛乳的细菌学检查方法：
1. 显微镜直接计数法——涂片面积与视野 面积之比估算法。（不精确）
2. 美兰还原酶试验法。 3. 标准平板法。
美兰还原酶试验法：
? 美兰是一种氧化还原指示剂，在厌氧环境中，它将 被还原成无色。
? 如果牛乳中有细菌生长繁殖，必将造成其中溶解氧 的减少，牛乳样品中的氧化-还原电势降低。通过加 入其中美兰颜色的变化速度，可鉴定该牛乳的质量。
? 测试管在水浴中稳定 5min 中后，取出，轻轻 倒转一次后再放回水浴中
? 每隔30min 观察记录试管中美兰颜色的变化， 直至3~6h
2、巴斯德法消毒牛乳
? 将水浴锅的温度调至80℃ ? 将牛乳样品用力摇匀，使微生物能均匀分布 ? 用灭菌的10ml吸管吸取5ml生牛乳样品放入灭菌试管内，
然后将试管放入调好温度的水浴锅中，水面要超过牛 乳表面 ? 保持15min ，并不时摇动 ? 一到15min 立刻取出试管，用流水冲试管外壁，使其中 的牛乳迅速冷却。
3. 仪器或其他用具
四、操作步骤
1. 美兰还原酶试验法
? 标记2个无菌试管 1、2 ? 分别向2个试管中加入 5ml 的牛乳样品（ 1号亚
奥特-变质， 2号亚奥特 -新） ? 分别向试管中各加入 1ml 美兰，盖紧管塞
原料奶嗜冷菌快速检测方法分析
从检测成本上衡量，LAL 法、生物发光法、电阻抗法和流动血细胞法的检测 成本都是很高的，因为这几种方法都需要很昂贵的检测设备和复杂的实验方法。 PCR-ELISA 法的缺点在于不能确定从样品中分离出来的 DNA 的来源，即不知道是 从活细胞中分离出来的，还是从死细胞中分离出来的。氨肽酶法与和其他方法相 比在这一方面则具有很大的优势，它是一个显色反应，当样品中的微生物数量达 到一定程度时，反应体系就可以呈现出肉眼可见的颜色。
原料奶嗜冷菌快速检测方法分析
嗜冷菌作为冷藏原料奶中生长的优势菌群，在原料奶贮存过程中会大量繁殖， 并产生及其耐热的脂肪酶和蛋白酶，这些酶类在高温处理后仍会有残留，并在 奶 制品储藏过程中继续分解其中的脂肪和蛋白质，导致产品的风味和质地产生变化。 因此，研发出一种即快速又实用的嗜冷菌计数技术成为乳品行业关注的焦点。
标准平板计数法之间的相关度最低，电阻抗方法和 ELISA 技术的相关度最高。流
动血细胞法、DEFT 法、生物体发光法、PCR-ELISA 法、氨肽酶法、电阻抗法和 ELISA
法在这一点上都是等同的。
衡量快速检测方法的是否适应于工业生产，要看得出检测结果的时间。从表
一我们可以看出 LAL 法为1小时，DEFT 法和生物发光法为10-20分钟，氨肽酶法获
科标化工分析检测中心致力于推动化工产业发展，欢迎各行同仁前来洽谈、合作。
系
数
检
3-4
测
10-20 10-20
2.5小 >8小 >3小
1小时 小
>2.5小时
时
分钟 分钟
时 时时
时
间
检
测
牛乳中的嗜冷菌对乳制品的影响
xx中的嗜冷菌对乳制品品质的影响嗜冷菌及其来源途径1.1xx及乳制品中的主要嗜冷菌在乳品工业界“嗜冷菌”被定义为能够在7℃以及更低温度条件下生长繁殖，不论其最适生长温度条件是多少的一类微生物。
在刚挤出的鲜乳中嗜冷菌数量占细菌总数的不到10%；而在冷藏条件下，嗜冷菌快速生长繁殖而成为牛奶中种群数量占优势的微生物菌群。
在牛乳中发现的最常见的嗜冷菌为假单胞菌属（Pseudomonas），特别是荧光假单胞菌（Ps.fluorescens）。
