发酵豆粕脲酶活性、胰蛋白酶抑制因子、凝集素和大豆抗原的测定研(精)
豆粕脲酶活性相关资料
尿素酶活性与抗胰蛋白酶之间关系，Wright(1981)
脲酶活性测定的局限性
局限性
尿酶活性没有负值，它对任何过熟豆粕的最低值为零；对于 加热过度的豆粕尿酶测定值不是一个可靠的指标 。
解决办法：
利用蛋白质溶解度去评价。原理是：加热使游离氨基酸与其 它化合物的基团形成不能为消化酶所打开的分子间和分子内 的结合键，因而降低了蛋白质的溶解度 。一般要求蛋白质溶 解度（0.2%KOH溶液）应在70%～85%之间。PS＞85% 时，表示加热不足，PS＜70%时则表示加热过度
PH增值法（续）
操作方法
准确称取0.400g样品2份，分别置于两支比色管中，一只比 色管中加入20ml磷酸缓冲液，作为空白试验（A管），另一 只比色管中加入20ml尿素缓冲液（B管）。盖塞混匀，在 30℃恒温水浴中准确保持30min。在此期间，每隔5min摇 匀一次。取出后立即加入饱和氯化汞溶液2～3滴，在冷水中 冷却，5min内测定溶液的PH值。
另取比色管做空白试验，加入10ml尿素缓冲液，10ml0.1 mol/l盐酸。称取与上述试样量相当的试样，迅速加入比色管中，
立即盖好比色管并剧烈摇动，在30±0.5℃恒温水浴上准确保 持30min，冷却到20℃，将比色管内容物全部转入烧杯，用 水冲洗比色管2～3次，用标准氢氧化钠溶液滴定至PH＝4.7。
滴定法（续）
仪器与器皿 pH计 恒温水浴 比色管 10ml移液管
滴定法（续）
试剂
尿素：分析纯 尿素缓冲液：4.45g磷氢二钠和3.40g磷酸二氢钾溶于水并
稀释至1000ml，再将30g尿素溶于此缓冲液中。 0.1mol/l盐酸 0.1mol/l氢氧化钠标准溶液
标定方法：取基准邻苯二甲酸氢钾0.6g，溶于50ml水中，加 热至沸，加入2～3滴酚酞指示剂，用配制的氢氧化钠标准溶液 滴定至呈粉红色30s不退色为终点。以下列公式计算浓度：
发酵豆粕资料
发酵豆粕1、外观物性：外观呈淡黄色粉状，味微酸，具有饼粕发酵物之香味。
2、常规指标•粗蛋白Crude Protein≥50%•无氮抽出物 Non-nitrogen extrout≥25%•粗灰份Crude Ash ≤7%•粗纤维Crude Fiber≤5%•水分Moisture≤10%•粗脂肪Crude Fat≤3.0%3、消化率（DCP）：≥95%4、乳酸含量：≥30mg/g PH：5.2±02氨基酸含量％氨基酸含量％天门冬氨酸Asp 6.11 蛋氨酸Met 0.78 苏氨酸Thr 2.14 异亮氨酸IIe 2.42 丝氨酸Ser 2.61 亮氨酸 Leu 4.02 谷氨酸Glu 9.98 酪氨酸Tyr 1.91 脯氨酸Pro 2.58 苯丙氨酸Phe 2.70 甘氨酸Gly 2.36 赖氨酸Lys 3.28 缬氨酸Val 2.52 组氨酸His 1.40 丙氨酸Ala 2.51 精氨酸Arg 3.60 以上氨基酸总量：50.92河北职业技术学院检测检验中心（沧州）氨基酸检验报告仪器型号：日立L-8800高速氨基酸分析仪分析：审核：制表：检验日期：发酵豆粕营养指标主要营养指标粗蛋白≥45-60% 、粗脂肪≤3.0％、粗纤维≤5.0％、粗灰份≤7.0％、总钙 0.53％、总磷 8.50％、有效磷 7.40％、无氮浸出物≤28.0％、水份≤10％、乳酸≥3％、益生菌≥108cfu/g 、钾 22000mg/kg、镁5094.7mg/kg、铜16.2mg/kg 钠242.2mg/kg铁168.8mg/kg 锌213.4mg/kg 锰21.8mg/kg猪消化能(DE) 3985kcal/kg 猪代谢能(ME) 3600kcal/kg 猪净能(NE) 2305kcal/kg禽代谢能(ME) 2575kcal/kg 肉牛消化能3520kcal/kg 奶牛净能1090kcal/kg羊消化能3520kcal/kg 总能4350kcal/kg氨基酸分析氨基酸含量（%）氨基酸含量（%）氨基酸含量（%）天门冬氨酸Asp 5.40%赖氨酸Lys 3.05% 蛋氨酸Met 0.65% 胱氨酸Cys 0.46% 苏氨酸Thr 2.05%亮氨酸Leu 3.78% 精氨酸Arg 3.50%甘氨酸Gly 2.14% 丝氨酸Ser 2.48%异亮氨酸Ile 2.21% 苯丙氨酸Phe 2.40%缬氨酸Val 2.35% 组氨酸Hi 1.25%谷氨酸Glu 9.80% 丙氨酸Ala 2.24% 脯氨酸Pro 2.08%色氨酸 Trp 0.56%酪氨酸 1.20%抗营养因子比较抗营养因子大豆蛋白发酵豆粕抗营养因子大豆蛋白发酵豆粕胰蛋白酶抑制因子10-60mg/g —大豆抗原100 —植酸 1.00% —大豆球蛋白4% ≤1.5 ppm脲酶活性0.35% —ß－大豆伴球蛋白 2% ≤1 ppm脂肪氧化酶活性100% —凝血素 3% ≤0.5 ppm致甲状腺肿素165.59ppm —寡糖 6% ≤1%与鱼粉的比较指标鱼粉发酵豆粕指标发酵豆粕氨基酸态氮量78%90% 贮存期短长灰份14%≤7.0%抗氧化剂有无生物胺有无化学污染可能无品质易变化稳定病原菌污染可能无。
发酵豆粕各项指标检测方法与标准
发酵豆粕各项指标检测方法与标准发酵工艺2010-12-31 15:16:17 阅读86 评论0 字号：大中小订阅1、水份、粗蛋白、粗脂肪、粗纤维、灰份、钙和磷的分析方法全部采用国标法。
2、总有机酸测定采用氢氧化钠滴定的方法和乳酸测定采用气象色谱。
3、pH的测定采用玻璃电极pHS-3C型pH计测定。
4、可溶蛋白的测定方法5、小肽含量的测定水份的测定水份测定直接参见国标测定完水分后的样品需要测定其中的总有机酸的含量，其数值为A，并计算有机酸的挥发量。
水份含量的计算时应当扣除这部分有机酸的挥发量，否则会出现水分超标现象。
总有机酸检测试剂：NaOH标准溶液（邻苯二甲酸氢钾标定），酚酞指示剂仪器:磁力搅拌器离心机方法：（1）取发酵后鲜样品15g 置于150ml烧杯中加入溶于100ml去离子水，在磁力搅拌器上浸提30min。
