核糖体工程技术研究进展

1 核糖体工程技术研究进展
微生物广泛存在于自然界中，是新活性化合物及其先导结构的重要来源[1]。

但是野生型的菌株在自然界中产生的活性物质的产量非常低，特别是具有商业价值的抗生素，产量一般都介于1~100 μg/mL[2]。

为了满足工业化生产的需要，就必须通过各种技术和方法来提高菌株产生物活性物质的能力。

1.1 核糖体工程的由来
从自然界分离到的野生型菌株产生的次级代谢产物产量通常很低，如何提高野生型菌株的抗生素产量成为研究的重点[3]。

通过物理或化学的条件进行随机的诱变是改良菌株的经典方法，虽然有效但通常需要耗费大量的时间和资源[4]。

“核糖体工程”是国际上最新发展起来的一门菌种改良新技术，日本国家食品研究所的Kozo Ochi 教授首先提出来核糖体工程（Ribosome Engineering）这一概念[5, 6]，它是以核糖体蛋白结构上的突变对微生物次级代谢调控作用的影响机制出发建立起来的微生物推理育种的新方法。

1.2 核糖体工程的作用机制
在营养极度缺乏的条件下，原核生物可以分泌抗生素、生成产物、合成酶、形成孢子和气生菌丝等，有非常广泛的适应能力。

微生物具有对营养物质匮乏的环境进行紧缩应答（Stringent Response）或称紧缩控制（Stringent Control）的反应机制[7]，其原理如图1-1所示[5]，当微生物生长的环境中缺少氨基酸时，会导致微生物产生一系列的细胞反应，如迅速中止RNA的积蓄和蛋白质合成，同时还伴随着细胞的形态分化（如气生菌丝和孢子的形成）和启动次级代谢产物（如抗生素、色素和酶等）的生物合成。

在这个反应过程中，四磷酸鸟苷酸（ppGpp）起着非常重要的作用，它的合成基因是relA。

当微生物处于营养缺乏的环境时，它的生长由对数期进入稳定期，在这一变化中，由于环境中缺少氨基酸，蛋白质合成的装配车间也就是核糖体的A部（氨酰-tRNA的结合部位）会与游离的tRNA 结合，因此导致肽链的延伸被迫停止，进而终止了蛋白质的合成[8]。

这一信息传递到它的合成基因relA，触发合成ppGpp，从而激活微生物的次级代谢产物的生物合成。

图1-1 细菌严谨反应
Fig.1-1 Scheme of bacterial stringent response
核糖体不仅是蛋白质的合成机器, 也是细胞感知营养水平和对生长速率进行调控的重要位点[9]。

其结构的改变在微生物次级代谢产物的代谢调控方面也起着关键性的作用。

在研究微生物中抗生素的作用机制中发现，很多抗生素主要是通过与核糖体的某些部分相结合来抑制蛋白质的合成，进而起到类似于严谨反应同样的作用效果，核糖体结构改变的同时也改变了蛋白的合成能力，而且微生物次级代谢产物的调控途径也受到影响，进而获得微生物代谢产物合成能力提高的菌株[10]。

在稳定生长期，微生物次级代谢产物大量合成，与之相关的生物合成基因的大量表达起到了关键性的作用，因此核糖体突变（包括核糖体蛋白和rRNA）带来的蛋白合成能力的改变，对次级代谢产物生物合成的影响必然是非常重要的[11]。

某些核糖体突变可以反映为作用于核糖体上的抗生素的抗性变化，因此通过筛选或构建相应的抗性突变，可获得核糖体功能突变的菌株，进而获得次生代谢产物合成能力提高的菌株。

微生物核糖体工程中最主要的两个细胞器即核糖体和RNA多聚酶，以引入的抗生素抗性突变为外在表征，定向筛选次生代谢产物合成能力提高的突变菌株(图1-2)[6]。

常用于抗性筛选的抗生素主要包括链霉素(Str)、利福平(Rif)、庆大霉素(Gen)、巴龙霉素(Par)、夫西地酸(Fus)、硫链丝菌素(Tsp)、林肯霉素(Lin)和遗传霉素(Gnt)等[4]。

Fig.1-2 Scheme of ribosome engineering to activate cellular function
1.3 核糖体工程技术的应用
1.3.1 诱导次级代谢产物产量的提高
微生物核糖体突变诱导抗生素耐药性的同时，也导致核糖体功能的改变，从而影响到微生物的其他一些生理活性，因此，核糖体工程在微生物活性产物高产菌株的选育方面受到了关注。

核糖体工程的主要内容是以微生物对某些抗生素的耐受性作为筛选标记，获取具有明显抗生素抗性的高产突变株，并阐明其遗传学及分子生物学机制，目前已取得很好进展[12]。

如链霉素抗性突变株，由于该菌株核糖体S12蛋白发生了突变(Lys-88 变为Glu-88)，使其能抵抗高达300 μg/mL浓度的链霉素[13]。

在高氏Ι号合成培养基中添加链霉素，筛选柔红霉素产生菌天蓝淡红链霉菌的链霉素自发抗性突变株, 其正向突变频率高达34%，抗性突变株的发酵水平约为出发菌株1.5倍[14]。