有人统计了1960年～1970年整个十年期间原料乳和乳制品中嗜冷菌的种类及其出现率，其结果表明假单胞菌属占嗜冷菌总数中的绝大部分，同时也存在有芽孢杆菌属（Bacillus）、微球菌属（Microccus）、埃希氏菌属（Escherichia）、黄杆菌属（Flavobacterium）、肠杆菌属（Enterobacter）、产碱杆菌属（Alcaligenes）等〔1〕1.2来源嗜冷菌在自然界中无处不在，它广泛存在于牛乳的外部环境如土壤、灰尘、空气、水、草料、粪便等当中，但在奶牛乳房内很少发现。
因此，在牛乳房表面、不清洁的挤奶器内和运送牛乳的无缝不锈钢管道及其阀门很可能存有嗜冷菌的污染源。
特别是设备停车期间，在存在污染源的部位嗜冷菌利用残存牛乳生长和大量繁殖，当设备开始运行时流经该部位的牛乳便被嗜冷菌污染。
嗜冷菌产生的蛋白酶嗜冷菌产生的蛋白酶是微生物为了消化酪蛋白而分泌的胞外降解性酶类,有三种形式,即胞内蛋白酶、胞壁蛋白酶和胞外蛋白酶。
Keogh曾报道UHT奶发生胶凝与嗜冷菌产生的胞内蛋白酶有关。
目前的研究集中于胞外蛋白酶，其多数属耐热的碱性金属蛋白酶，Zn2+和Ca2+是酶活性中心，对热处理有非常高的稳定性；最适的温度和pH分别是30～40℃和6～8。
嗜冷菌胞外蛋白酶耐热的机理在于经过高温处理后，未被破坏的处于非折叠状态的蛋白酶分子（无活性）重新折叠成有活性的天然构象〔2〕。
牛奶中嗜冷菌危害及其检测方法资料
牛奶中嗜冷菌危害及其检测方法摘要: 虽然低温保藏及冷链技术限制了牛奶中微生物的繁殖与代谢, 但是在低温环境中恰恰非常适合嗜冷菌的生长代谢, 并影响牛奶质量。
生产中通常用巴氏杀菌和超高温灭菌来杀灭牛奶中的嗜冷菌, 却无法消除由嗜冷菌所分泌的较高的耐热性的脂肪酶和蛋白酶, 进一步影响乳及乳制品风味质地。
因此快速检测牛奶中的嗜冷菌, 对于控制生牛奶中嗜冷菌繁殖、提高乳制品产品质量、延长货架期等都具有重要的现实意义。
本文主要总结与讨论了牛奶中嗜冷菌的危害以及几种常见的对原料奶中嗜冷菌快速检测的方法, 包括直接荧光过滤技术、电阻抗法、酶联免疫吸附法、流式细胞计数法、氨肽酶法、聚合酶链反应结合酶联免疫吸附法, 并将它们在工业应用上的优缺点进行了比较。
关键词: 嗜冷菌; 原料乳; 快速检测; 危害ABSTRACT: The techniques of cryopreservation and cold chain limit the microbial reproduction and metabolism in milk. However, a low temperature environment is very suitable for the growth and metabolism of psychrophilic bacteria. Pasteurized and ultra high temperature sterilization is usually used to kill psychrophile, but they are unable to remove the heat-resistant lipase and protease produced by the psychrophile, finally to affect the flavor and texture of dairy products. Therefore, rapid detection of milk psychrophile in raw milk is important for microbial control, quality improvement and shelf-life extending. This paper summarizes and discusses the hazards of psychrophile in milk, as well as several