（2）取部分浸提样离心10min(3000r/min)。
（3）取上清液15ml, 加30ml去离子水稀释（以消除底色的影响），加酚酞指示剂四滴，用0.1molNaOH 标准溶液滴定，并记录到终点消耗NaOH体积。
（终点到溶液呈现粉红）计算乳酸（％）＝N(NaOH)×V(NaOH) ×0.09008/15×115/15gN(NaOH):NaOH标准溶液的浓度；V(NaOH) ：消耗NaOH标准溶液体积；0.09008：乳酸的毫克当量。
0.1mol氢氧化钠的配制与标定1、配制：称取9.6g氢氧化钠，溶于100ml水中，摇匀，注入聚乙烯容器中，密闭放置至溶液清亮。
用塑料管虹吸5ml的上清液，注入2000ml无二氧化碳水中(将去离子水煮沸5分后冷却)，摇匀。
2、标定称取0.67g于105~110℃烘至恒重的基准的邻苯二甲酸氢钾，准确至0.0001g，溶于50ml的无二氧化碳水中，加4滴酚酞指示剂（0.1％），用配制好的氢氧化钠溶液滴定至溶液呈粉红色，同时作空白试验。
大豆制品中脲酶活性的测定
制作人：刘力、李亚杰
背景
大豆制品中含有大量抗营养因子，影响到动物的正常生长 发育。其中最主要的是胰蛋白酶抑制因子，不耐热，但在 点击添加标题 生产加工过程中，过度的加热在灭活抗营养因子的同时， 导致蛋白质变性，特别是赖氨酸、精氨酸和胱氨酸等严重 点击添加标题 变性，大大降低了大豆制品的消化率和生物学价值。抗胰 蛋白酶活性是直接反映大豆制品中抗营养因子水平及加热 程度的可靠指标，但由于该法费时、所用试剂昂贵，在生 点击添加标题 产上不适用。而脲酶活性与抗胰蛋白酶活性呈高度正相关， 方法较简便、快速、经济，国内外常用脲酶活性作为检验 点击添加标题 大豆制品加热程度和抗营养因子水平的判断指标。
注意事项
若样品粗脂肪含量高于 点击添加标题 10%，则应先进行不 加热的脱脂处理后，在测定脲酶活性； 点击添加标题 称量样品时，一定要将样品混合均匀，否则 会造成试验误差； 点击添加标题 试样和空白试验同时操作，过程要迅速，防 止时间影响。 点击添加标题
问题
反应时间（30min ）对脲酶活性是否有影响？ 点击添加标题
仪器设备
粉碎机：粉碎时应不生强热，如球 点击添加标题 磨机。
点击添加标题 点击添加标题
点击添加标题
测定步骤
样品中脲酶活性的测定：称取0.2 g（准确至0.0001 g）样品（如果活性很
高，可称取0.05 g试样）玻璃试管中，加10 mL尿素缓冲液，立即盖好试管 盖剧烈振摇后，马上置于30±0.5 ℃水浴锅内，准确计30 min±10 s。取下 点击添加标题 后立即加入10 mL盐酸（0.1 mol/L），振摇后迅速冷却至20℃，将试管内容 物全部转入50 mL烧杯中，用20 mL蒸馏水冲洗数次，以0.1 mL的氢氧化钠 标准滴定溶液用酸度计滴定至 pH 4.70。记录氢氧化钠标准滴定溶液消耗量。 点击添加标题 如果选用指示剂，试管中内容物全部移入250 mL锥形瓶中，滴加8~10滴混 合指示剂，以0.1 mol/L氢氧化钠标准滴定溶液滴定至蓝绿色，记录氢氧化 点击添加标题 钠滴定溶液消耗量。 空白测定：称取样品后立即加入10 mL盐酸溶液，之后不加。
大豆中脲酶活性的测定
e.结果计算
UA＝14×C(V0-V)/(30×m) C——氢氧化钾标准溶液浓度， mol/L； V0——空白试验消耗氢氧化钾的体 积， ml； V——测定试验消耗的氢氧化钾的 体 积，ml； m——试验质量，g。
比色法
原理：向含有EDTA二钠盐的PH=7的缓 冲液的分析悬浮液中加入尿素溶液，在 30℃下保温5min，加入磷钨酸终止酶作 用并沉淀蛋白质。产生的氨在次溴酸钠和 麝香草酚作用下形成蓝色的靛麝香草酚， 借以比色。
大豆饼粕中脲酶活性的测定
豆粕的蛋白质含量为45%左右，是一 种优质的蛋白质饲料，但是由于其中的抗 营养因子较多，极大的限制了豆粕在饲料 中的应用。
大豆中的抗营养因子
胰蛋白酶抑制剂 植物红细胞凝集素 皂甙 胃肠胀气因子 植酸 抗维生素 致甲状腺肿因子
这些抗营养因子大多是不耐热的，
在大豆饼粕的加工过程中由于加热而失 活，从而降低或者失去其有害作用 ，因 此，在大豆加工生产饲用饼粕时，必须 对大豆粕进行充分而又适当的加热，这 样才能使其中的抗营养因子失活 。
评价大豆饼粕的指标
脲酶活性： 检测豆粕的加热程度是否足以 破坏其中的抗营养因子的指标。 蛋白质溶解度：反映豆粕是否加热过度的 一个指标。
快速测定方法2
在培养皿上放入少量的豆饼粕，在样品上 滴入少量指示剂并搅拌，将其平铺于培养皿中， 放置5min后观察结果。 无任何红点出现，再放置25min仍然无红点出 现，说明豆粕过熟； 有少量红点出现，说明脲酶活性较低，豆粕可 用； 样品表面有25％被红点覆盖，豆粕可用； 样品表面有50％被红点覆盖，应慎用； 样品表面有75％－100％被红点覆盖，脲酶活 性过高，豆粕过生，不可用；
大豆中的抗营养因子?胰蛋白酶抑制剂?植物红细胞凝集素?皂甙?胃肠胀气因子?植酸?抗维生素?致甲状腺肿因子这些抗营养因子大多是不耐热的在大豆饼粕的加工过程中由于加热而失活从而降低或者失去其有害作用因这些抗营养因子大多是不耐热的在大豆饼粕的加工过程中由于加热而失活从而降低或者失去其有害作用因此在大豆加工生产饲用饼粕时必须此在大豆加工生产饲用饼粕时必须对大豆粕进行充分而又适当的加热这样才能使其中的抗营养因子失活
发酵豆粕脲酶活性、胰蛋白酶抑制因子、凝集素和大豆抗原的测定研(精)
发酵豆粕脲酶活性、胰蛋白酶抑制因子、凝集素和大豆抗原的测定研究彭辉才1粱明振1’张宏福2(1广西大学动物科技学院,广西南宁530005;2北京畜牧兽医研究所营养学国家重点实验室, 北京海淀区100094摘要:豆粕中最主要的抗营养因子是胰蛋白酶抑制因子、凝集素和大豆抗原;本试验对8种发酵豆粕进行测定,前两者含量极低未检出。
