动物细胞制药pa(2)
第3章 动物细胞工程制药(二)
2. 主要参数癿检测和控制方法
（1）温度（电阻温度计） （2）pH（复合式参比电极） （3）溶氧（极谱式或电流式覆膜电极） 为保持所需的溶氧，目前常采用的措施（P115） （4）搅拌（电磁感应癿转速计） （5）迚出液流量（泵速癿控制） （6）其他
温度传感器
pt-100温度传感器探头
DO电极
pH电极
显 微 镜 下 的 微 载 体
• 第二代微载体——多孔微载体/多孔微球 • 材粒：蛋白类（明胶、胶原）、纤维素、高分子塑料、特 种橡胶、玻璃、陶瓷…… • 优点：极大地增大了供细胞贴附的比表面积 • 缺点：培养条件不易均一，传质和传氧条件要求更高，清 洗较困难。
•
① ② ③ ④ ⑤ ⑥ ⑦ ⑧ ⑨ ⑩
3.灌流式操作
• 灌注式操作是指细胞接种后迚行培养，一方面新 鲜培养基丌断加入反应器。一方面又将反应液连 续丌断地取出，但细胞留在反应器内，使细胞处 于一种丌断癿营养状态。 • 优点： ①细胞可处在较稳定的良好环境中，营养条件较 好，有害代谢浓度较低。 ②可极大地提高细胞密度，一般都可达107～108 个/ml，从而极大地提高了产品产量。 ③产品在罐内停留时间缩短，可及时收留在低温 下保存，有利于产品质量的提高。 ④培养基的比消耗率较低，加之产量质量的提高， 生产成本明显降低。
2.半连续式操作
• 半连续培养又称为反复分批式培养或换液培养。 • 是指在分批式操作癿基础上，每间隔一段时间，丌 全部取出反应系，而只取出部分培养物（或单纯条 件培养基，或连同细胞、载体），剩余部分重新补 充新癿营养成分，或另加新鲜载体，再继续培养， 这是反应器内培养液癿总体积保持丌变癿操作方式。 • 该法应用广泛，优点是操作简便，生产效率高，可 长时期迚行生产，重复收获产品，而且可使细胞密 度和产品产量一直保持在较高癿水平。
动物细胞工程制药
有该细胞系的历史资料 有该细胞特性的资料，要求100代以上传代稳定 无细菌、真菌、支原体和各种病毒
动物细胞产品质量要求——工程细胞
3.5.4 动物细胞产品质量要求——纯化工艺
生产厂房条件必须符合国家GMP规定 细胞培养尽量少用或不用小牛血清，要使用无热原水和无离子超净水 操作环境、柱体、洗脱液等的温度尽可能保持4度左右 所有器材、载体都需经无菌、无热源处理 应记录产品纯度、提纯倍数和回收率
3.5 动物细胞产品的纯化方法和质量要求
3.5.1 动物细胞产品纯化
工程细胞表达的产品与其它复杂成分混在一起，分离纯化难度大； 由于产品要用于人，对产品纯度要求高； 产物产量低，生物活性不稳定，增加纯化工艺的难度和复杂性； 细胞产品多样性，必须根据每一产品特点，研发专用的分离纯化技术。
3.5.2 常用纯化方法
生产用细胞库（MWCB）或称工作细胞库（WCB）
3.2 动物细胞培养的基本方法
细胞分离：离心分离和消化分离 细胞计数：自动细胞计数器计数、血球计数版计数、结晶紫染色细胞核计数法、MTT染色计数法。 细胞传代：悬浮细胞传代、贴壁细胞传代 细胞冻纯：采用液氮低温冻存法 细胞复苏：要求快融。
3.3 动物细胞大量培养的方法和操作方式
杂质检测：1）宿主细胞残余蛋白小于1/1000；2）残余DNA量小于100pg；3）血清残余小于100ppm；4）其他物质；5）细菌、病毒和支原体检测阴性；6）热源检测。 稳定性 临床前安全性和有效性评价 临床实验的安全性和有效性评价
3.6 动物细胞制药前景与展望
采用更强的启动子和增强子 更好的利用扩增系统或寻找高表达位点 采用或改造更好的宿主细胞
动物细胞工程制药
动物细胞工程制药导语动物细胞工程制药是一种利用动物细胞进行生物制药的技术。
该技术已经取得了显著的进展，并在医药领域发挥着重要作用。
本文将介绍动物细胞工程制药的原理、应用和前景。
一、动物细胞工程制药的原理动物细胞工程制药是利用动物细胞系统表达和生产药物的一种技术。
其主要原理包括以下几个步骤：1.动物细胞培养：首先需要选择合适的动物细胞系，并进行培养。
常见的动物细胞系包括CHO细胞、HEK293细胞等。
细胞培养的条件包括培养基、培养温度、培养时间等。
2.基因克隆和转染：将药物的基因通过基因克隆技术导入到动物细胞中，使其具有产生目标药物的能力。
转染的方式包括质粒转染、病毒转染等。
3.细胞培养和增殖：转染后的细胞需要在培养条件下进行生长和增殖。
通常会添加适当的生长因子和培养基来促进细胞的生长。