common rapid detection methods for psychrophile in raw milk. These methods include direct fluorescence filtering technology, electrical impedance method, enzyme- linked immunosorbent assay, flow cytometry,aminopeptidase enzyme,. The advantages and disadvantages in industrial application are also compared.KEY WORDS: psychrophilic bacteria; raw milk; rapid detection; hazard引言嗜冷菌是一类菌的总称, 这类菌一般是在0℃～20℃之间最适宜生长, 由于这个温度范围与其他菌的最适生长温度范围相比要低很多, 故此得名嗜冷菌。
嗜冷菌检测方法
嗜冷菌检测方法嗜冷菌概念牛乳挤出来要经过冷却处理，降低乳温从而抑制细菌的生长繁殖，但在低温条件下有些细菌也能生长，而这类细菌即为低温菌。
低温菌又包括嗜冷菌和耐冷菌。
嗜冷菌主要存在于低温环境中，包括两类微生物，一类是专性嗜冷菌（Psychrophiles）最高生长温度不高于20℃，最适生长温度为15℃，在0℃仍然可以生长繁殖的微生物；另一类为兼性嗜冷菌（Psychrotrophics），又名耐冷菌，最高生长温度高于20℃，最适生长温度高于15℃，在0～5℃仍然可以生长繁殖的微生物。
专性嗜冷菌主要分布在常冷低温区，对温度的变化比较敏感，20℃以上即很快引起死亡；而兼性嗜冷菌分布范围较宽，从常冷到不稳定的低温环境中都能分离到。
方法一：基准法—6.5℃，培养10天（仲裁法）1 范围此方法用于原奶和巴氏杀菌奶的检验。
2 方法提要2.1 准备好倒有培养基和定量稀释适当倍数的被测样品的培养皿。
2.2 将培养皿在6.5℃条件下培养10天。
2.3 根据培养皿中的菌落数计算出每毫升样品中的菌落数，选择菌落数比较恰当的稀释倍数比较得当的培养皿进行菌落计数。
3试剂3.1 稀释液生理盐水：0.85％的氯化钠水溶液，灭菌。
3.2 培养基平板计数琼脂23.5g+脱脂奶粉1g，溶于1000ml水中。
必要时用滤纸过滤。
调节pH值为6.9±0.1。
将培养基分装倒入三角瓶中，每瓶100—150ml。
在121±1℃下灭菌15min，如果培养基马上要用，用水浴锅冷却到46±1℃。
如果不是，则为了不耽误培养基的使用，在实验开始前，将培养基放入沸腾水浴中使其完全熔化，然后再放入水浴中冷却到46±1℃。
注：其中脱脂粉应该不含有抑菌剂。
4 仪器及玻璃器皿微生物实验室常用仪器，制备和稀释样品所用仪器以及：4.1 培养箱，可以调节并保持到6.5±0.5℃4.2 pH计，带温度补偿，精度为0.14.3 水浴，可以保持到46±1℃4.4 三角瓶，250—300ml，带合适的塞子。
嗜冷菌对牛乳货架期的影响
嗜冷菌对牛乳货架期的影响
岳喜庆;黄威
【期刊名称】《中国乳品工业》
【年(卷),期】2010(038)005
【摘要】采用Azocasein法和碱式滴定法对嗜冷菌产蛋白酶和脂肪酶的活力进行了测定.研究了嗜冷菌在原料乳中的生长规律.结果表明,嗜冷菌产蛋白酶和脂肪酶的最佳pH值为7.0,最适培养温度在30℃,产酶高峰分别出现在30 h和24 h,在最适培养条件下嗜冷菌数的动态增加与蛋白酶和脂肪酶活力变化趋势大致相同.原料乳在低温贮藏过程中,嗜冷菌数与蛋白质、脂肪、水分、密度、pH值也存在有数学相关性.