用SDS-PAGE凝胶电泳定性检测大豆抗原中的B一伴大豆球蛋白(B--Conglycinin和大豆球蛋白(Glycinin,6种条带模糊,抗原消失,结果表明,生物发酵是一种有效的钝化抗营养因子的方法。
关健词:胰蛋白酶抑制因子凝集素13一伴大豆球蛋白大豆球蛋白测定发酵豆粕指是通过现代生物发酵技术对原料豆粕进行发酵处理后的产物。
发酵过程中可产生蛋白酶、非淀粉多糖酶和植酸酶等多种酶活,其目的就是消除抗营养因子,把大分子量的大豆蛋白质分解为多肽、寡肽、小肽,从而增加水溶性,提高消化率,利于动物消化吸收。
这些酶把纤维类物质分解为糖,部分糖被转化为乳酸,并产生大量有益微生物,使豆粕转化成高营养价值的功能性饲料。
发酵豆柏可替代日粮中血浆蛋白粉、鱼粉、肠膜蛋白和乳清粉等动物性饲料原料,可替代日粮中控制腹泻的预防性抗生素,大大降低生产成本,减少畜禽养殖对动物性饲料原料的依赖,杜绝动物性饲料原料所带来的疾病传播,提高养殖业的安全与效益。
大豆的抗营养因子有蛋白酶抑制因子(protease inhibitors,大豆凝集素(SBA、大豆抗原、非淀粉多糖(NSP、植酸(phytic acid、单宁、大豆寡糖、脲酶、.大豆异黄酮、大豆皂甙、致甲状腺肿因子、生氰糖甙等。
这些抗营养因子会导致人和动物胰腺肿大、过敏反应、生长缓慢、日粮养分利用率下降以及其他一些不良生理反应。
本试验测定起主要抗营养作用的胰蛋白酶抑制因子、凝集素及大豆抗原中的大豆球蛋白和B一伴大豆球蛋白。
1材料与方法1.1腮酶的测定脲酶活性测定参照国标GB8622--88执行。
豆制品中胰蛋白酶抑制剂活性测定方法研究 (2)
收稿日期 :2005 - 11 - 03 ;修回日期 :2005 - 12 - 09
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一个胰蛋白酶单位 (AU) ,是 10ml 反映溶液在 本文叙述的条件下 ,于 410nm 处测得反映前后所增 加 0. 01 光密度为 1 单位 (Absorbance Unit) ,胰蛋白酶 抑制剂活力用胰蛋白酶抑制剂单位 ( TLU) 表示 。 2 结果计算
用 TLUΠml 对分析所用提取液体积 (ml) 做标准 曲线 ,并外推到零 。每克样品的 TLU 值 = 延伸值 × 稀释倍数 ,当用分析的提取液的 TLUΠml 对分析液体 积做图并不是直线关系时 ,则计算出每单位体积提 取液中 TLU 平均值 ,则 TLUΠg 样品 = 平均值 ×稀释 倍数 , 测出常见豆制品结果见附图 。
王英男1 ,修建成2 ,富校轶1 ,李家栋1
(1. 国家大豆工程技术研究中心 ,哈尔滨 150050 2. 哈药总厂哈尔滨康铃科技开发有限责任公司 ,哈尔滨 150086)
摘要 :利用紫外分光光度计 ,对豆制品中胰蛋白酶抑制剂在抑制牛胰蛋白酶活性反应前后的吸光 值差异制作差值曲线 ,从而得出斜率与抑制剂活性之间关系的方法 。并通过反复的实验对比 ,最 终可以快速准确地测定大豆制品中胰蛋白酶抑制剂活性 。 关键词 :豆制品 ;胰蛋白酶抑制剂活性 ;测定方法
Measurement of Trypsin Inhibitor Activities in Soybean Product Wang Yingnan1 ,Xiu Jiancheng2 ,Fu Xiaoyi1 ,Li Jiadong1
质检豆粕总结(3篇)
质检豆粕总结第1篇豆粕中存在着许多抗营养因子，如胰蛋白酶_、低聚糖、大豆凝血素、植酸、脲酶、大豆抗原蛋白(致敏因子)及致甲状腺肿素等，这些抗营养因子不仅影响饲料的适口性，还会影响饲料的营养价值和动物的物质消化吸收以及体内的一些生理过程，严重影响了动物的健康和生产性能。
通常检测豆粕品质的方法有以下几种：1.尿素酶活性(UA)测定法UA测定法是用于测定大豆中脲酶活性的方法，也是测定豆粕中胰蛋白酶_的间接方法，是评定大豆粕的加工程度是否适当及营养品质优劣的传统方法。
将粉碎的大豆粕与中性尿素缓冲溶液混合，在30±℃温度下保持30min，尿素酶催化尿素水解产生氨，在中性条件下用过量的盐酸中和氨，再用氢氧化钠回滴，计算出每分钟每克大豆粕释放氨态氮的毫克数来表示尿素酶的活性(UA)。
通常认为豆粕中脲酶活性越低，豆粕的营养价值就越高，但如果加热过度又会引起氨基酸的被破坏。
2.蛋白溶解度(PS)测定法此方法被认为是一项优于UA测定方法的评估大豆加工过度与加工不足的最佳方法。
方法主要是用氢氧化钾溶解豆粕，测定其中的蛋白含量占未用氢氧化钾处理的豆粕中的蛋白含量的百分比，来表示蛋白溶解度。
其原理是：加热使游离氨基酸与其他化合物的基团形成不能为消化酶所打开的分子间和分子内的结合键，因而降低了蛋白质的溶解。
一般情况下蛋白溶解度低于70%的豆粕营养价值已受到破坏，低于65%几乎可以肯定豆粕加热过度，严重过熟，致使蛋白的消化利用率会非常低。
近年来由于加工技术的改进，PS有增高的趋势。
有研究表明，豆粕蛋白在氢氧化钾溶液中的溶解度和脲酶活性呈正相关。
3.营养成分检测评定根据我国国家标准GB/T19541-2004，饲料用大豆粕的质量标准及分级标准主要以粗蛋白、粗纤维、粗灰分为质量指标，按含量分为三级。
三级大豆粕质量指标必须全部符合相应等级规定，二级饲用大豆粕为中等质量指标，低于三级者为等外品。
测定豆粕各项营养成分是评定豆粕营养价值的重要方法。
发酵豆粕的研究与应用
发酵豆粕的研究与应用[提要] 豆粕是饲料工业中常用的一种优质植物蛋白原料，其营养丰富，蛋白质含量高，氨基酸组成比例合理，但是豆粕中存在多种抗营养因子，降低了畜禽对其营养的吸收和利用。
用微生物发酵的方式处理豆粕，不仅可以有效去除豆粕中的抗营养因子，还能够将豆粕的蛋白质降解成小肽，更利于消化吸收，同时还能够产生有益的微生物代谢产物，大大提高了豆粕的营养价值。
本文从豆粕营养价值、发酵豆粕特点、发酵豆粕的应用等方面进行阐述。
关键词：发酵豆粕；抗营养因子；营养价值一、豆粕的营养特点豆粕是大豆榨油之后的副产品，一般其粗蛋白含量在43%～48%之间，含有人体所必需的8种氨基酸，尤其是赖氨酸的含量比较高，其含量约为2.5%～2.8%。