大量的研究表明[15-23]，微生物的抗性突变是进行抗生素产生菌株优化的有效方法，具有目标明确、有效突变率高，能实现不同抗生素组合的抗性突变，不依赖遗传背景，适用范围广等优点[24]。

王耀耀等利用链霉素和利福平组合抗性筛选，结合高能电子诱变改造东方拟无枝酸菌，获得了去甲万古霉素效价提高45.8%的突变菌株[25]。

组合庆大霉素和利福平二种抗性突变筛选，以提高蜡状芽孢杆菌2045的抗生素FR2900493合成水平，结果表明抗性突变株的抗生素合成量较野生菌提高了5~6倍[26]。

Tamehiro等对白色链霉菌工业菌种进行了组合抗药性突变选育，通过str、gen、rif三种抗生素的组合筛选后菌株的盐霉素产量较抗性筛选前提高了2.3倍[27]。

除合成次级代谢产物外，有报道称核糖体工程技术还对提高微生物来源酶类产量、提高恶臭假单胞菌(Pseudomonasputida)对芳香化合物的耐受能力[13, 28]。

有报道表明，生长末期时抗生素耐受株比野生菌株具有更高的蛋白质合成水平，其中参与次级代谢途径的特异性蛋白(如:actn-ORF4)的高表达是抗生素高产的关键[24, 29]。

其中，利用链霉素和利福平筛选获得的抗性突变株，其发酵产量比原始菌株能提高2~3倍，并且菌落形态及颜色的变化与肽类抗生素的生产具有一定的联系，该技术使肽类抗生素高产的相关分子机制正在研究之中。

Fabrizio等运用该技术实现了肽类抗生素GE2270产量的提高[30]。

目前，核糖体工程相关研究主要集中在原核生物尤其是放线菌上，至于真菌是否也存在应急反应并对抗生素合成具有类似的调控机制，值得深入探讨和考证[31]。

1.3.2 诱导新的活性物质的产生
众所周知，微生物基因组中存在暂时丧失表达活性而静默的沉默基因，沉默
基因受到某些诱发因子刺激或者基因突变等原因时能够被活化而实现表达，因此有可能产生新的代谢产物[32]。

所谓沉默基因(silent gene)是存在于微生物基因组中不表达或极低水平表达的DNA序列，它们能在特定条件下被激活而表达活性产物，沉默基因激活机制在自然界早已存在。

Hopwood于20世纪80年代初就提出了通过激活沉默基因来获取新型抗生素的方法；如通过基因克隆、诱变处理、菌株或种间自然接合、原生质体融合等方法来激活沉默基因的[33]。

遗传学分析表明，菌体性状的调控是通过多层次的链锁调节操纵实现的；低表达水平时，抗生素的生物合成基因和抗性基因可激活酶结构基因；较高表达水平时，则有激活沉默基因的作用[34]。

通过激活沉默基因产生新抗生素的理论依据是微生物次级代谢的特点：一种微生物能产生多种抗生素或次级代谢产物，而相同或不同的菌种又可以产生极相似的一类化合物。

S.LividansTK24 正常情况下不产生放线菌紫素，在引入链霉素抗性之后，突变株获得了放线菌紫素产生能力，可能引入抗生素抗性后，引起核糖体结构的变化，激活了沉默基因所致[11]。

Chakraburtty等发现当S.coelicolor A3(2)relA基因发生突变时，不能合成ppGpp，也不能产生放线菌紫红素[35]。

J.Shima等发现向relA突变株引入链霉素抗性，在未恢复ppGpp合成能力的情况下，就能恢复其产放线菌紫红素的能力[36]。

将链霉素抗性引入天蓝色链霉菌野生菌中，可以使其放线菌紫红素产量提高十倍。

分析了一株链霉素抗性突变株Bacillus subtilis Marburg168,发现其S12蛋白的第56位氨基酸发生了点突变，由赖氨酸突变为天冬酰胺，丝氨酸和精氨酸，其链霉素的抗性分别达500，1000，2000倍[37, 38]。

在利用链霉素抗性开拓海洋药用微生物新资源方面，取得了一定的成果[39, 40]，以一株没有抗肿瘤活性的海洋放线菌玫瑰黄链霉菌(Streptomyces rose of lavus)为出发菌株，采用核糖体工程技术，进行抗生素抗性筛选，共获得有抗生素抗性的突变株270株[41]。

将突变株的发酵产物进行体外抑肿瘤细胞活性研究，获得抗肿瘤活性显著的突变株3株。

对其中抗肿瘤活性较好的突变株Str3054 进行大量发酵，采用活性追踪方法初步分离发酵产物的活性成分，获得了6个单体化合物并进行结构鉴定，其中有5个化合物表现出一定抗肿瘤活性。

因此，核糖体工程技术是充分发掘药用微生物新资源的重要手段之一。

核糖体的改变影响着蛋白质和抗生素合成，单个或组合抗生素筛选条件下，都可得到大量表达目的产物的抗性突变株，其中以链霉素、利福平的研究开展较多，筛选效果最佳。