细菌的分离培养与鉴定
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培养24小时
3.半固体培养法－观察细菌是否有动力
1、3：有动力： 呈云雾状 2：无动力：
沿穿刺线生长， 并变粗
四、细菌的生化反应
1 糖发酵试验(Fermentation of sugars) 2 IMViC 试验 ➢ 靛基质产生试验（吲哚试验） ➢ 甲基红试验 ➢ V-P试验 ➢ 枸橼酸盐利用试验 3 硫化氢产生试验 4 尿素分解试验
吲哚（靛基质）试验(Production of indole)
有些细菌具有色氨酸酶，能分解蛋白胨 中的色氨酸而产生靛基质，靛基质无色，不 能直接查见，此时滴加数滴吲哚试剂于培养 基的液面上，上层呈玫瑰红色者为阳性，仍 呈黄色者为阴性。
甲基红（methyl red）试验
将细菌接种于葡萄糖蛋白胨水中，37℃ 培养48h后，再向其中加入甲基红试剂3滴。
硫化氢产生试验(Production of H2S)
将细菌穿刺接种于醋酸铅培养基中， 37℃培养24h后观察结果。有些细菌能分解 培养基中的含硫氨基酸，生成硫化氢，穿刺 部位呈黑褐色，是为反应阳性。培养基颜色 无变化，则为阴性。
尿素分解试验(Splitting of urea)
将细菌接种于尿素培养基中，37℃培养 18～24h。变形杆菌能迅速(2～4h)分解尿素 产生大量的氨，使培养基变碱而呈紫红色， 是为阳性反应。
实验后处理
将接种针和接种环放入原位，摆放整齐！ 将所有的原菌种管放入自己组的红框试管架
中！ 将自己接种的培养物集中在试管架中统一放
入培养箱中37度培养！ 关照明和电扇开关，请勿关实验室总电
源！！！
下次实验
实验三 细菌的革兰氏染色及其形态结构的 观察
带显微镜！！！
孢杆菌/葡萄球菌
2. 接种 每一菌种分别接种
pH5.0 / 7.2 / 9.0的营 养肉汤各一支 3. 送37℃温箱培养24小 时
液体培养基
沉 淀 生 长
混 浊 生 长
表 面 生 长
Biblioteka Baidu
(3) 琼脂半固体接种法 （1人一份）
1. 菌种
大肠埃希菌/枯草芽孢
杆菌/葡萄球菌
2. 接种
用接种针穿刺接种
3. 送37℃温箱
否有单一菌落长出；菌落的形态、颜色、 大小、边缘、透明度都需记录。
平皿送37℃温箱培养24小时 结果(要求)
两种单个菌 落
分四区 无杂菌 琼脂不破
℃
3.2 细菌的接种
斜面接种法 该法主要用于单个菌落的纯培养、 保存菌种或观察细菌的某些特性。
液体接种法 多用于一些液体生化试验管或发酵的
枸橼酸盐利用试验(Utilization of citrate)
将细菌接种于枸橼酸盐培养基上，37℃ 培养48h。产气杆菌等细菌能利用枸橼酸盐 作为碳源，分解枸橼酸盐生成碳酸盐，使 培养基变为碱性，培养基中的指示剂（溴 麝香草酚蓝）由淡绿色转为深蓝色，为枸 橼酸盐利用试验阳性。大肠杆菌则不能分 解枸橼酸盐，培养基颜色不变，为阴性。
糖发酵试验
不同细菌分解糖类的能力和代谢产物不同。 例如大肠杆菌能发酵葡萄糖和乳糖；而痢疾 杆菌可发酵葡萄糖，但不能发酵乳糖。即使 两种细菌均可发酵同一糖类，其结果也不尽 相同，如大肠杆菌有甲酸脱氢酶，能将葡萄 糖发酵生成的甲酸进一步分解为CO2和H2， 故产酸并产气；而痢疾杆菌缺乏该酶，发酵 葡萄糖仅产酸不产气。
连续稀释法
平板分区划线
分区划线分离法：此法常用于含菌量较多的标本
如混合细菌的分离。
连续划线分离法：此法常用于含菌量不多的标本
或培养物中的细菌分离培养
平板分区划线法（学生操作）
2区 1区
1 3区
3
2
4区 4
注意事项
➢ 划完前一区后，需重新灼烧接种环后再进 行下一区的划线。