目前豆粕在饲料工业和畜牧养殖上有广泛的应用。
与棉粕、菜粕、花生粕相比，豆粕具有氨基酸含量平衡、消化率高、适口性好等特点；与动物来源蛋白（如鱼粉、骨肉粉、血浆蛋白粉等）相比，豆粕具有货源充足、不易被病原菌污染或氧化腐败，含毒害物质概率低、安全系数高等特点。
所以豆粕是一种优良的植物性蛋白饲料源。
（一）豆粕中的抗营养因子。
豆粕虽然营养价值很高，但是豆粕中还存在着许多抗营养因子。
这些抗营养因子会影响动物对豆粕营养成分的消化。
在豆粕中主要有胰蛋白酶抑制剂、植酸、大豆凝血素、脲酶、低聚糖、脂肪氧化酶、大豆抗原蛋白及致甲状腺肿素等多种抗营养因子。
它们的存在，一方面对动物体内某些消化酶起抑制作用或与营养物质络合成不易消化的成分等，使得豆粕的消化率和动物的吸收率下降；另一方面对动物体内的某些器官起到破坏作用，对动物的生理、生长、健康造成不良的影响。
豆粕中常见抗营养因子有以下几类：1、胰蛋白酶抑制因子（TI）。
这是大豆中的主要蛋白类抗营养因子。
胰蛋白酶抑制剂会造成动物出现消化吸收功能紊乱，抑制鸡、猪等畜禽的生长、抑制动物体内胰蛋白酶活性，刺激胰腺大量分泌胰蛋白酶，引起胰腺的肿大。
2、植酸。
能在肠胃中与多种二价阳离子结合，形成难溶性的植酸盐络合物，大大降低了动物对微量矿物质的吸收与消化，会使动物出现矿物质缺乏症状，如厌食、消瘦、生长迟缓和脱毛等。
发酵豆粕质量鉴定
发酵豆粕教槽料是指猪出生5天后开始补料时至断奶后10 天内所使用的饲料。
在这期间乳猪的营养生理特点是：消化系统发育不完善，大部分消化酶的活性低，对植物性蛋白和淀粉的消化率低，主要依靠母乳的营养。
为达到提早...教槽料是指猪出生5 天后开始补料时至断奶后10 天内所使用的饲料。
在这期间乳猪的营养生理特点是：消化系统发育不完善，大部分消化酶的活性低，对植物性蛋白和淀粉的消化率低，主要依靠母乳的营养。
为达到提早乳猪猪诱食的目的，又能够克服乳猪断奶营养应激的效果，营养全面、适口性好、消化利用率高和降低腹泻的高品质的乳猪教槽料一直是科研人员研究的热点。
乳猪出生时胃内仅有凝乳酶，胃蛋白酶很少，由于胃底腺部缺乏游离盐酸，胃蛋白酶没有活性，不能很好地消化蛋白质，特别是植物性蛋白质。
这就要求在蛋白原料选择上，既要考虑原料的营养成分，又要考虑其适口性和乳猪的营养生理特点。
不能仅凭简单的实验室分析和资料的说明，应根据以往的经验和实际生产数据来进行选择。
1 蛋白质原料的选择蛋白质原料的选择应从消化率、氨基酸比例、降解产生小肽的速度、蛋白质含量和成本等多方面考虑。
在乳猪教槽料配方中，常用的蛋白质原料有血浆（球）蛋白粉、高蛋白的乳清粉、鱼粉、膨化大豆（豆粕）、发酵豆粕（大豆）和啤酒（核酸）酵母等等。
植物性蛋白中含有许多抗营养因子。
例如大豆抗原（主要以大豆球蛋白和B -伴大豆球蛋白为主）是一种致敏因子，是导致仔猪营养性腹泻的主要原因。
因此大家一直尽量少用植物蛋白，多选用动物蛋白。
动物性蛋白质也有一定的劣势，价格比较昂贵，一些动物性蛋白加工或储存不当容易携带或滋生病原体，鱼粉容易氧化产生过氧化物、组胺和肌胃糜烂素等，同时还有同源性比较近等生物安全问题。
这些问题常常困扰一些配方师，左右为难，难以取舍。
2 发酵豆粕的特点与优势发酵豆粕是利用现代生物技术将植物蛋白源同微生态技术完美结合在一起，是微生态制剂在饲料中原料化的一个体现。
发酵豆粕采用优质多菌种协同发酵，利用微生物丰富的酶系，将植物大分子蛋白降解为寡肽，并将植物蛋白中的抗营养物质如胰蛋白酶抑制因子、脲酶、血凝素、抗原蛋白等彻底分解，植物细胞壁100%破裂，蛋白质消化率大于95% ，显著改善了适口性和消化率。
微生物发酵豆粕产活性
微生物发酵豆粕产活性大豆肽饲料的研究进展近年来，国内饲用蛋白源短缺、饲料成本增加、利润降低等现状严重制约着我国畜牧业的发展，豆粕因含有丰富的营养成分成为重要的植物蛋白源。
但是，因含有抗营养因子制约了动物对豆粕中营养物质的吸收和利用，为了改善这一状况，利用微生物发酵豆粕产活性大豆肽饲料的研究已成为国内外研究的热点。
文章概括了目前微生物发酵豆粕产活性大豆肽饲料的特点、生产及应用的研究进展。
1豆粕和微生物发酵豆粕面对中国畜牧业和饲料工业发展速度快、规模大的现状，为了减少我国饲料工业对鱼粉等昂贵动物蛋白源的依赖，开发、研制出更廉价易得的蛋白源产品来满足动物对饲料蛋白营养的需要至关重要。
大豆粕中因含有丰富的营养成分成为一种重要的植物蛋白源，豆粕中的大豆蛋白含量在43.0%~55.0%之间，多数为水溶性蛋白，除蛋白质外还含有其他丰富的营养物质，是鱼类和单胃动物良好的日粮蛋白源。
但是，豆粕中因含有的蛋白酶抑制剂(Protease Inhibitors)、脲酶(Urease)、大豆原蛋白(Antigen Protein)、大豆低聚糖(Soybean Oligosaccharides) 、植物凝集素(Soybean Agglutinin，SBA)及植酸(Phytic Acid)等成分，影响了动物机体对豆粕中营养物质的充分利用，不但阻碍了动物肠道对豆粕中营养成分的消化、吸收和利用，而且严重地危害了动物机体的健康生长。
目前，为了有效提高豆粕的蛋白利用率和营养价值，应用微生物发酵技术处理豆粕的研究成为热点。
经研究表明，微生物发酵豆粕不但可以有效地去除豆粕中的植物凝集素、脲酶、蛋白酶抑制剂等抗营养因子，而且能够使抗原蛋白的含量明显降低，同时增加了游离氨基酸、活性大豆肽等营养物质的含量，提高了豆粕的应用价值的同时使饲料具有较好的动物适口性。
微生物发酵豆粕是国内近年来发展起来的，利用微生物发酵技术处理豆粕使其含有高活性大豆肽的一种新型的植物蛋白源饲料，其早在欧洲形成产业化，近年来从台湾省传到大陆后逐渐兴起。
微生物发酵豆粕在动物生产中的应用研究
微生物发酵豆粕在动物生产中的应用研究
周德刚;冯秀燕
【期刊名称】《饲料研究》
【年(卷),期】2009()12
