全内反射荧光显微镜TIRFM介绍

优 势
劣 势
・ 只能观察盖波片和细胞膜 ・非实时动态 表面 ・ 信噪比没有 TIRFM 高
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全内反射应用
• 细胞表面观察
– D. Axelrod – Cell/Substrate Contact / W. Reichert
•UV 405 - 440nm 新的半导体激光器: UV 405/440nm 半导体激光器 (应用于荧光分子漂白和CFP荧光图像) • VIS 458 - 473 - 488 - 515 - 543 - 559 - 635 nm 多谱线Ar 离子激光器和新的半导体激光器
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荧光 —— 全球首次引入离子镀膜技术 “最明亮的荧光显微镜”
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双层V型光路、多光口输出——IX2
前置面板操作
内置多层光路
最符合亚洲人操作习惯的亚洲人机 工学设计，和前端操作设计
细胞内液 (n=1.38) 水 (n=1.33)
n光束容易校准 n数值孔径越大，分辨率越高 n数值孔径大，有更多的激发光强 可以用来产生全反射 n全内反射角度调节范围更大
100x NA1.4
100x NA1.65
0.04mm
0.21mm
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荧光观察图像景深范围
LSM
CCD 聚焦位置
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CCD 获得增益的三种常用方法
1.后期电路放大（Gain） 2.像增强器（Intensified CCD） 3.芯片上放大技术（On-Chip Multiplication Gain）
全内反射照明的切换
全内反射照明
盖波片
物镜
激光
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光路结构
物镜 微分尺
光纤 视场光栏 激光
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TIRFM 原理
全内反射是一项依赖于消逝波的技术。 在两种不同折射率介质的临界面上，临界角 的光线几乎被完全反射： c= sin-1 (n2/n1) n1 > n2 消逝波只能够传播到盖玻片后几百纳米内 典型的有效照明下渗透度只有50nm到100nm
低折射率 q 高折射率
只有临近盖玻片表面（近场）的荧光分子才能 被激发。远场分子不受激发。
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TIRFM和荧光照明器共用
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多条激发光谱线可供选择
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庞大完善的售后服务体系
显微镜完善的的服务体系
——覆盖全国的7家显微镜维修站 （北京、上海、广州、武汉、重庆、西安、济南）
强大的售前/售后技术支持
——市场技术部和技术服务部
EM CCD ！！！！
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共聚焦显微镜方面的独创
世界第一家TIRFM技术厂家 世界最高分辨率物镜NA=1.65 世界唯一TRIFM+Confocal集成系统，结合了两者的优势
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TIRFM vs 激光共聚焦
TIRFM
・ 实时动态图像，速度快 ・ 深度大约 100nm ・ 高信噪比 ・ 单分子荧光信号探测
激光共聚焦
・ 可得到 Z 轴光学切片 ・ 可实现三维重构
如何得到消逝波
标本折射率 消逝波 水 n２ =1.33 细胞内液 n２ =1.38
d
盖波片 （n1＝1.52 for PLAPO60XOTIRFM) (n1＝1.78 for APO100XOHR ） 镜油 （n0＝1.52 for PLAPO60XOTIRFM） （n0＝1.78 for APO100XOHR ）
対物レンズ
θC θmax
发生条件
n θ > θc (TIR angle)
sinθc = n2/ n1 D
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n n1(Cover glass) > n2 (Medium)
全内反射为何需要高数值孔径的物镜
DiI染色的神经元
TIRFM FLM
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S. Simon et. al/Rockefeller Univ.
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全内反射荧光显微镜系统
Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy (TIRFM)
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全内反射照明的切换
盖波片
物镜
激光
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改变入射激光角度
全内反射照明的切换
盖波片
物镜
激光
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TIRFM
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棱镜型TIRFM Vs 物镜型TIRFM
OLYMPUS OLYMPUS
安装简单 •可用于微分干涉观察DIC 高数值孔径物镜 •高数值孔径物镜 •可连接原子力显微镜AFM •可用于显微注射和膜片钳实验
全内反射荧光显微镜的基本组成
•高级研究级显微镜
一般为倒置显微镜，配荧光照明器、高数值孔径的物镜
•TIRFM照明器
通过光纤接入激光，并对激光入射方向进行控制，通过L型照明器实现 和荧光照明器一起从荧光通道进入显微镜
•激光器
根据实验要求选择，可以接入单激光器或者多激光系统
•检测系统
应选择高灵敏度制冷CCD，要求CCD量子效能高，能够对极弱荧光进行 捕捉，具有上千倍的信号放大功能，如果是对快速荧光信号进行捕捉则 还需要高速CCD
高灵敏度冷CCD --- EMCCD Rolera-MGi
背感光、高量子效率，>90% 芯片增益EMCCD，不放大读出噪音 高速度，全幅30fps，最高300fps以上 低温制冷CCD
EM CCD在以下应用具有无可比拟的优势： 1。单分子成像：Single molecule imaging 2。全内反射：Total internal reflection 3。转盘式共聚焦：Spinning Disk 5。Ca等的离子测定 6。快速时间序列的荧光3D成像
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全内反射的深度
Evanescent wave 1 Relative Intensity 0.8 0.6 0.4 0.2 0 0 50 100 Distance (nm) 150 200 E (1.65) E (1.45)
• 胞吞/胞吐现象
– Exocytosis of single secretory granules in live cells using acridine orange / W. Almers
• 单分子荧光信号探测
– Using NA1.65 Objective Lens/ Dr. Terakawa – Myosin, Actin with Cy3 labeled ATP / T. Yanagida
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DiI染色的Hela细胞
TIRFM FLM
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NA 1.45
(WD 0.1-0.16mm, Cover glass thickness 0.13-0.19mm) 数值孔径1.45 工作距离0.1-0.16mm 可校正盖波片厚度0.13-0.19mm 可校正温度的影响23-37℃
NA 1.45
(WD 0.1mm) 数值孔径1.45 工作距离0.1mm
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TIRFM专用高数值孔径物镜
APO100XOHR PLAPON60XOTIRFM PLAPO100XOTIRFM
NA 1Hale Waihona Puke Baidu65
(WD 0.1mm) 数值孔径1.65 工作距离0.1mm
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UIS2无限远光学校正系统
• 从紫外到近红外（UV–NIR）都提供更优异的透过性能
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• 钙离子通道实时监测
(w/ High Speed Camera) – Using Ca-green / M. Morad
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Dr. S. Simon, J. Schmoranzer / Rockefeller Univ. Dr. Axelrod / Univ. of Michigan
安装简单 可用于膜片钳实验 物镜数值孔径受限制
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全内反射照明的切换
宽场荧光照明
盖波片
物镜
激光
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