【总页数】3页(P13-15)
【作者】岳喜庆;黄威
【作者单位】沈阳农业大学食品学院,沈阳110161;沈阳农业大学食品学院,沈阳110161
【正文语种】中文
【中图分类】TS252.2+6
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牛乳中产耐高温蛋白酶嗜冷菌的分离及鉴定研究
牛乳中产耐高温蛋白酶嗜冷菌的分离及鉴定研究刘敏;曹志军;母智深;李艳梅【期刊名称】《食品科学》【年(卷),期】2009(030)005【摘要】本实验采用单一性底物甲板分离法和Folin法,通过观察蛋白酶水解圈大小和测定该酶活力,从牛乳中共获得10株产耐高温蛋白酶的嗜冷菌.对菌体形态、染色反应、培养性状、生理生化性状进行系统研究.鉴定结果表明,上述10个细菌菌株分别属于气单胞菌属(Aeromonas)、巴斯德氏菌属(Pasteurella)、黄杆菌属(Flavobacterium)、变形菌属(Proteus)、节杆菌属(Arthrobacter)、短杆菌属(Brevibacterium)、微球菌属(Micrococcus)、片球菌属(Pediococcus)、乳球菌属(Lactococcus)和明串球菌属(Trichococcus).【总页数】3页(P184-186)【作者】刘敏;曹志军;母智深;李艳梅【作者单位】内蒙古农业大学职业技术学院,内蒙古,包头,014109;内蒙古农业大学职业技术学院,内蒙古,包头,014109;内蒙古农业大学职业技术学院,内蒙古,包头,014109;内蒙古农业大学职业技术学院,内蒙古,包头,014109【正文语种】中文【中图分类】Q939.97【相关文献】1.牛乳中产色葡萄球菌的分离与鉴定 [J], 费育超;倪宏波2.1株酸浆豆腐中产蛋白酶菌种的分离与鉴定 [J], 李笑梅;涂婧;王嘉琪;石彦国3.原料乳中产耐高温蛋白酶菌株的筛选与鉴定 [J], 母智深;白英4.青海牧区57份自制牦牛乳制品中产EPS乳酸菌的分离鉴定及特性研究 [J], 唐超群;永胜;朱徳锐;刘静;双杰5.UHT乳中产耐高温脂肪酶嗜冷菌的研究 [J], 刘敏;曹志军;焦艳芬;赵改梅因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
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牛乳中嗜冷菌的危害牛乳中嗜冷菌的检测方
法-养牛技术
嗜冷菌在-15—20℃之间最宜生长，其在保存过程中产生的大量胞外耐高温的脂肪酶和蛋白酶会分解脂肪和蛋白质，所以在高温杀菌后仍有残留，从而造成牛奶腐败变质。
为避免鲜牛乳发生变质,一般从收集到加工过程中都采取冷藏,但此时往往会导致乳中嗜冷菌占具主导地位,而其产生的耐热性酶类是主要造成鲜牛乳以及乳制品质量变差的一个主要原因.检测牛乳中细菌总数一般在37℃温度下进行48h培养,但该条件下嗜冷菌不会生长,从而往往被忽视,应加强检测。
下面就具体来了解一下：牛乳中嗜冷菌的危害牛乳中嗜冷菌的检测方法。
1、来源鲜牛乳中的嗜冷菌具有比较广泛的来源，且可分成较多类型的菌株，其中数量较多的是微球菌、假单胞菌以及产碱杆菌。
微球菌分布比较广泛，主要存在于动物体表、空气、水源以及、设备上；假单胞菌属主要在海水、淡水、土壤以及多种植物体内存在；产碱杆菌主要在饲料、水源以及粪便中存在。
在污染嗜冷菌的途径中，主要是通过接触个人，如药浴杯污染、挤奶工双手不卫生、水清洗乳头污染、贮存及运输设备不干净或没有严格消毒等，都容易导致嗜冷菌含量过高。
2、危害鲜牛乳中主要为兼性嗜冷菌，产碱杆菌属、假单胞菌属、克雷伯氏杆菌属、黄杆菌属以及无色杆属等，是目前经常能够分离到的嗜冷菌。
通过对以上菌株进行特性分析，发现其都会影响鲜牛乳的保存。