【摘要】1微生物发酵豆粕产生背景 1．1普通豆粕中存在多种抗营养因子豆粕中主要有胰蛋白酶抑制剂、植酸、大豆凝血素、脲酶、低聚糖、脂肪氧化酶、大豆抗原蛋白（致敏因子）及致甲状腺肿素等多种抗营养因子。
根据热稳定性可将其分为2类：热不稳定性抗营养因子和热稳定性抗营养因子。
前者包括，胰蛋白酶抑制因子、植物凝聚素、尿素酶和致甲状腺肿因子；后者包括，植酸盐、胀气因子和过敏因子等。
它们以不同的方式对动物生长产生不同程度的抑制作用。
【总页数】3页(P11-12)
【关键词】发酵豆粕;微生物;动物生产;抗营养因子;胰蛋白酶抑制因子;致甲状腺肿素;大豆抗原蛋白;胰蛋白酶抑制剂
【作者】周德刚;冯秀燕
【作者单位】北京市饲料监察所
【正文语种】中文
【中图分类】S816.7;TS214
【相关文献】
1.发酵豆粕在动物生产中的应用研究 [J], 翁晓辉;王敏;杜红方;史宝军
2.微生物发酵豆粕在养殖生产中的应用研究进展 [J], 高庚渠; 郭杰
3.微生物发酵饲料在反刍动物生产中的应用研究进展 [J], 张硕; 孟庆翔; 吴浩; 周振明
4.发酵豆粕在反刍动物生产中的研究及应用进展 [J], 郁元年;张彬;张佩华;沈维军;万发春;汤少勋;王祚
5.微生物发酵豆粕在动物生产中的研究与应用 [J], 杨耐德
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菌种和发酵条件对豆粕中胰蛋白酶抑制因子、凝集素的影响
３ ６ － ０ ４０ ９． ４ Ｉ ． － ３ ２８－ ０ ３８ ９． Ｉ ． － ３ ４４－ ０ ０ ９． － Ｉ ．２ ３ ５８－ ０ ４ ９． Ｉ ．５ －
豆粕 ， 以筛选 出去除 豆粕 主要抗 营养 因子 效果 较好 的优 良
微生 物 ， 为更好 的开 发利 用豆粕 这种 优质 植物 蛋 白源 提供 进一 步 的参 考依 据 。
初 步发 酵 条件 。
关键词 ： 豆粕 ； 枯草 芽孢 杆菌 ； 植物乳酸 菌； 发酵 ； 营养 因子 抗
中图分类号 Ｑ ５ ５６ 文献标识码 Ａ 文章编号 １０ ７ ３ （ ０８ １ ３ —０ ０ ７— ７ １ ２ ０ ） ３— １ ２
豆粕 是大 豆经浸 提脱 油后 的碎 片状或 粗粉 状 副产 品 ，
中胰 蛋 白酶 抑 制 因子 （ Ｉ 、 集 素 在 发 酵 前 后 的 变化 ， Ｔ）凝 筛选 出可 用 于豆 粕 发 酵 的优 良微 生 物 菌 种 ， 就 其 发 酵 条件 进 并
行初 步的研 究。研 究结果表明 ， 胰蛋 白酶抑 制 因子 和凝 集素的去 除率 分别达 到 ６ ％ 、 ０ ， 中以枯 草 芽孢杆 菌为 ０ ９％ 其 降解胰蛋 白酶因子的优 势菌 ， 植物乳酸 菌为降解凝 集素的优 势茵 ， 以 ９ 且 ％接 种量 ， 料水 比 １ １ 发 酵 ４ ｈ为较 适宜的 ：， ８
高， 且工 艺相对 复杂 。综 上本研 究 旨在通 过单 菌 发酵 处理
接种量 ３ ％ ２ ． ３－２ ８ ａ １９ Ｉ ． １ ２ ．９－ ． ８ ０ ２ ｔ ． ２ ２ ．９－３６ ａ ５ ６ Ｉ ２ － － ５ 接种量 ６ ％ １ ４－２９ ｂ １ ９－３ １ａ ２． ２－ ．５ ８ ８ ｅ ． ４ ２ ２ Ｉ ． ３ ５０ Ｉ ４ － － ５ 接种量 ９ ％ １．６－２ ８ ｂ ０ ２ Ｉ ．０ ２ ．２－３６ ８ ４ ｅ ．０ ２． ０－２８ ｂ ５ ０ Ｉ ． ９ － － 料 水 比 １０ ８ １． ８－２ ９ ａ ２ ０ Ｉ ．６ ２． ８－ ．５ ：． ９ ４ ｅ ．６ ２ ３－３ １ａ ９ ７ Ｉ １ － － ２
如何评判和检测发酵豆粕的质量-
如何评判和检测发酵豆粕的质量?利用现代生物技术将豆粕转化为优质蛋白质饲料原料，是国际研究开发热点，产品问世不到十年，技术和产业化水平在国际上以丹麦最为突出。
我国在这方面的研究始于上世纪九十年代末，目前国内仍处于大规模产业化的初期，已有近百家企业生产发酵豆粕，但品质参差不齐，加之许多生产厂家片面宣传、有意或无意误导，使该类产品在市场上造成很大的混乱，用户无所适从。
如何评判和检测发酵豆粕的质量成为各饲料厂家，甚至有些发酵豆粕厂家(小厂)的一大难题。
1、豆粕发酵的目的明确豆粕发酵的目的，才能够确定评判发酵豆粕质量的主要指标。
豆粕经过发酵其主要目的有以下四个方面：1.1破坏豆粕中抗营养因子豆粕中含有胰蛋白酶抑制因子、低聚糖、凝集素、植酸、脲酶等抗营养因子，发酵过程中通过微生物、酶及发酵产生的有机酸的作用，使得抗营养因子被降解或者钝化，从而得到破坏。
1.2消除豆粕蛋白的抗原性豆粕中含有的 7S 和 11S 蛋白具有很强的抗原性，幼龄动物对其尤为敏感。
在发酵过程中，主要是通过将其降解而使其失去抗原性。
1.3降解大分子蛋白质豆粕中 11S 和 7S 蛋白分子量分别为 350KD 和180KD，通过发酵酶解，被降解为氨基酸及各种多肽，有利于动物的吸收利用。
1.4形成各种有益发酵产物目前豆粕发酵均采用枯草芽孢杆菌、酵母菌和乳酸菌等安全菌株，产品发酵后往往含有较高数量的有益菌和有机酸、蛋白酶等代谢产物。
2、发酵豆粕评判程序对发酵豆粕的评判，可以按四个步骤进行，需要检测的指标如下：2.1感官评判包括色泽、气味、细度。
豆粕经过发酵、干燥后颜色变深，优质的发酵豆粕皆为棕黄色或浅黄褐色。
如果颜色浅而与豆粕一致，有可能发酵程度不够或掺入其他浅色蛋白原料;如果颜色过深(如深褐色)，则表明干燥过度，发生美拉德反应。
发酵豆粕的气味根据菌种和生产工艺的不同，也略有差异，但均应无豆腥味和霉味。
一般为酸香味(较浓郁)，酸味较浓的产品是以乳酸菌发酵为主，该类产品损耗低、成本低、有机酸含量较高、诱食效果较好，可部分降解抗营养因子、粗蛋白一般可提高4-5%、消化吸收率较高。
全能生物科技发酵豆粕品控与检测
*异黄酮含量判断 A.发酵状况 B.是否参假
大豆中含量：128mg/100g 12种异构体，其中苷元类的染料木素最为稳定
检测方法：三波长243、263、283检测
异黄酮含量
3.50 3.00 2.50
原料
胰蛋白酶抑制因子
優肽100