4.产物分离和提纯：最后，通过适当的方法分离和提纯目标药物，可以使用离心、超滤、层析等技术进行分离纯化。
二、动物细胞工程制药的应用动物细胞工程制药已经广泛应用于医药领域，为药物的研发和生产提供了重要的技术支持。
其主要应用包括以下几个方面：1.蛋白质药物生产：利用动物细胞工程制药技术可以生产多种重要的蛋白质药物，如抗体、细胞因子等。
这些蛋白质药物在治疗癌症、免疫性疾病等方面具有重要作用。
2.疫苗生产：动物细胞工程制药技术也可以用于疫苗的生产。
通过导入相应的病原体基因到动物细胞中，使其产生病原体相关的抗原，从而制备疫苗。
3.基因治疗：动物细胞工程制药技术还可以用于基因治疗。
通过将目标基因导入到患者的细胞中，实现对基因相关疾病的治疗。
4.抗病毒药物：某些动物细胞工程技术还可以用于抗病毒药物的生产。
通过将抗病毒基因导入到动物细胞中，使其产生抗病毒蛋白，从而对抗病毒感染。
三、动物细胞工程制药的前景随着基因工程和生物技术的不断发展，动物细胞工程制药在未来的前景十分广阔。
以下是动物细胞工程制药的一些未来发展趋势：1.技术的进一步成熟：随着技术的不断发展，动物细胞工程制药技术将变得更加成熟，能够更准确、高效地生产药物。
第3章 动物细胞工程制药
防止HIV传播，但至今未进入临床研究，原因也是生产 量不够 。
➢ 还有很多药物不仅发展中国家用不上，即便是发达国家
也难以使用，估计有80%的血友病患者无药可用，主要 是生产能力不足。
➢ 生产能力不足也导致其价格不菲。
6 我国动物细胞工程制药的目标
单克隆抗 体技术
诊断流感病毒类 型和狂犬病治疗
抗体与药物结合，能定位杀 灭肿瘤细胞，避免和减少对 正常细胞的伤害，大大减少 抗癌药物的不良反应。
生物导弹
通过大量的细胞培 养获得细胞产品
鹿茸细胞
动物细 胞培养
病毒抗原的制备和疫 苗的生产
带状疱疹 水痘 传染 性肝炎疫苗
➢ 目前全世界生物技术药物中使用动物细胞工程
依赖性、接触抑制性及功能全能性： ⑤ 培养过程产物分布于细胞内外，反应过程成本较高，但产品价格昂贵； ⑥ 大规模培养时，不可照用微生物反应的经验；
⑦ 原代培养细胞一般繁殖50代即退化死亡。
动物细胞培养的应用
疫苗 人 动物
单克隆抗体 免疫调节剂 酶 激素
动物细胞培养的产物 小儿麻痹症疫苗、狂犬疫苗、风疹疫苗、脑炎疫 苗、疱疹疫苗等
细胞 COS CHO BHK MDCK MRC-5 Namalwa Vero WI-38
来源 非洲绿猴肾细胞 中国仓鼠卵巢细胞 仓鼠肾细胞 狗肾细胞 人胚肺组织细胞 淋巴母细胞样细胞 猴肾脏成纤维细胞 胚肺组织细胞
用途 小规模量单抗 表达重组蛋白 生产畜用疫苗 生产畜用疫苗 产生人用疫苗 生产a-干扰素 生产人用制品 生产人用疫苗
2．纯化蛋白 利用单抗对抗原（目的蛋白）的特异性结合性质，制备蛋白纯化柱。
3．医学诊断 用于疾病的诊断，包括癌症、肝炎病毒、SARS病毒、细菌及血吸虫 等数百种疾病的诊断；
动物细胞工程制药的研究进展
动物细胞工程制药的研究进展动物细胞工程制药的研究进展1161001413167 刘星星摘要：动物细胞工程制药是动物细胞技术在生物制药工业方面的应用。
本文介绍了动物细胞工程制药所涉及的主要技术及其进展，包括动物细胞融合技术、转基因动物技术和细胞大规模培养技术等，在此基础上探讨了动物细胞工程制药的发展趋势。
关键词：动物细胞工程；生物制药；细胞融合；转基因动物；细胞培养2.传代细胞系(continuous cell lines,CCL)原代细胞经过传代筛选克隆，从多种细胞成分中挑选并纯化出某种具有一定特征的细胞株称为CCL。
许多CCL 建立于50年代，用它们来生产疫苗不仅可以降低实验动物的量，并且因为所用的细胞性质均一，通过体外大规模培养技术生产的疫苗可以保证质量，避免了动物个体差异产生的疫苗质量不稳定问题。
但 C C L 在生物学特性上与肿瘤细胞有许多相似之处, 有时是从肿瘤细胞衍生而来, 由于缺乏有效的科学手段来排除其潜在的致瘤性, 因而数十年间未允许 C C L 用于生产。
7 0 年代以后，大量研究工作证实了二倍体细胞的安全性, WI-38 是第一个生产脊髓灰质炎灭活疫苗的二倍体细胞系。
二倍体细胞系一般从动物胚胎组织中获取，有明显的贴壁和接触抑制特性，有正常细胞的核型，一般可传代培养 5 0 代，且无致瘤性，现在C C L 已被广泛用于人用治疗性药物的生产，但仍不是理想的生产细胞系。
表 1 列出了一些常用的生产用动物细胞系。
