人成纤维细胞在微纤维生物膜上的增殖实验研究

人成纤维细胞在微纤维生物膜上的增殖实验研究

摘要

近期Veloderm在临床应用中取得了满意的效果。但其促进创面愈合过程的机理不是很清楚，缺乏实验证据。本研究的目的是通过外植技术来研究在微结晶纤维素（Veloderm）上培养的人成纤维细胞的附着与增殖，测定培养后7、14、21天成纤维细胞的附着与增殖情况。结果显示培养后24小时就有70%的附着率，7天的细胞增殖率为12%，14天为30%，21天为75%。结论：Veloderm微结晶纤维素能支持成纤维细胞的增殖—一个特征明显、作用机理清楚的理想皮肤替代品。

关键词：微纤维生物膜；细胞培养；成纤维细胞；创面

前言

皮肤是人体最大的器官，它的主要功能就是保护机体免受外界干扰。广泛而严重的的皮肤屏障的破坏会触发组织修复机制，这是机体存活最基本的反应。这个复杂的创面愈合过程的最终目的就是促进损伤组织的上皮化。目前最常用的治疗大面积皮肤创面的方法还是取自体皮进行移植，但受到供量不足的限制。对皮肤损伤需进行迅速的覆盖保护促使敷料不断改进与发展，天然材料形成的覆盖物利用残余的上皮细胞来促进表皮的再生复原是发展的方向。真皮替代物治疗严重烧伤和慢性难愈性创面已得到很好的关注，但效果不理想促使进一步去研究更理想的皮肤替代品。广泛的针对新型生物材料的研究显示多聚糖是发展新产品并在临床大量使用的一个有价值的材料来源，像透明质酸、葡聚糖、藻酸盐已经得到广泛研究。在多聚糖中，纤维素是一类很有前景的生物多聚体。由于它的独特的物理与机械特性，纤维素在医学上有大量的应用。最近，微生物纤维素已被用于临床，并获得很高的成功率。虽然其化学结构和植物纤维素相似，但它有一个独特的微纤维结构，可以成为一个良好的基质并营造理想的创面愈合微环境。很多研究充分显示出微生物纤维素在创面愈合过程中是一个很有潜力的影响因子。微纤维生物膜（V eloderm）是通过甘蔗和某些微生物一起发酵制备而成的，它和创面有良好的粘附，阻止细菌的侵袭和减轻疼痛，为肉芽组织生长与上皮再生营造一个理想的微环境。根据文献检索，到目前为止还没有发现有关其在细胞水平上影响创面愈合的研究报道，因此本研究的目的是通过外植技术来测定在微纤维生物膜上培养的人成纤维细胞的附着与增殖率。

材料与方法

人成纤维细胞在微纤维生物膜上的培养与细胞附着与增殖率的评估

细胞被放置在覆盖Veloderm生物膜（HD）的24孔培养板上进行培养，为了测定最佳培养浓度，不同浓度的成纤维细胞放置在HD膜片上进行培养。首先将HD膜片切割成直径1厘米，然后将其放置于24孔培养板的每一孔，不同数量的成纤维细胞被放入孔中进行培养。阴性对照组的成纤维细胞直接在裸孔中进行培养。培养装置在37度下孵化1、7、14、21天。用光学显微镜评估24小时细胞的附着率，7、14、21天用标准方法和程序评估细胞的增殖率。

研究结果

人成纤维细胞在HD膜片上的附着率

在不同细胞浓度的培养孔中，细胞在24小时最大的附着率是5×104细胞浓度孔的70%（图1）

在HD膜片上，细胞密度从边缘到中央逐步增大，大约25-30%细胞仍停留在原位。对照组95%的细胞停留在原位。

人成纤维细胞在HD膜片上的增殖率

5×104细胞浓度孔的细胞增殖率在第7天为12%，14天为30%，21天为75%（图2）

人成纤维细胞在聚苯乙烯标准孔的增殖率

5×104细胞浓度孔的细胞增殖率在第7天为75%，14天为80%，21天为70%（图3）。21天时在HD 膜片上的细胞数量和聚苯乙烯标准孔的细胞数量接近显示出HD生物膜能长时间支持人成纤维细胞的增殖。

讨论

创面愈合是一个涉及许多不同细胞和细胞间基质相互作用与影响的复杂过程。研究显示，创面处理过程主要涉及三个方面：新型皮肤替代物；发展促进组织修复与减少疤痕形成的各种手段；甄别促进真皮与表皮再生的生长因子和信号。本研究集中在第一个方面。

创面封闭需要能恢复表皮屏障的材料，这种材料能粘合在创面，保护创面免于感染和过多的液体丢失及限制肉芽组织生成过多。理想的皮肤替代物必须具备真皮和表皮层的特征，以提供一个持续的作用效果。

目前已有很多用于治疗外科和非外科伤口的生物的或合成的替代物，有一些显示出较好的效果，但寻找更理想的、性价比高的皮肤替代物仍在进行着。

临床使用HD生物膜自1990年开始就有报道，这种材料作为皮肤替代品已用于不同的临床领域，然而，具我们所知，到目前为止，还没有发现有关HD生物膜和皮肤之间在细胞水平上相互作用的研究报道。因此很有必要采取体外研究的方法为这种新型生物材料是如何和人体之间进行相互作用提供科学依据。

本研究表面：人成纤维细胞不仅可附着在HD膜片上，而且HD膜片能比聚苯乙烯表面对成纤维细胞的增殖支持时间更长，表明它在体外能促进伤口快速稳固封闭，虽然体外研究还不能和临床研究相比拟，但可以提示其能用于临床治疗慢性深度伤口（溃疡创面）。

细胞密度在HD膜片上从边缘到中央逐步增大，表明它可以作为成纤维细胞生长的支架，用于真皮层损伤的治疗，鉴于相关文献报道还较少，进一步的研究仍然需要继续进行。

总之，据我们了解，该研究是首次在细胞水平显示HD生物膜与人成纤维细胞之间的相互作用。HD生物膜是一种能促进成纤维细胞增殖的生物材料，他还有很多作为一种理想皮肤替代物的特征，虽然这类研究非常昂贵，但仍需进行很多的这种研究来寻找、发展最佳的作为理想皮肤替代品的生物材料，以满足更好的组织再生、改善愈合面得感觉、弹性和美观度的需求。