Y
J
B
大豆球蛋白 400 300 200 100 0
120 100 80 60 40 20
原料 優肽100 Y J B
伴大豆球蛋白
*單位:mg/g
0
原料
優肽100
Y
J
B
特殊分析
•乳酸(提高适口性,抗菌)
•异黄酮(抗氧化,抗应激)
乳酸分析
•总酸检测
•HPLC检测(液相色谱仪) •分光光度计检测(尚开发中)
一般成分分析
水分, CP, PH,灰分,色泽
2013第一季竞品一般成分分析
项目 原料 优肽 100 Y J(BJ) J(M) 10.59 50.46 6.61 5.44 B 7.49 50.2 4.79 4.79
水份 12.19 5.62 8.01 7.42 CP 45.72 50.77 51.06 50.06 灰分 5.54 6.12 9.74 6.65 PH --- 4.70 5.4 5.96
粉碎处理
优肽-100®
管 制 原 因 检 测 设 备
原料质量 与安全
菌种最适 生长条件
菌种最适 生长条件
减少蛋白变性 提高消化率
减少颗粒 粒径大小
产品质量与 安全
NIR, ELISA
活性发酵豆粕
活性发酵豆粕(生物活性菌体蛋白)介绍第一部分豆粕为什么要发酵【豆粕发酵的目的】一、破坏豆粕中抗营养因子豆粕中含有胰蛋白酶抑制因子、低聚糖、凝集素、植酸、脲酶等抗营养因子，在发酵过程中通过微生物作用、酶及发酵产生有机酸的作用，使得抗营养因子被降解或者钝化，从而得到破坏。
豆粕中的抗营养因子的危害( 综述)1、胰蛋白酶抑制因子IT ，抑制生长。
大豆中最重要蛋白类抗营养因子，约占大豆蛋白6%，IT 通过对胰蛋白酶的抑制，引起胰腺肥大和增生，甚至产生腺瘤，引起动物生长抑制。
2、大豆凝集素(SBA)，影响消化吸收及免疫抑制: 脱脂豆粕中约含3%，难以完整吸收进入血液，引起红细胞凝集，在消化道中损坏小肠壁粘膜结构，影响多种酶的分泌，对肠道的消化和吸收功能有严重的抑制作用，凝集素也对动物的免疫系统产生不良影响，抑制动物生长。
3、低聚糖，胃肠胀气因子: 豆粕富含棉子糖与水苏糖等低聚糖，人和动物不能消化这些低聚糖，结果它们进入结肠被细菌发酵产生大量二氧化碳和氢，少量甲烷，从而引起肠道胀气，并导致腹痛、腹泻、肠鸣等。
4、脲酶: 影响蛋白吸收利用，是豆粕类蛋白原料质量重要影响因素。
5、植酸: 与饲料原料中的磷结合,形成难于被动物消化吸收的植酸磷，降低动物对磷的消化吸收。
6、非淀粉多糖(NSP): 是植物细胞壁物质主要成分，难以被单胃动物自身分泌的消化酶水解，能在消化道形成粘性食糜，降低饲料脂肪、淀粉和蛋白等养分营养价值。
7 、酚类化合物: 大豆中酚类化合物如单宁可以与蛋白质如赖氨酸、甲硫氨酸相结合，使蛋白质的利用率降低。
二、消除豆粕蛋白的抗原性豆粕蛋白具有很强的抗原性，在发酵过程中，主要是通过降解而使其失去抗原性。
大量研究表明，豆粕中存在的抗原物质能引起仔猪等幼龄动物的肠道过敏-- 损伤，进而引起腹泻。
已证实，引起断奶仔猪过敏反应的主要抗原是大豆球蛋白和β -- 伴大豆球蛋白。
三、降解大分子蛋白质，形成易吸收的小肽蛋白豆粕中主要组分11S 和7S 是大分子蛋白，分子量分别为350K D 和180K D，通过发酵酶解，被降解为可溶于水的小分子氨基酸及小肽，利于动物的吸收利用。
豆粕抗营养因子及酶解豆粕制备肽的研究进展
豆粕抗营养因子及酶解豆粕制备肽的研究进展赵满琦;陈星;陈志敏;刘国华;郑爱娟【期刊名称】《中国畜牧兽医》【年(卷),期】2024(51)5【摘要】豆粕作为大豆提取豆油过程中产生的副产品,因其蛋白质含量高、氨基酸均衡和营养元素全面而成为中国主要的植物蛋白质饲料原料之一。
然而,豆粕中存在的抗营养因子(如胰蛋白酶抑制剂、脲酶、大豆球蛋白和非淀粉多糖等)会严重阻碍动物对豆粕营养物质的消化吸收。
豆粕肽作为豆粕蛋白质不完全水解的产物,具有转运速度快、载体不易饱和、耗能低、避免氨基酸相互竞争以及多种生物学活性的特点。
因此提高豆粕中肽的含量可以显著提高豆粕的营养价值。
目前以豆粕为原料制备肽的主要方式有化学法、微生物发酵法以及酶解法,相较于前两种制备方法,酶解法对于豆粕中抗营养因子的去除,以及提高豆粕中肽的含量具有更强的特异性。
作者概括了豆粕的营养特点以及影响其营养价值的主要因素,并分析了豆粕中抗营养因子的作用机理。
此外,还对化学法以及微生物发酵法制备肽的优缺点进行了讨论,总结了酶解豆粕制备肽的优势和实际应用效果,并对存在的问题进行了分析。
为酶解法消除豆粕抗营养因子和制备肽提供了参考依据。
【总页数】8页(P1931-1938)【作者】赵满琦;陈星;陈志敏;刘国华;郑爱娟【作者单位】中国农业科学院饲料研究所【正文语种】中文【中图分类】S816【相关文献】1.乳酸菌固态发酵酶解对豆粕、棉籽粕和菜籽粕粗蛋白质、pH、酸度及抗营养因子含量的影响2.豆粕与发酵豆粕中主要营养成分、抗营养因子及体外消化率的比较分析3.内外切蛋白酶连续酶解制备豆粕鲜味肽的研究4.酶制剂体外酶解豆粕中抗营养因子的研究5.酶解豆粕制备鲜味肽外切酶筛选与工艺优化因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
豆粕中尿酶活性测定
豆粕中酶活性测定尿酶(Urease)：生大豆中含不等量尿酶，尿酶本身无营养意义，但是它与抗胰蛋白酶含量接近，而且遇热失活的程度与抗胰蛋白酶相似，因此以尿酶活性用作豆粕加工适宜度的简单估测指标。
但是加工适宜度不仅取决于畜种、年龄和畜禽阶段，也取决于大豆品种及储存状况。
严寒损伤的大豆储存6个月以上，则抗胰蛋白酶含量会增加，但是未受损伤的大豆就没有这种现象。
附录A大豆制品中尿素酶活性测定方法GB/T 8622-1988A.1 适用范围本标准适用于由大豆制得的产品和副产品中尿酶活性的测定。
本法可确认大豆的湿热处理程度。
A.2 定义本标准所指尿素酶活性定义如下：在(30±0.5)℃和pH7的条件下，每分钟每克大豆制品分解尿素所释放的氨态氮的毫克数。