3.工程细胞系工程细胞系是指采用基因工程技术或细胞融合技术对宿主细胞的遗传物质进行修饰改造或重组，获得具有稳定遗传的独特性状的细胞系。
用于构建工程细胞的动物细胞有BHK-21、CHO-dhfr、Namalwa、Vero、SP2/0、Sf-9 等细胞系[1-2]。
SP2/0 - A g 1 4 工程细胞系是通过融合的方法，从抗羊红细胞活性的 B A L B / c 的小鼠脾细胞和骨髓瘤细胞系P 3 X 6 3 A g 8 融合杂交瘤SP2/NL-Ag 亚克隆中分离获得，可用于生产单克隆抗体[2]。
《动物细胞制药》课件
动物细胞培养的成本较高，细胞污染和变异性是制约其应用的主要问题。
2 机遇
随着技术的进步，细胞培养和基因工程的发展给动物细胞制药带来了创新机遇。
动物细胞制药的未来发展趋势
个性化药物
动物细胞制药将越来越多地 用于个体化治疗，根据患者 的基因组信息生产定制药物。
细胞工程技术
细胞工程技术的发展将为动 物细胞制药提供更多的途径 和方法，不断拓展其应用领 域。
纳米技术
纳米技术的应用将改变药物 的传输和释放方式，提高药 物的疗效和安全性。
动物细胞制药的潜在风险和监管措施
1
风险
动物细胞制药可能存在风险，如免疫
监管措施
2
原性、感染风险等，需加强监测和安 全评估。
相关监管机构应加强动物细胞制药的
监管，确保其质量和安全性。
3
关键因素
成功的动物细胞培养需要控制细胞密度、培养基组分、培养温度、培养pH值等 多个关键因素。
动物细胞制药的应用领域
生物药物
动物细胞制药在生物药物生产中起着重要作用，包括抗体、疫苗、生长因子等。
诊断试剂
动物细胞制药广泛应用于制备各种诊断试剂，如血清学试剂、酶联免疫吸附试剂等。
基因工程产品
动物细胞制药在基因工程产品的生产中具有重要意义，如重组蛋白、基因治疗等。
பைடு நூலகம்
常见的动物细胞制药产品
单克隆抗体
单克隆抗体是一类重要的生物 药物，常用于治疗癌症、自身 免疫性疾病等。
重组蛋白
重组蛋白是通过基因工程技术 制备的蛋白质，用于治疗多种 疾病，如糖尿病、血友病等。
疫苗
疫苗是预防传染病的重要手段， 动物细胞制药可用于生产多种 疫苗，如流感疫苗、乙肝疫苗 等。
生物制药 动物细胞工程制药
• 2、气升式生物反应器
• 与搅拌式生物反应器相比，具有剪切力小， 混合均一，氧和营养的传递好，由于没有 了机械搅拌的结构，有利于设备的密封， 降低了造价。高径比一般在10：1左右。
• 3、中空纤维式生物反应器
• 下图是由数百乃至数千根中空纤维集束组成的 反应器，纤维的材料为聚砜或丙烯共聚物，纤 维壁厚为50~100m，呈多孔性，内层为超滤 膜，内腔直径为200 m，两端用环氧树脂等 材料将纤维粘和在一起，并使内腔开口于外加 的塑料圆筒，使形成两个隔开的腔。
• 灌流式操作在某些生物反应器中是唯一可行 的操作方式，如中空纤维生物反应器、固定 床或流化床式反应器、膜式生物反应器等。 在这些反应器中，细胞已被固定，在取出部 分条件培养基和补充新鲜培养基和补充新鲜 培养基时，细胞基本上都被保留反应器中， 故采用该操作不存在困难。
• 但在微载体培养、悬浮培养和结团培养中，就存 在一个如何使条件培养基和细胞、载体分离的问 题。为了解决该问题，目前采用的方法有与旋转 轴连在一起的滤网、有专门用于悬浮细胞的中空 纤维分离器、超声波分离器和靠微载体自重沉降 分离的上细下粗的排液柱以及靠离心分离的专用 离心机等。
检测： 光学显微镜检查； 荧 光 显 微 镜 下 观 察 ： 荧 光 染 料 （ Hoechst ， Hoechst/PI, 丫啶橙/溴化乙锭）对细胞染色 细胞流式分析：检测培养过程中的细胞凋亡。
• 琼脂糖凝胶电泳：
• 凋亡的主要生化特征是激活一种Ca2+/Mg2+依赖型 的核酸内切酶，将核DNA切割成200 bp或更大的 片断。而坏死细胞不会出现DNA断裂片段
在动物细胞培养中，细胞凋亡是很普遍的现象， 在各种环境下都能发生。
工程动物细胞培养制药工艺过程
工程动物细胞培养制药工艺过程工程动物细胞培养制药工艺过程是一种利用动物细胞培养技术来生产各种药物的方法。
该过程通常包括以下几个步骤：1. 动物细胞的选取和培养基的准备：首先，需要选择合适的动物细胞作为生产细胞株。
通常使用哺乳动物细胞，如CHO细胞等。
然后需要准备培养基，培养基中包含了生长和繁殖细胞所需的营养物质、生长因子和其他必要的成分。
