细胞爬片步骤

细胞爬片染色步骤

免疫组化法：
1 胰酶消化细胞，收集至离心管；调整样本细胞数为1×106/ml；
2 将单细胞悬液滴加至平皿内无菌载玻片表面，置于37℃ 5%的加湿CO2孵箱中过夜，使细胞爬片。

3 吸弃平皿内培养上清，加入新鲜培养基，用无菌培养基洗3次；
4 PBS冲洗相应方案的载玻片3次；
5 将载玻片置于95%乙醇中固定约1h；
6 倒置相差显微镜下观察，并划定载玻片上细胞爬片密集区；
7 在相应区域滴加按一定比例稀释后一抗，4℃冰箱内过夜湿孵。

阴性对照以PBS缓冲液代替一抗。

8 先暂复温30min，后PBS冲洗载玻片3次；
9 滴加二抗，室温湿孵30min；后PBS冲洗载玻片3次；
10 DAB显色：将配置好的DAB溶液滴加至载玻片上，室温下孵育3min至载玻片略显黄色；
11 清水充分冲洗载玻片，苏木素复染核3-5min，清水冲洗，盐酸酒精分化20s，清水冲洗，氨水返蓝3min，清水冲洗，后置于75%-80%-95%-无水酒精中脱水，每步骤约2min；
12 将载玻片置于1、2、3道二甲苯中，各约15min，中性树脂封片，置于阴凉通风处风干。

细胞爬片固定及免疫荧光的操作步骤

细胞爬片固定及免疫荧光的操作步骤细胞爬片：1.埋板准备：准备含有合适培养基的细胞培养板或培养皿。

将培养基预热至适宜的温度。

2.细胞处理：将需要爬片的细胞株从库存中取出，用PBS（磷酸盐缓冲液）或无酶胰蛋白酶溶解细胞外基质粘附，用培养基洗涤细胞。

3.细胞计数：用血细胞计数板或细胞计数仪计数细胞浓度，然后根据需要调整到合适的细胞密度。

4.接种细胞：将适量的细胞接种到埋板中，根据实验要求可以采用单细胞克隆或稀释传代法。

5.培养细胞：将埋板放入细胞培养箱的适当环境中，通常为37°C、5%CO2的培养箱。

根据实验需要，培养时间可以从几小时到几天不等。

固定：1.筛选固定剂：选择适合的固定剂，常用的固定剂包括乙醛和甲醛等。

2.固定细胞：使用适当的浓度的固定剂，将培养的细胞浸泡在固定剂中，通常需要15-30分钟的固定时间。

3.洗涤细胞：使用PBS等缓冲溶液洗涤固定的细胞，去除多余的固定剂。

免疫荧光：1.孔板准备：将需要进行免疫荧光染色的细胞或组织培养在培养皿或孔板中。

2.阻断非特异性结合：用0.1-5%BSA或牛血清等蛋白质溶液阻断非特异性结合位点，减少假阳性信号。

3.一抗染色：加入适当浓度的一抗（具体浓度由厂家确定）到需要染色的细胞上，对于细胞表面的抗原，可以直接在细胞外孔板中加入一抗。

4.清洗：用PBS或相应的缓冲液洗涤一抗残余的溶液。

5.二抗染色：加入与一抗同种小鼠或兔子抗体的特异性抗体（如荧光素、奥林染色试剂等）到孔板中，适当的浓度需根据实验所需，与一抗使用的缓冲液一致。

6.清洗：用PBS或相应的缓冲液洗涤二抗残余的溶液。

7.成图：用荧光显微镜观察样品，利用相应的激发波长和荧光滤镜观察和拍摄免疫染色的图像。

细胞爬片、固定和免疫荧光技术的步骤可以根据具体实验的要求进行调整和优化。

这些操作步骤在细胞和分子生物学研究中非常重要，可以用于检测和观察各种细胞结构和分子的表达和分布。

整个过程需要细心和耐心，并且需要严格控制各个步骤的条件以确保实验结果的准确性和可重复性。

细胞爬片制作

细胞爬片全过程经验总结细胞爬片的制备是免疫细胞化学、免疫荧光、TUNEL凋亡检测的第一步，也是获得一份漂亮的实验结果的关键步骤。

Easylabs站长根据自已多年的经验，奉献此文，希望对大家的实验有所帮助。

【爬片的准备】1.爬片可用一般的盖玻片，也可用专用爬片；2.应用盖玻片，可根据自己的需要剪裁成合适的大小，以备置于6孔板、12孔板或24孔板；裁剪时可用前护士输液用于打开玻璃安瓶的小沙轮，或者是口腔科的那种小沙轮，轻轻划一下后，稍用力一掰就分开了。

如果接种大皿的话，我一般不将盖玻片切开，直接清洁后放入培养皿中，到染色时再将之切开，这样既保证了细胞均一性，又可同时做几个指标的染色。

3.将剪裁好的爬片，置于浓硫酸中浸泡并过夜，第二天先用自来水冲洗20遍，再置于无水酒清中浸泡6小时，再用三蒸水冲洗3遍（个人认为主要目的是将酸冲洗干净就可以了，如果不干净的话，细胞帖壁不好），放在饭盒或者玻璃培养皿中烘干后进行高压消毒。