A.3 原理将粉碎的大豆制品与中性尿素缓冲溶液混合，在30℃保持30min，尿素酶催化尿素水解产生氨的反应。
用过量盐酸中和所产生的氨，再用氢氧化钠标准溶液回滴。
A.4 仪器设备A.4.1 样品筛：孔径200mm;A.4.2 酸度计：精度0.02pH，附有磁力搅拌器和滴定装置;A.4.3 恒温水浴：可控温(30±0.5)℃;A.4.4 试管：直径18mm，长150mm，有磨口塞子;A.4.5 精密计时器;A.4.6 粉碎机：粉碎时应不生强热(例如球磨机)A.4.7 分析天平：感量0.0001g;A.4.8 移液管：10mL。
A.5 试剂和溶液A.5.1 尿素：分析纯;A.5.2 磷酸氢二钠：分析纯;A.5.3 磷酸二氢钾：分析纯;A.5.4 尿素缓冲溶液(pH6.9至7.0)：4.45g磷酸氢二钠和3.40g磷酸二氢钾溶于水并稀释至1000mL，再将30g尿素溶在此缓冲溶液中，可保存1个月。
A.5.5 盐酸：分析纯，c(HCL)=0.1mol/L溶液;A.5.6 氢氧化钠：分析纯，c(NaOH)=0.1mol/L标准溶液。
A.6 试样的制备用粉碎机将10g试样粉碎，使之全部通过样品筛。
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发酵豆粕脲酶活性、胰蛋白酶抑制因子、凝集素和大豆抗原的测定研究彭辉才1粱明振1’张宏福2(1广西大学动物科技学院,广西南宁530005;2北京畜牧兽医研究所营养学国家重点实验室, 北京海淀区100094摘要:豆粕中最主要的抗营养因子是胰蛋白酶抑制因子、凝集素和大豆抗原;本试验对8种发酵豆粕进行测定,前两者含量极低未检出。
用SDS-PAGE凝胶电泳定性检测大豆抗原中的B一伴大豆球蛋白(B--Conglycinin和大豆球蛋白(Glycinin,6种条带模糊,抗原消失,结果表明,生物发酵是一种有效的钝化抗营养因子的方法。
关健词:胰蛋白酶抑制因子凝集素13一伴大豆球蛋白大豆球蛋白测定发酵豆粕指是通过现代生物发酵技术对原料豆粕进行发酵处理后的产物。
发酵过程中可产生蛋白酶、非淀粉多糖酶和植酸酶等多种酶活,其目的就是消除抗营养因子,把大分子量的大豆蛋白质分解为多肽、寡肽、小肽,从而增加水溶性,提高消化率,利于动物消化吸收。
这些酶把纤维类物质分解为糖,部分糖被转化为乳酸,并产生大量有益微生物,使豆粕转化成高营养价值的功能性饲料。
发酵豆柏可替代日粮中血浆蛋白粉、鱼粉、肠膜蛋白和乳清粉等动物性饲料原料,可替代日粮中控制腹泻的预防性抗生素,大大降低生产成本,减少畜禽养殖对动物性饲料原料的依赖,杜绝动物性饲料原料所带来的疾病传播,提高养殖业的安全与效益。
大豆的抗营养因子有蛋白酶抑制因子(protease inhibitors,大豆凝集素(SBA、大豆抗原、非淀粉多糖(NSP、植酸(phytic acid、单宁、大豆寡糖、脲酶、.大豆异黄酮、大豆皂甙、致甲状腺肿因子、生氰糖甙等。
这些抗营养因子会导致人和动物胰腺肿大、过敏反应、生长缓慢、日粮养分利用率下降以及其他一些不良生理反应。
本试验测定起主要抗营养作用的胰蛋白酶抑制因子、凝集素及大豆抗原中的大豆球蛋白和B一伴大豆球蛋白。
1材料与方法1.1腮酶的测定脲酶活性测定参照国标GB8622--88执行。
1.2胰蛋白酶抑制因子(TI的测定方法发酵豆粕中胰蛋白酶抑制因子的测定,参照中华人民共和国农业行业标准NY/T1103.2--2006, 转基因植物及其产品食用安全检测抗营养素第2部分:胰蛋白酶抑制剂的测定。
其原理是,胰蛋白酶可作用于底物苯甲酰一L-精氨酸对硝基苯胺(队PA结构中精氨酸与对硝基苯胺的连接键,释放出黄色的对硝基苯胺,该物质在410hm有最大吸收值。
大豆及其产品中的胰蛋白酶抑制剂可抑制这一反应,使吸光度值下降,其下降程度与胰蛋白酶抑制剂活性成正比。
用分光光度法在410hm处测定吸光度值的变化, 可对胰蛋白酶抑制剂活性进行定量分析。
1.3凝集素的测定方法发酵豆粕凝集素的测定,参照戴大章<饲料中植物凝集素的快速检测方法>…中的方法进行,其原理是,凝集素具有凝集兔、人等的红细胞的能力,细胞凝集作用是凝集索与细胞表面的糖分子结合在细胞表面形成许多交叉的“桥”的结果。
凝集活力(效价与凝集素的量成线性关系。
因此,利用凝血反应测定其血凝活力,通过比较标准品与待测样品的血凝活力,可以定量检测凝集素含量。
1.4B一伴大豆球蛋白(B—CongIycinin和大豆球蛋白(Glycinin测定方法B--Conglycinin,目前多数人认为这是相对分子量为180kDa的三聚体,是7S的主要组分,由三个亚基(a 7、0、B组成。
可用SDS-PAGE凝胶电泳使其变性,从而将其单体亚基分开。
大豆球蛋白(Glycinin,是纯化的11S大豆球蛋白,目前认为其是相对分子量为360kDa的六聚体,其单聚体亚基的结构为A-S-S-B,A和B都是酸性多肽,但分子量不同,S-S为二硫键,将A和B连接起来。
B一巯基乙醇(B一脏等还原剂可将Glycinin的亚基和多肽分开幢1。
测定这两者的方法是,用 Tris-HCl提取,然后进行SDS-PAGE凝胶电泳,对照标准蛋白质Marker,定性检验其在发酵豆粕中存在的情况。
1.4.1抗原蛋白抽提称取过60目的发酵豆粕1.OOg,向其中加入20.OmlO.03mol/L的Tris-HCl(pH8.0,包括 0.Olmol/L B一疏基乙醇,在室温下于摇床上(100r/min浸提1h,然后在10000r/min、20℃条件下离心20min后,取上清液。
此上清液为11S与7S的球蛋白混合液。
1.4.2试剂配制丙烯酰胺30%单体贮液:称取丙烯酰胺29.19,甲叉双丙烯酰胺0.99,于250mi烧杯中,向烧杯中加入约80ml灭菌去离子水,充分搅拌溶解,加灭菌去离子水将溶液定容至lOOml,棕色瓶4度冰箱保存。
分离胶缓冲液贮液1.5M Tris-Hcl(pH8.8:称量18.169Tris置于250Inl烧杯中,加入灭菌水约80ml,充分搅拌溶解,用6M盐酸调节pH值至8.8,将溶液定容至lOOml,4度冰箱保存。