2. 细胞的扩增和传代：将选取好的动物细胞接种在培养基中，通过提供适当的温度、pH和氧气浓度等环境条件，使细胞可以持续增殖和扩增。
当细胞达到一定的密度时，需要将其传代到新的培养器中，以维持细胞的生长状态。
3. 细胞的表达和分泌：在培养过程中，可以向培养基中添加适当的诱导剂，促使细胞表达和分泌所需的药物。
细胞内的基因表达会产生药物的前体分子，然后通过细胞分泌系统将其释放到培养基中。
此外，细胞内的代谢途径也会参与药物的合成和修饰。
4. 收集和纯化药物：当细胞分泌出药物后，需要对培养基进行采集和处理。
这通常包括离心和过滤等步骤，以去除细胞碎片和其他杂质。
然后可以通过柱层析、电泳或其他分离技术对药物进行纯化，以得到纯度较高的药物样品。
5. 进一步的处理和制剂制备：在得到纯化的药物后，可以进行进一步的处理和制剂制备。
这包括稳定性研究、配方优化和药物制剂的制备等。
最终，通过临床试验和质量控制等步骤，可以得到最终用于临床应用的制药产品。
总结而言，工程动物细胞培养制药工艺过程是一个复杂的生产过程，需要合理设计培养条件、监控细胞生长和药物表达等关键参数。
同时，也需要严格的质量控制和合规操作，以确保药物的质量和安全性。
这一过程在现代制药工业中扮演着重要的角色，为生产高质量的药物提供了可靠的方法。
工程动物细胞培养制药工艺过程是一种利用动物细胞培养技术来生产各种药物的方法，广泛应用于药品研发和制造领域。
它比传统的化学合成方法更安全、高效，并能够生产出高质量的药物。
在工程动物细胞培养制药工艺中，动物细胞株的选取是至关重要的一步。
动物细胞工程制药-2
灌流式操作
定义：当细胞和培养基一起加入反应器后， 在细胞增长和产物形成过程中，不断地将部 分条件培养基取出，同时不断地补充新鲜培 养基
灌流式操作是近代用动物细胞培养生产各种 药品最受推崇的方式
优点：①细胞可处在较稳定的良好环境中，营 养条件较好，有害代谢废物浓度较低。②可极 大地提高细胞密度，一般都可达107-108个/时， 从而极大地提高了产品产量。③产品在罐内停 留时间缩短，可及时收留在低温下保存，有利 于产品质量的提高。④培养基的比消耗率较低，
半连续式操作
定义：当细胞和培养基一起加人反应器后， 在细胞增长和产物形成过程中，每间隔一段 时间，取出部分培养物，或单纯是条件培养 基，或连同细胞、载体一起，然后补充同样 数量的新鲜培养基，或另加新鲜载体，继续 培养
半连续式操作在动物细胞培养和药品生产中 被广泛采用
优点：操作简便，生产效率高，可长时期进 行生产，重复收获产品，而且可使细胞密度 和产品产量一直保持在较高的水平
缩在微囊内，从而有利于下游产物的纯化。④可采
用多种生物反应器进行大规模培养，如搅拌罐式生 物反应器，气升式反应器等
结团培养：1980年首创，该方法用细胞本身作 为基质，相互贴附后，再用悬浮的方法进行培
养
优点：操作简便，节省了用于微载体的成本
二、动物细胞培养的操作方式
分批式操作
补料-分批（或流加式）操作
冶金研究所等单位制备成功一批葡聚糖类（MC-1
型、CT-1型、CT-3型）、聚苯乙烯类（SH-2型、 PS-1型）和胶原类（GT-2型）等微载体
微载体培养的优点：既可创造相当大的贴附面 积供细胞贴附生长增殖，满足绝大多数细胞的
动物细胞培养制药工艺
三羧酸循环
2、动物细胞培养的代谢特征
谷氨酰胺代谢：脱氨、转氨等，合成其他非必需氨基 酸。 脱氨作用：生成谷氨酸，脱氨产生的氨，对细胞有毒 性。 转氨作用：生成嘧啶，嘌呤，氨基糖等合成代谢前体。 谷氨酰胺与丙酮酸发生转氨作用，生成丙氨酸，进入 培养液并积累。 离体动物细胞，转氨是主要代谢途径； Gln是动物细胞的氮源，Gln受限制时，通过增加其他 氨基酸的消耗得以补偿。 流加葡萄糖或谷氨酰胺，控制整个代谢过程，避免有 毒废物的积累。
•概念：是生长和寿命有限的细胞，经过若干传代培 养后失去增殖能力，老化死亡。 •特点：有限生长（时间），有接触抑制性（密度）。 •举例： WI-38、MRC-5、2BS等用于药品生产，曾经 广泛应用，但不是理想的生产细胞系。 •寿命：取决于细胞来源的物种和年龄、器官。人细 胞最高培养次数为50－60代。 •胚成纤维细胞：人，50代；鸡胚，30代；小鼠，8代。
（1）人源细胞系