例如，假单胞菌具有很强分解蛋白质和脂肪的能力，能够导致脂肪发生分解，从而容易形成脂肪哈败味，还能够使其中的蛋白质发生分解
产生蛋白胨；产碱杆菌，自身无法使牛乳中的糖类发生分解而产酸，但能够生成棕黄色、灰黄色的色素，还能够导致牛乳中含有的有机盐发生分解而生成碳酸盐，从而导致牛乳呈碱性，能够造成乳制品发生黏性变质。
也就是说，嗜冷菌能够使牛乳中的成分被破坏，这主要是由于嗜冷菌能够分泌耐热蛋白酶、脂肪酶而导致蛋白质、脂肪发生分解。
另外，在有氧低温条件下，嗜冷菌能够引起生色反应，如黄色、奶油色、绿色、红色、金色、黑色或者棕褐色等。
另外，嗜冷菌分泌的胞外降解性酶类具有热稳定性，在巴氏杀菌过程中通常不会受到影响，即使经过超高温瞬时(UHT)处理依旧能够保持部分活性，从而析出UHT乳清和乳蛋白凝块。
当牛乳经过UHT处理后储存较长时间，先会产生少量的小凝块，接着不断增大，并会沉在底部，而上部就会有少量的乳清液析出。
同时，乳品会发苦，且在水解过程中产生的氨基酸会导致褐变反应更加严重。
该菌产生的脂肪酶能够使牛乳中的脂肪球发生分解，生成游离的短链脂肪酸，从而导致牛乳酸度变大，造成腐败，且由于存在较多的游离脂肪酸会使脂肪上浮，使乳制品风味变差，形成腐烂味、乳酪味、肥皂味、酵母味或者不洁味等。
此外，嗜冷菌分泌的蛋白酶、脂肪酶还能够导致片式热交换器形成淤塞，很难清洗。
3、检测方法平板检测法。
该法是取适量鲜牛乳样品，经过一定稀释后在琼脂培养基上接种，放于5～6.5℃恒温条件下进行10天培养，然后计数。
或者取鲜牛乳样品置于21℃下进行增菌培养，再使用选择性培养基置于21℃下进行25h培养，最后检测其中G-杆菌用于判断嗜冷菌污染程度。
直接荧光过滤技术(DEFT)。
该法是取适量鲜牛乳，先使
用胰蛋白酶和TritonX-100进行处理，接着进行膜过滤，即可使乳中含有的微生物被留在过滤器上面。
之后使用吖啶橙对滤膜上的细菌进行着染，再使用紫外显微镜观察。
死亡细胞能够被染成绿色荧光，存活下来的细胞能够被染成橘黄色、橘灰色或者橘红色荧光，最后使用仪器对其进行计数。
该法属于一种快速检测的方法，相比于传统的培养计数检测法具有较好的改善，且其与平板检测法的相关性系数能够达到0.91～0.94。
该法优点是操作系统使用简单，通过图像分析仪在紫外显微镜下进行观察计数，每小时能够处理100个以上的样本，可用于较大的检测数量。
另外，整个检测过程所需的时间要明显少于平板检测法，一般在th以内即可获得检测结果，已经在鲜牛乳中细菌的计数方面得到普遍的应用。
该法的缺点是无法特异性识别嗜冷菌，只能够检测出冷藏鲜牛乳中细菌的总数，没有针对性。
另外，如检测鲜牛乳样品中含有较少的细菌时，检测样品还需要提前进行预培养处理，促使目标微生物的数量增加，以确保检测结果的精确度提高。
尽管检测时间非常短，但预培养需要较长的时间，通常需要24～48 h或者更久，因此在预培养阶段会相对增加耗时。
此外，该检测方法要求使用的仪器价格较贵，且需要较高的检测成本，较难在实际工业生产中推广应用。
实时定量PCR(RQ-PCR)。
该法是在普通PCR体系中添加适量的荧光染料或者荧光探针，从而对PCR反应过程进行实时监测以及同步分析荧光信号的累加，进而克服传统PCR只能够根据凝胶电泳进行定性判断的缺点。
目前，该法趋于节约更多时间和检测成本，并在单一反应中实现复合PCR扩增的方向研究。
该法的实现奠定同步检测
鲜牛乳样品中多种优势嗜冷菌属的基础，相比于单一菌属的测定能够更准确的反映嗜冷菌总数。
但是该法不能够区分样品中存在的DNA是来自死细胞还是活细胞。
现在解决该缺陷的方法是在提取DNA和进行扩增前先添加一种染料，此时染料PMA或者EMA只能侵入死细胞，使DNA结构和细胞完整性被破坏，从而使死细胞中的DNA无法扩增。