发酵豆粕脲酶活性、胰蛋白酶抑制因子、凝集素和大豆抗原的测定研(精)

发酵豆粕脲酶活性、胰蛋白酶抑制因子、凝集素和大豆抗原的测定研究

彭辉才1粱明振1’张宏福2

(1广西大学动物科技学院,广西南宁530005;2北京畜牧兽医研究所营养学国家重点实验室, 北京海淀区100094

摘要:豆粕中最主要的抗营养因子是胰蛋白酶抑制因子、凝集素和大豆抗原;本试验对8种发酵豆粕进行测定,前两者含量极低未检出。用SDS-PAGE凝胶电泳定性检测大豆抗原中的B一伴大豆球蛋白(B--Conglycinin和大豆球蛋白(Glycinin,6种条带模糊,抗原消失,结果表明,生物发酵是一种有效的钝化抗营养因子的方法。

关健词:胰蛋白酶抑制因子凝集素13一伴大豆球蛋白大豆球蛋白测定

发酵豆粕指是通过现代生物发酵技术对原料豆粕进行发酵处理后的产物。发酵过程中可产生蛋白酶、非淀粉多糖酶和植酸酶等多种酶活,其目的就是消除抗营养因子,把大分子量的大豆蛋白质分解为多肽、寡肽、小肽,从而增加水溶性,提高消化率,利于动物消化吸收。这些酶把纤维类物质分解为糖,部分糖被转化为乳酸,并产生大量有益微生物,使豆粕转化成高营养价值的功能性饲料。发酵豆柏可替代日粮中血浆蛋白粉、鱼粉、肠膜蛋白和乳清粉等动物性饲料原料,可替代日粮中控制腹泻的预防性抗生素,大大降低生产成本,减少畜禽养殖对动物性饲料原料的依赖,杜绝动物性饲料原料所带来的疾病传播,提高养殖业的安全与效益。

大豆的抗营养因子有蛋白酶抑制因子(protease inhibitors,大豆凝集素(SBA、大豆抗原、非淀粉多糖(NSP、植酸(phytic acid、单宁、大豆寡糖、脲酶、.大豆异黄酮、大豆皂甙、致甲状腺肿因子、生氰糖甙等。这些抗营养因子会导致人和动物胰腺肿大、过敏反应、生长缓慢、日粮养分利用率下降以及其他一些不良生理反应。本试验测定起主要抗营养作用的胰蛋白酶抑制因子、凝集素及大豆抗原中的大豆球蛋白和B一伴大豆球蛋白。

1材料与方法

1.1腮酶的测定

脲酶活性测定参照国标GB8622--88执行。

1.2胰蛋白酶抑制因子(TI的测定方法

发酵豆粕中胰蛋白酶抑制因子的测定,参照中华人民共和国农业行业标准

NY/T1103.2--2006, 转基因植物及其产品食用安全检测抗营养素第2部分:胰蛋白酶抑制剂的测定。其原理是,胰蛋白酶可作用于底物苯甲酰一L-精氨酸对硝基苯胺(队PA结构中精氨酸与对硝基苯胺的连接键,释放出黄色的对硝基苯胺,

该物质在410hm有最大吸收值。大豆及其产品中的胰蛋白酶抑制剂可抑制这一反应,使吸光度值下降,其下降程度与胰蛋白酶抑制剂活性成正比。用分光光度法在410hm处测定吸光度值的变化, 可对胰蛋白酶抑制剂活性进行定量分析。

1.3凝集素的测定方法

发酵豆粕凝集素的测定,参照戴大章<饲料中植物凝集素的快速检测方法>…中的方法进行,其原理是,凝集素具有凝集兔、人等的红细胞的能力,细胞凝集作用是凝集索与细胞表面的糖分子结合在细胞表面形成许多交叉的“桥”的结果。凝集活力(效价与凝集素的量成线性关系。因此,利用凝血反应测定其血凝活力,通过比较标准品与待测样品的血凝活力,可以定量检测凝集素含量。 1.4B一伴大豆球蛋白(B—CongIycinin和大豆球蛋白(Glycinin测定方法

B--Conglycinin,目前多数人认为这是相对分子量为180kDa的三聚体,是7S的主要组分,由三个亚基(a 7、0、B组成。可用SDS-PAGE凝胶电泳使其变性,从而将其单体亚基分开。大豆球蛋白(Glycinin,是纯化的11S大豆球蛋白,目前认为其是相对分子量为360kDa的六聚体,其单聚体亚基的结构为A-S-S-B,A和B都是酸性多肽,但分子量不同,S-S为二硫键,将A和B连接起来。 B一巯基乙醇(B一脏等还原剂可将Glycinin的亚基和多肽分开幢1。测定这两者的方法是,用 Tris-HCl提取,然后进行SDS-PAGE凝胶电泳,对照标准蛋白质Marker,定性检验其在发酵豆粕中存在的情况。

1.4.1抗原蛋白抽提

称取过60目的发酵豆粕1.OOg,向其中加入20.OmlO.03mol/L的Tris-

HCl(pH8.0,包括 0.Olmol/L B一疏基乙醇,在室温下于摇床上(100r/min浸提1h,然后在10000r/min、20℃条件下离心20min后,取上清液。此上清液为11S与7S的球蛋白混合液。

1.4.2试剂配制

丙烯酰胺30%单体贮液:称取丙烯酰胺29.19,甲叉双丙烯酰胺0.99,于250mi烧杯中,向烧杯中加入约80ml灭菌去离子水,充分搅拌溶解,加灭菌去离子水将溶液定容至lOOml,棕色瓶4度冰箱保存。

分离胶缓冲液贮液1.5M Tris-Hcl(pH8.8:称量18.169Tris置于250Inl烧杯中,加入灭菌水约80ml,充分搅拌溶解,用6M盐酸调节pH值至8.8,将溶液定容至lOOml,4度冰箱保存。

浓缩胶缓冲液贮液1.OM Tris-Hcl(pH6.8:称量12.129Tris置于250mi烧杯中,加入约80ml 灭菌水充分搅拌溶解,用6M盐酸调节pH值至6.8,将溶液定容至毫

100m1.4度冰箱保存

IO%SDS溶液:称量lOg SDS置于200ml烧杯中,加入lOOml灭菌水溶解,室温保存。

10%过硫酸铵:称取lg过硫酸铵,加入9mi去离子水后搅拌溶解,贮存于4度冰箱中。

5*Tris-Glycine Buffer(电极缓冲液:称量下列试剂于1L烧杯中:Tris

15.19,Glycine(甘氨酸949,SDS 5.Og;加入约800ml去离子水,搅拌溶解,加去离子水将溶液定容至lL,室温保存。

样品缓冲液(0.踟Tris-Hcl,pH6.8:1.6IIIl浓缩胶缓冲液贮液(1.伽Tris-

Hcl,pH6.8,4ml IO%SDS,Iml 8一巯基乙醇,2.5ml甘油,0.19溴酚蓝,转移到20ML容量