Namalwa：类淋巴母细胞，悬浮生长。英国 Wellcome公司Sendai病毒诱导，大规模生产α干扰 素，批准上市。产品逐渐淘汰。 WI-38：Wistar Institute（WI），二倍体成纤维 细胞系，寿命有限。贴壁生长，对很多病毒敏感， 第一个被用于制备疫苗。 MRC-5：二倍体成纤维细胞系，生长较WI-38快，对 逆境有一定抗性，用于制备疫苗。
糖基化改造是研究热点。
动物细胞制药
表达系统
糖基化蛋白质分泌
• 分泌泡与细胞膜融合，把产物释放到胞外，完成 了蛋白质的分泌表达。
4、细胞周期与凋亡
细胞周期：细胞从分裂开始到分裂结束的一段时间。 四一个个阶段细：胞分裂，形成两个细胞。12－24h。
M期：分裂期，很短，0.5～1 h 分裂间期＝ G1 ＋S ＋ G2 期。 G1期：DNA 复制前期,差异大 S期：DNA 合成期，6～8 h G2期：DNA 复制后期，2～5 h
生化药物制备第三章、动物细胞工程制药
1
超滤系统
通过超滤膜过滤去除杂质， 浓缩目标产物。
离心机
进一步分离纯化细胞和细胞 器。
冻干机
用于制备干粉制剂，保护药 物活性成分。
制剂生产设备
01
灌装机
将药液灌装到安瓿、西林瓶等包装 容器中。
贴标机
在包装容器上贴上标签，标明药品 信息。
03
02
封口机
对灌装好的包装容器进行封口，保 证密封性。
针对所选细胞系，筛选和优化培养基 成分，以满足细胞生长和产物表达的 需求。
细胞培养条件控制
对细胞培养过程中的温度、pH值、 溶解氧等关键参数进行严格控制，确 保细胞正常生长和增殖。
细胞扩增技术
采用适当的细胞扩增技术，如微载体 培养、流加培养等，实现细胞的大规 模扩增。
中游工艺：目标产物分离纯化
收获与预处理
随着精准医疗的发展，动物细胞 工程制药将更加注重个性化治疗
药物的研发和生产。
03
监管政策日益严格
面对不断加强的药品监管政策， 企业需要加强质量管理体系建设
，确保产品质量和安全。
02
新技术不断涌现
基因编辑、细胞重编程等新技术 将为动物细胞工程制药带来更多
创新机遇。
04
国际合作与竞争并存
加强国际合作，学习借鉴国际先 进经验和技术，同时积极应对国
05 动物细胞工程制药设备与 设施
细胞培养设备
生物反应器
用于大规模培养动物细胞，提 供恒定的温度、pH值、溶解 氧等条件。
离心机
用于细胞分离、沉淀和洗 涤等操作。
培养箱
提供细胞生长所需的恒温、 恒湿、无菌环境。
显微镜
观察细胞生长状态和形态 变化。
项目四 章动物细胞制药
传代培养：将培养细胞从培养器中取出，把 一部分移至新的培养器中再进行培养。 原代培养形成的单层细胞汇合以后，需 要进行分离培养，否则细胞会因生成空间不 足或由于细胞密度过大引起营养枯竭，都将 影响细胞的生长 。 1、有限细胞系 2、连续细胞系
四、动物细胞培养的营养条件 特点： 1、细胞生长缓慢，易受微生物污染，培养 时需要抗生素； 2、动物细胞较微生物大得多，无细胞壁， 机械强度低，适应环境能力差； 3、培养过程需氧量少，且不耐受强力通风 与搅拌；
第一节 ห้องสมุดไป่ตู้胞培养技术
细胞培养条件： 1、营养 2、生长环境
（一）动物细胞培养技术
动物细胞体外培养具有明显的表达产物 方面的优点，为传统的微生物发酵技术所 无法替代。其中以它们转录后修饰和产物 胞外分泌表达最为人们所感兴趣。
二、动物细胞培养特征
贴壁依赖性细胞 非贴壁依赖性细胞 兼性贴壁依赖性细胞
4、在机体中，细胞相互粘连以集群形式存 在，培养过程具有群体效应、锚地依赖性、 接触抑制性及功能全能性； 5、培养过程产物分布于细胞内外，反应过 程成本较高，但产品价格昂贵 6、大规模培养时，不可套用微生物反应的 经验： 7、原代培养细胞一般繁殖50代即退化死亡。
培养基组成 1、天然培养基 血清 水解乳蛋白 胚胎浸液等 2、合成培养基 氨基酸 维生素 糖 无机盐等 加10%-20%血清 血清的优点？ 缺点？ 无血清培养基
单抗人源化 主要困难 （1）缺乏合适的人骨髓瘤细胞株作为融合亲本。现有的细 胞株大多是融合率不高，杂交瘤抗体产生水平低，而且细 胞不稳定，易丧失抗体分泌能力； （2）获得抗原特异的人B淋巴细胞十分困难，因为对人来说， 高度免疫获得抗原特异的B淋巴细胞的方法显然是不可行 的； （3）大量繁殖杂交瘤细胞以获得所需量的抗体，鼠类杂交 瘤可通过小鼠腹腔接种杂交瘤细胞诱生腹水达到这一目的， 但是人杂交瘤细胞在鼠类中诱生腹水是很困难的。
动物细胞制药
2021/10/10
16
无血清培养基中一般需要加入：