➢ 相邻两区要有重叠区域。 ➢ 结果观察：观察各区的生长情况，并看是
化学灭菌法：主要使用一些化学消毒剂进行，
如：75％酒精、1％的新洁尔灭等。
三 细菌的分离、接种与培养
细菌的分离方法：
稀释法、平板分区划线法。
细菌的接种方法：
斜面培养基接种法、液体培养基接种法、穿刺 接种法、倾注平板法、平板涂布法。
细菌的培养方法：
需氧培养法 CO2培养法 厌氧培养法
3.1 细菌的分离培养方法
细菌的分离培养与鉴定
一 培养基的制备 二 消毒与灭菌 三 细菌的接种和培养 四 细菌的生化反应
一 培养基的制备
步骤： 1 称量药品 2 溶解 3 调节PH 5 过滤分装 6 包扎标记 7 灭菌
二 消毒灭菌法
物理灭菌法：
干热灭菌法：150-170 ℃ 维持 1-2h； 高压蒸汽灭菌法121℃（101.53kPa）15-30min； 其他：过滤除菌法、紫外线灭菌法。
大肠杆菌等细菌分解葡萄糖产生丙酮酸， 但丙酮酸不被缩合成乙酰甲基甲醇，而转化 成甲酸、乙酸等酸性物质，培养基中酸多， pH值低，故呈红色，为阳性。
而产气杆菌将丙酮酸缩合成乙酰甲基甲醇， 培养基中酸少，pH值高，故呈黄色，为阴性。
VP（Voges-Proskauer）试验
大肠杆菌和产气大肠杆菌均能发酵葡萄 糖，产酸产气，两者不能区别。但产气杆菌 能使丙酮酸脱羧生成中性的乙酰甲基甲醇， 后者在碱性溶液中被氧化生成二乙酰，二乙 酰与含胍基化合物反应生成红色化合物，是 为VP试验阳性。大肠杆菌不能生成乙酰甲 基甲醇，故VP试验阴性，
接种。 穿刺接种法
此法主要用于半固体培养基、明胶 及双糖管的接种。
(1) 斜面琼脂培养基接
种法（2人一组） 大肠埃希菌/枯草芽
孢杆菌/葡萄球菌
用接种环挑菌后在 斜面表面划折线
送培养24小时(2支/组) 一组 37℃温箱 一组 60℃温箱 一组 4℃ 冰箱
(2) 液体培养基接种法（2人一组）
1. 菌种 (任选一种） 大肠埃希菌/枯草芽
3.半固体培养法－观察细菌是否有动力
1、3：有动力： 呈云雾状 2：无动力：
沿穿刺线生长， 并变粗
四、细菌的生化反应
1 糖发酵试验(Fermentation of sugars) 2 IMViC 试验 ➢ 靛基质产生试验（吲哚试验） ➢ 甲基红试验 ➢ V-P试验 ➢ 枸橼酸盐利用试验 3 硫化氢产生试验 4 尿素分解试验
吲哚（靛基质）试验(Production of indole)
有些细菌具有色氨酸酶，能分解蛋白胨 中的色氨酸而产生靛基质，靛基质无色，不 能直接查见，此时滴加数滴吲哚试剂于培养 基的液面上，上层呈玫瑰红色者为阳性，仍 呈黄色者为阴性。
甲基红（methyl red）试验
将细菌接种于葡萄糖蛋白胨水中，37℃ 培养48h后，再向其中加入甲基红试剂3滴。
硫化氢产生试验(Production of H2S)
将细菌穿刺接种于醋酸铅培养基中， 37℃培养24h后观察结果。有些细菌能分解 培养基中的含硫氨基酸，生成硫化氢，穿刺 部位呈黑褐色，是为反应阳性。培养基颜色 无变化，则为阴性。
尿素分解试验(Splitting of urea)
将细菌接种于尿素培养基中，37℃培养 18～24h。变形杆菌能迅速(2～4h)分解尿素 产生大量的氨，使培养基变碱而呈紫红色， 是为阳性反应。
实验后处理
将接种针和接种环放入原位，摆放整齐！ 将所有的原菌种管放入自己组的红框试管架
中！ 将自己接种的培养物集中在试管架中统一放
入培养箱中37度培养！ 关照明和电扇开关，请勿关实验室总电
源！！！
下次实验
实验三 细菌的革兰氏染色及其形态结构的 观察
带显微镜！！！
孢杆菌/葡萄球菌
2. 接种 每一菌种分别接种
pH5.0 / 7.2 / 9.0的营 养肉汤各一支 3. 送37℃温箱培养24小 时