浓缩胶缓冲液贮液1.OM Tris-Hcl(pH6.8:称量12.129Tris置于250mi烧杯中,加入约80ml 灭菌水充分搅拌溶解,用6M盐酸调节pH值至6.8,将溶液定容至毫100m1.4度冰箱保存IO%SDS溶液:称量lOg SDS置于200ml烧杯中,加入lOOml灭菌水溶解,室温保存。
10%过硫酸铵:称取lg过硫酸铵,加入9mi去离子水后搅拌溶解,贮存于4度冰箱中。
5*Tris-Glycine Buffer(电极缓冲液:称量下列试剂于1L烧杯中:Tris15.19,Glycine(甘氨酸949,SDS 5.Og;加入约800ml去离子水,搅拌溶解,加去离子水将溶液定容至lL,室温保存。
样品缓冲液(0.踟Tris-Hcl,pH6.8:1.6IIIl浓缩胶缓冲液贮液(1.伽Tris-Hcl,pH6.8,4ml IO%SDS,Iml 8一巯基乙醇,2.5ml甘油,0.19溴酚蓝,转移到20ML容量瓶,加去离子水定容到刻度。
染色液:称取0.59考马斯亮兰P,250,加125mi异丙醇溶解,加50ml冰醋酸搅拌均匀,再加325mi去离子水搅拌,然后用快谜定性滤纸过滤.室温保存。
脱色液:取50ml冰醋酸,25ral无水乙醇,42钿1去离子永,混合均匀,室温保存。
I t3不连墟￥OS-P性黜电泳的浓缩腔和分离腔的材取按下表比例配制分离腔与浓缩胶表l 1羁升高睨和鼹浓缩胶配制144电泳将提取液与样品缓冲液以i:l的比例混台后,在100度水浴锅中煮5min取30u1,点样到制作好的电泳板上。
虽白质Marker的用量参照其说明书.内外均加^一样的电极缓冲{瘦,开始以80V电压电泳,持溴酚蓝条带进入分离脞后,加大电压到120V,溴酚蓝到底部上约050I处结柬电泳。
145染色、脱色和照相将电泳后的胶板移^染液中.在转速为40一60r/rain的摇床上染色2h后,转到脱色液中浸泡过夜,期间更换2--3狄脱色藏,至电林条带清晰为止。
用数码相机拍摄凝胶照片,记录井保存。
2结果与分析2I量■活性8种发酵豆粕的腮薛活性均为0。
22胰蛋白一抑崩囚于和疆墓素用上述方法测定了8种发酵豆粕胰蛋白酶抑制园子及凝集素,古量粮低.均未检出23大豆抗原用8种发酵豆粕和一种普通豆粕.做了电泳,图片如下:其中条带5是普通豆粕,9是蛋白质分子量标准(Marker,其余是发酵豆粕,标准物分子量条带如图标注所示,在一定条件下,蛋白质的分子量与电泳迁移率问的关系,可用下式表示:MW=K(10一hlgl哪=lgK—bnh=KI—bml式中:唧为蛋白质的分子量:K,K。
为常数;b为斜率;咖为相对迁移率测量标准物各条带到加样口的距离,而得到分子量与迁移率的相关方程为:y=一1.3275x+2.5002(r=0.99,从而算出7S和1IS的几个亚基的分子量如下表2,同样也把 Maruyama(1998和李德发(2003所研究的几个亚基的分子量列在表中,用以对照。
表2五个亚基的分子量表从图上可见,1、3、4、6、7、8号样品,几个亚基消失,说明大豆抗原已经完全分解,2号和10号样品,两种抗原的条带清楚,说明抗原存在,发酵不彻底。
3讨论3.1腮酶活性(UA尿酶活性测定值是传统的用以鉴定豆柏加热程度的指标。
尿酶本身无营养意义,但它与胰蛋白酶抑制因子的含量接近,而且遇热变性失活的程度与胰蛋白酶抑制因子相似。
在一定范围内,脲酶活性与胰蛋白酶抑制因子的含量具有强相关性,测定脲酶活性可以间接地反映胰蛋白酶抑制因子的含量。
但尿酶没有负值.它对任何过熟豆粕的最低值均显示为零,而此时胰蛋白酶抑制因子未必为零, 因此测定脲酶活性是不够的,还需要测定胰蛋白酶抑制因子才行。
3.2发酵豆粕胰蛋白酶抑制因子和凝集素含量在一定的范围内,随着大豆中抗营养因子的受热钝化。
大豆的营养价值得到改善。
在大豆抗营养因子中,胰蛋白酶抑制因子、脲酶和大豆凝集素是热敏性抗营养因子,对热比较敏感。
常压蒸汽处理,温度不超过100℃,蒸汽加热30min,胰蛋白酶抑制因子活性可降低90%㈨。
Oin(1996报道, 当生大豆通入蒸汽,120℃加热7.5min时,胰蛋白酶抑制因子的含量可由20.6mg/g下降到3.3mg/g¨1。
秦贵信(1995报道,常压蒸汽102℃,20min,胰蛋白酶抑制因子下降88%,而40min则下降92%, 60min,全部消失哺1。
与胰蛋白酶抑制因子相比,大豆凝集素对高温更为敏感,这是由于大豆凝集素是一种糖蛋白, 具有不可逆转变性特点,较容易失活。
Qin(1996报道¨1,102"C加热20min,大豆凝集素的存留率只有1.4%,当温度提高到。
提高到120℃,只要1.5min就完全失去活性.采用湿热处理,190"C加热 10—60秒就可以完全失活。
于平等(2001m1报道,湿热处理,加热到80℃.凝集素活性无明显变化,7595℃加热25min才开始明显下降,95℃加热35min或120℃加热15min,其活性可以完全丧失。
目前发酵豆粕是用固体发酵方法生产,其生产工艺流程是:豆粕加水拌匀、蒸煮、接种、发酵、后熟干燥、磨粉、包装。
其中蒸煮灭菌是,在常压下、温度100℃左右,进行蒸煮约30min,这可以使绝大部分胰蛋白酶抑制因子和凝集素失去活性。
胰蛋白酶抑制因子本身是一种蛋白质,可以被蛋白酶水解成更简单的多肽,活性随着酶解反应的进行,而逐步丧失。
Laskowski等(1974盯1发现,胰蛋白酶和枯草杆菌蛋白酶能特异性地将KTI水解成多肽,降低其活性。
杨晓泉呻1等(2001研究发现,在一定条件下,碱性内切蛋白酶(alcalase 可同时降解大豆蛋白和胰蛋白酶抑制因子,其中胰蛋白酶抑制因子可被钝化8096。
Huo等旧1(1993用五种来源于细菌和真菌的蛋白酶进行了生大豆(RS和低温膨化全脂大豆粉(LTES中的胰蛋白酶抑制因子和凝集素的体外钝化试验,结果表明,它们都不同程度地钝化抗营养因子,其中一种来源于细菌的蛋白酶分别钝化生大豆中62%的胰蛋白酶抑制因子和91%的糜蛋白酶抑制因子(CIA。