A、激素和生长因子； B、结合蛋白； C、贴附和伸展因子； D、其他利于细胞生长的因子和元素：如消除氧自 由基损害的谷胱苷肽，微量元素如硒等。
2021/10/10
17
第四节 动物细胞培养的方式和操作方法
一、动物细胞大规模培养的方法 根据培养细胞的种类分为原代细胞培培养和传代细胞培 养，也可以根据培养容器和方式的不同分为静止培养、旋转 培养、搅拌培养、微载体培养、中空纤维培养、固体床和流
D、微载体的比重在1.030—1.045g/ml，使载体在低速搅拌下可
以悬浮，而静止时又可很快沉淀，便于换液和收集；
E、粒径在60-250μm（溶胀后）之间为好，且要尽可能均一，
差异不大于20μm。有利于细胞均匀分布在各微载体表面；
F、具有良好的光学透明性，适于在倒置显微镜下观察细胞在载
体上的生长情况；
聚丙烯酰胺、环氧树脂、聚氨基甲酸酯、聚乙烯醇等。 B、糖类：
纤维素、琼脂、琼脂糖、K—卡拉胶、海藻酸钙、脱乙酰 几丁质等。 C、蛋白质：
胶原、明胶、纤维蛋白等。 这些材料是靠温度的变化来变相的，如海藻酸钙，在钠盐 时是液态。形成钙盐时则形成凝胶。 凝胶的制备常常是在形成凝胶后，再用另外一种电荷相反 的材料与之作用，使载体外形成一层聚合膜，然后再使膜内 的载体液化。
2021/10/10
葡
聚
糖
凝
胶
专
用
柱
20
理想的微载体应该具备的条件：
A、微载体表面性质与细胞有良好的相容性，适于细胞附着、伸
展和增殖；
B、微载体的材料无毒性。对培养细胞无毒性，还要不会产生影
响产品和人体健康的有害因子；
（完整版）生物技术制药课后习题..
（完整版）生物技术制药课后习题..生物技术制药课后习题by ×× Yuan1、生物技术制药分为哪些类型？生物技术制药分为四大类：（1）应用重组DNA技术(包括基因工程技术、蛋白质工程技术)制造的基因重组多肽，蛋白质类治疗剂。
（2）基因药物，如基因治疗剂，基因疫苗，反义药物和核酶等（3）来自动物、植物和微生物的天然生物药物（4）合成与部分合成的生物药物2、生物技术制药具有什么特征？（1）分子结构复杂（2）具有种属特异性（3）治疗针对性强，疗效高（4）稳定性差（5）基因稳定性（6）免疫原性（7）体内的半衰期短（8）受体效应（9）多效性（10）检验的特殊性3、生物技术制药中有哪些应用？应用主要有：（1）基因工程制药：包括基因工程药物品种的开发，基因工程疫苗，基因工程抗体，基因诊断与基因治疗，应用基因工程技术建立新药的筛选模型，应用基因工程技术改良菌种，产生新的微生物药物，基因工程技术在改进药物生产工艺中的应用，利用转基因动植物生产蛋白质类药物（2）细胞工程制药：包括单克隆抗体，动物细胞培养，植物细胞培养生产次生代谢产物（3）酶工程制药（4）发酵工程制药4、基因工程药物制造的主要程序有哪些？基因工程药物制造的主要步骤有：目的基因的克隆，构造DNA重组体，构造工程菌，目的基因的表达，外源基因表达产物的分离纯化产品的检验5、影响目的的基因在大肠杆菌中表达的因素有哪些？（1）外源基因的计量（2）外源基因的表达效率：a、启动子的强弱b、核糖体的结合位点c、SD序列和起始密码的间距d、密码子组成（3）表达产物的稳定性（4）细胞的代谢付荷（5）工程菌的培养条件6、质粒不稳定分为哪两类，如何解决质粒不稳定性？质粒不稳定分为分裂分为分裂不稳定和结构不稳定。
质粒的分裂不稳定是指工程菌分裂时出现一定比例不含质粒的子代菌的现象；质粒的结构不稳定是DNA从质粒上丢失或碱基重排，缺失所致工程菌性能的改变。
提高质粒稳定性的方法如下：（1）选择合适的宿主细菌（2）选择合适的载体（3）选择压力（4）分阶段控制培养（5）控制培养条件（6）固定化7、影响基因工程菌发酵的因素有哪些？如何控制发酵的各种参数？影响因素：（1）培养基（2）接种量（3）温度（4）溶解氧（5）诱导时机的影响（6）诱导表达程序（7） PH值8、什么是高密度发酵？影响高密度发酵的因素有哪些？可采取哪些方法来实现高密度发酵？高密度发酵：是指培养液中工程菌的菌体浓度在50gDCW/L以上，理论上的最高值可达200gDCW/L影响因素：（1）培养基（2）溶氧浓度（3）PH（4）温度（5）代谢副产物实现高密度发酵的方法：（1）改进发酵条件：a、培养基 b、建立流加式培养基 c、提高供养能力（2）构建出产乙酸能力低的工程菌宿主菌：a、阻断乙酸产生的主要途径 b、对碳代谢流进行分流 c、限制进入糖酵解途径的碳代谢流d、引入血红蛋白基因（3）构建蛋白水解酶活力低的工程化宿主菌9、分离纯化常用的色谱分离方法有哪些?它们的原理是什么?方法有离子交换色谱、疏水色谱、反相色谱、亲和色谱、凝胶过滤色谱及高压液相色谱。