液体培养基
沉 淀 生 长
混 浊 生 长
表 面 生 长
Biblioteka Baidu
(3) 琼脂半固体接种法 （1人一份）
1. 菌种
大肠埃希菌/枯草芽孢
杆菌/葡萄球菌
2. 接种
用接种针穿刺接种
3. 送37℃温箱
否有单一菌落长出；菌落的形态、颜色、 大小、边缘、透明度都需记录。
平皿送37℃温箱培养24小时 结果(要求)
两种单个菌 落
分四区 无杂菌 琼脂不破
℃
3.2 细菌的接种
斜面接种法 该法主要用于单个菌落的纯培养、 保存菌种或观察细菌的某些特性。
液体接种法 多用于一些液体生化试验管或发酵的
枸橼酸盐利用试验(Utilization of citrate)
将细菌接种于枸橼酸盐培养基上，37℃ 培养48h。产气杆菌等细菌能利用枸橼酸盐 作为碳源，分解枸橼酸盐生成碳酸盐，使 培养基变为碱性，培养基中的指示剂（溴 麝香草酚蓝）由淡绿色转为深蓝色，为枸 橼酸盐利用试验阳性。大肠杆菌则不能分 解枸橼酸盐，培养基颜色不变，为阴性。
糖发酵试验
不同细菌分解糖类的能力和代谢产物不同。 例如大肠杆菌能发酵葡萄糖和乳糖；而痢疾 杆菌可发酵葡萄糖，但不能发酵乳糖。即使 两种细菌均可发酵同一糖类，其结果也不尽 相同，如大肠杆菌有甲酸脱氢酶，能将葡萄 糖发酵生成的甲酸进一步分解为CO2和H2， 故产酸并产气；而痢疾杆菌缺乏该酶，发酵 葡萄糖仅产酸不产气。
连续稀释法
平板分区划线
分区划线分离法：此法常用于含菌量较多的标本
如混合细菌的分离。
连续划线分离法：此法常用于含菌量不多的标本
或培养物中的细菌分离培养
平板分区划线法（学生操作）
2区 1区
1 3区
3
2
4区 4
注意事项
➢ 划完前一区后，需重新灼烧接种环后再进 行下一区的划线。
➢ 相邻两区要有重叠区域。 ➢ 结果观察：观察各区的生长情况，并看是
化学灭菌法：主要使用一些化学消毒剂进行，
如：75％酒精、1％的新洁尔灭等。
三 细菌的分离、接种与培养
细菌的分离方法：
稀释法、平板分区划线法。
细菌的接种方法：
斜面培养基接种法、液体培养基接种法、穿刺 接种法、倾注平板法、平板涂布法。
细菌的培养方法：
需氧培养法 CO2培养法 厌氧培养法
3.1 细菌的分离培养方法
细菌的分离培养与鉴定
一 培养基的制备 二 消毒与灭菌 三 细菌的接种和培养 四 细菌的生化反应
一 培养基的制备
步骤： 1 称量药品 2 溶解 3 调节PH 5 过滤分装 6 包扎标记 7 灭菌
二 消毒灭菌法
物理灭菌法：
干热灭菌法：150-170 ℃ 维持 1-2h； 高压蒸汽灭菌法121℃（101.53kPa）15-30min； 其他：过滤除菌法、紫外线灭菌法。
大肠杆菌等细菌分解葡萄糖产生丙酮酸， 但丙酮酸不被缩合成乙酰甲基甲醇，而转化 成甲酸、乙酸等酸性物质，培养基中酸多， pH值低，故呈红色，为阳性。
而产气杆菌将丙酮酸缩合成乙酰甲基甲醇， 培养基中酸少，pH值高，故呈黄色，为阴性。
VP（Voges-Proskauer）试验
大肠杆菌和产气大肠杆菌均能发酵葡萄 糖，产酸产气，两者不能区别。但产气杆菌 能使丙酮酸脱羧生成中性的乙酰甲基甲醇， 后者在碱性溶液中被氧化生成二乙酰，二乙 酰与含胍基化合物反应生成红色化合物，是 为VP试验阳性。大肠杆菌不能生成乙酰甲 基甲醇，故VP试验阴性，
接种。 穿刺接种法
此法主要用于半固体培养基、明胶 及双糖管的接种。
(1) 斜面琼脂培养基接
种法（2人一组） 大肠埃希菌/枯草芽
孢杆菌/葡萄球菌
用接种环挑菌后在 斜面表面划折线
送培养24小时(2支/组) 一组 37℃温箱 一组 60℃温箱 一组 4℃ 冰箱
(2) 液体培养基接种法（2人一组）
1. 菌种 (任选一种） 大肠埃希菌/枯草芽