生物技术制药第第三章动物细胞制药优秀课件
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第一节 概述
一、动物细胞培养的历史 二、细胞工程学 三、动物细胞制药发展历史
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动物细胞工程制药
两大内容：
在无菌和人工控制的条件下培养动物细胞以获得多肽和 蛋白质药物；
按照预定的设计，根据细胞生物学及工程学原理，采用
遗传操作技术定向改造动物细胞及动物细胞的遗传性状，
Vacanti Mouse：人耳鼠
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三、动物细胞制药的发展历史
1949年，Enders及其同事用哺乳动物原代细胞生产灭活脊髓灰质炎病 毒疫苗，开创了先河。
1986年用淋巴母细胞Namalwa生产干扰素批准用于临床。此后，Vero 细胞生产狂苗和脊髓灰质炎疫苗大量应用。
Cellular engineering includes tissue engineering and bioprocess engineering. Tissue engineering involves the use of living cells in the development of
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动物细胞体外培养历史上的里程碑
20世纪50年代，各种培养操作技术、培养器皿和培养基孕育而生。 Earle首创单个细胞克隆培养方法，建立了可无限传代的C3H小鼠结缔 组织细胞系。
1951年，Gay建立了第一个上皮型细胞系——人宫颈癌Hela细胞系。 1957年，Dulbecco采用胰酶消化处理组织块，用液体培养的方法获得
1897年 Loeb从血液和结缔组织中分离细胞可在血清和血浆中存活 1903年 Jolly观察到蝾螈细胞在体外可进行分裂 1907年 Harrison无菌条件下培养了离体的蛙胚神经组织，观察到神经
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先要
3. 将其构建在一个高效表达载体内。目前，一般 使用
4. 的载体有两类：一类是病毒载体，如牛痘病毒、 腺
5. 病毒、逆转录病毒和杆状病毒。另一类是质粒
载体
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二、生产用动物细胞的要求和获得
三、基因工程细胞的构建和筛选 2. 基因载体的导入和高效表达工程细胞株的筛选
载体构建后，可用四种方法导入动物细胞，其 中最常用的是磷酸钙沉淀法和电穿孔法，各种常用 的方法见后表。
细胞分为：贴壁依赖型（贴壁细胞）和贴壁非依赖型
（悬浮细胞）。
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一、动物细胞的形态和生理特点
1. 贴壁细胞
2.
这类细胞的生长必须有给你贴附的支持物
表
3. 面，细胞依靠自身分泌的或培养基中提供的贴 附
4. 因子才能在该表面上生长、增殖。当细胞在该 表
5. 面生长后，一般形成两种形态，即成纤维样细
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二、生产用动物细胞的要求和获得
一、生产用动物细胞的获得 2. 二倍体细胞系
原代细胞经过传代、筛选、克隆，从而从多 种细胞成分的组织中挑选并纯化某种具有一定特 性的细胞株。该细胞株仍具备“正常”细胞的特
点 ：① 它的染色体组型仍是2n的核型；②具有明显 的贴壁依赖和接触抑制的特性；③ 只有有限的增 值能力，一般可连续传代培养50代；④ 无致瘤性
动物细胞相对于原核细胞，它们多半是分泌 在胞外的，收集纯化方便，得到了较完善的翻译 后修饰，特别是糖基化，因此更与天然的产品一 致，更适合于临床使用。
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二、生产用动物细胞的要求和获得
一、生产用动物细胞的获得
1. 原代细胞
2.
原代细胞是直接取自动物组织、器官，
经过
3. 粉碎、消化而获得的细胞悬液。
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一、动物细胞的形态和生理特点
动物细胞的生理特点 5. 动物细胞对培养基的要求高
动物细胞对营养的要求高，不仅需要12种必 需氨基酸，还需要多种细胞因子和贴壁因子等才 能生长，这种要求还随细胞种类的不同而不同。
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一、动物细胞的形态和生理特点
动物细胞的生理特点 6. 动物细胞蛋白质的合成和修饰功能与细菌不 7. 同
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一、动物细胞的形态和生理特点
动物细胞的生理特点
1. 细胞的分裂周期长
2.
动物细胞分裂周期所需的时间一般为
12~48
3. h，它不仅随细胞种属的不同而不同，同一种
4. 属，不同部位的细胞所需的时间也不同。
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一、动物细胞的形态和生理特点
动物细胞的生理特点 2. 细胞生长需贴附于基质，并有接触抑制现象
干扰素。
SP2/0-Ag14：被广泛用于单克隆抗体杂交瘤细胞
的制备和抗体的生产，近年来正被开发为生产其
它药品的高表达宿主细胞。
Sf-9：目前被广泛用于高效表达外来的蛋白制品。
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二、生产用动物细胞的要求和获得
三、基因工程细胞的构建和筛选
1. 真核细胞基因表达载体的构建
2.
要将外源基因在动物细胞中高效表达，首
用于构建工程菌的是一株缺乏二氢叶酸还原酶的
营养缺陷突变株CHO-dhfr-。
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二、生产用动物细胞的要求和获得
二、常用生产用动物细胞的特性
BHK-2：二倍体细胞系。用于增值病毒和工程细
胞的构建。
Vero:贴壁依赖型的成纤维细胞。支持多种病毒的
增值，已被批准用于人体。
Namalwa:转化细胞系。被大规模地用于生物素α
当细胞在基质上分裂增殖，逐渐会合成片时 ，即每个细胞与其周期的细胞相互接触时。细胞 就停止繁殖。此时若能保持充足的营养，细胞仍 可存活相当一段时间。但细胞密度密度不再增加 ，所以该现象称之为接触抑制或密度依赖抑制现 象。
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一、动物细胞的形态和生理特点
动物细胞的生理特点
3. 正常二倍体细胞的生长寿命是有限的 当细胞离体培养开始，我们称之为原代培养。
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二、生产用动物细胞的要求和获得
二、常用生产用动物细胞的特性
WI-38：二倍体细胞系。该细胞是最早被认为是
安全的传代细胞。在20世纪60年代广泛用于制备
疫苗。
MRC-5:二倍体细胞系。被广泛用于人体疫苗的生
产。
CHO-KI:1957年从中国地鼠暖巢中分离的一株上
皮样细胞，培养时需要加入脯氨酸。当前被广泛
动物细胞比植物细胞的培养难度大得多，因 为动物细胞膜外没有细胞壁保护，仅有一层很薄 的粘多糖蛋白。因此动物细胞对渗透压、pH、离 子浓度、剪切力、微量元素等的变化耐受力很弱 。
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一、动物细胞的形态和生理特点
动物细胞的生理特点 4. 动物细胞对周围环境十分敏感
动物细胞比植物细胞的培养难度大得多，因 为动物细胞膜外没有细胞壁保护，仅有一层很薄 的粘多糖蛋白。因此动物细胞对渗透压、pH、离 子浓度、剪切力、微量元素等的变化耐受力很弱 。
胞
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一、动物细胞的形态和生理特点
2. 悬浮细胞
这类细胞的生长不依赖支持物表面，可在培 养液中呈悬浮状态生长。
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一、动物细胞的形态和生理特点
3. 兼性贴壁细胞
这类细胞并不严格地依赖支持物表面生长， 一定条件下，它们还可以在培养基中呈悬浮状 态良好地生长。这类细胞称之为兼性贴壁细胞。
以后经传代后，即成为有限细胞系。细胞经若干
代传代培养后逐渐死亡，该时间的长短取决于细
胞来源的种族和年龄。当细胞经自然的或人为的
因素转化为异倍体后，该细胞即可转变为无限细
胞系，或称连续细胞系。此时细胞的寿命将是无
限的，因此更适合于工业化生产的需要。
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一、动物细胞的形态和生理特点
动物细胞的生理特点 4. 动物细胞对周围环境十分敏感
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二、生产用动物细胞的要求和获得
一、生产用动物细胞的获得 3. 转化细胞系
这类细胞是通过某个转化过程形成的，他常 常由于染色体的断裂变成了异倍体，从而失去了 正常细胞的特点，而获得了无限增值的能力。由 于转化的细胞具有无限生命力，而且常常倍增时 间较短，对培养条件和生长因子等要求较低，故 更适于大规模工业化生产的需要。
第三章 动理特点
动物细胞的结构较原核细胞复杂得多，而且以不
是靠一个细胞包办一切生理活动，各细胞都有明确的
分工。为了适应其功能需要，细胞的形态也有了相应
的变化，我们称这种变化为分化。如：红细胞呈圆盘
形；神经细胞呈纤维形。然而当细胞离体培养时这些
分化的形态经常会发生变化。我们通常将离体培养的