4.高压后取出放入烤箱中烤干，备用。

烤干后可放入超净台中。

5.关于多聚赖氨酸，很多人都将玻片用此处理，以使细胞与玻片结合更牢。

但我在做爬片时从来没用过多聚赖氨酸，细胞贴壁仍然很好，且在做后续的免疫细胞化学染色、TUNEL 等凋亡检测、免疫荧光等也从未脱过片。

【细胞爬片】1.胰酶消化细胞后计数重悬细胞于完全培养基中。

2.加细胞时，根据玻片的大小，先在每个孔里准备放爬片的位置滴少量培养基，目的是使玻片与培养皿靠培养基的张力粘合到一起，然后放玻片，防止加细胞悬液时玻片漂起，造成双层细胞贴片。

整个过程注意无菌操作。

3.根据自己的需要选择合适的细胞密度种入培养板内即可4.待细胞贴壁后，可去上清加含药培养基。

5.按照实验设计，作用一定时间后取玻片。

取玻片时由于玻片与培养皿底结合较紧，张力较大，我一般将注射器针头针尖向背面弄个小钩，这样将爬片轻轻勾起，用小镊子取出就可以了。

如果要做诸如24h，48h，72h等这样时间点的实验的话，将所需数量的爬片取出时应用酒精灯火焰烧一下针头和镊子。

免疫荧光染色-爬片 2

这是针对细胞爬片的免疫荧光染色标准步骤：
1）实验前一天，将细胞接入铺有22×22mm（或24×24mm）盖玻片的六孔板中。

2）第二天，待细胞汇合度达到70％左右开始进行染色步骤。

3）用新鲜配制的2％（或4％）多聚甲醛固定细胞10分钟。

4）PBS洗三遍，每次5分钟。

5）用0.2-0.5％ triton X-100（PBS配制）对细胞透化处理10分钟。

6）PBS洗三遍，每次5分钟。

7）2％BSA或者10％二抗同源血清（注意一定要是正常血清）封闭30分钟，PBS 洗两遍。

8）加入1抗，室温孵育1 小时。

9）PBS洗三遍，每次5分钟。

10）加入二抗，室温孵育30-45 分钟。

11）PBS洗四遍，每次5分钟。

12）加入0.5 ug/ml DAPI（PBS配制）染色10分钟（这里也可用其它的染核染料如hoechst 33258）。

13）用PBS洗三遍，去除多余的DAPI。

14）加入20 ul封片剂封片。

15）封片好的细胞样品可于4度冰箱中存放2周以上。

注意步骤5-7在某些蛋白的染色步骤中可能不是必须的，一抗如果有多种（但注意要是不同种属的）可以同时孵育，二抗同时使用时最好是同一种属来源（如驴抗兔，驴抗羊，驴抗鼠），以避免二抗间的交叉反应。

如果是组织切片样品，可能还涉及到样品的染色前处理（比如石蜡切片的脱蜡），请参阅其它的说明，但荧光染色步骤是一样的。

如果要做细胞涂片的免疫荧光染色，需用离心涂片机将细胞固定在玻片上，再进行后续步骤。

细胞生物学实验-细胞爬片

二、实验目的
1．巩固细胞传代技术。 2．掌握细胞爬片的方法。 3. 为细胞骨架的观察提供实验材料
三、实验材料及设备
1.细胞 CHO细胞、鸡胚成纤维细胞、HeLa
2.试剂 DMEM培养基、血清、抗生素、胰酶
3.仪器
超净工作台、CO2培养箱、倒置相差显微镜
4.其它用品：盖玻片（无菌）、35mm细胞培养皿（六孔板）、试管、移液管，滴管，酒精灯、75％酒精棉球、废液缸。
细胞传代（II） -------细胞爬片
2018.10.19
一、实验原理
1.细胞爬片
细胞爬片就是让玻片浸在细胞培养基内，细胞在玻片上生长，主要用于组织学，免疫组织化学，切片，细胞涂片，原位杂交等。
细胞爬片采用的玻片可以是普通的盖玻片也可以用细胞爬片专用玻片。使用普通盖玻片时，要按照玻璃器皿的清洗方法进行清洗，并进行高压灭菌。专用玻片通常已经过处理可直接使用。
6. 加两滴管含10%FCS的DMEM培养基反复冲瓶壁上的细胞层，至全部冲下，滴管轻轻吹打，混匀，成细胞悬液，细胞计数，将细胞稀释成1105/mL）
7. 在35mm培养皿中加入1 mL细胞悬液+1 ml完全培养基，镜下观察细胞密度和状态，标记细胞名称及操作者。
8. 将细胞放入5%CO2、37℃培养箱培养，至下次课期间换液即可。
9. 整理实验用品。
下次课内容：细胞骨架及细胞核染色 11月2日：期中考试（已学操作，无菌规范）
四、实验步骤：
1. 将超净台内物品，按照无菌操作要求摆放。
2. 用灭菌小镊子将处理好盖玻片轻轻放入35mm培养皿中。
3. 打开细胞瓶盖并在酒精灯上轻轻烧口消毒，倒掉或吸出培养基。细胞层，弃胰酶，再加入一滴管胰酶，盖好瓶盖。

细胞爬片步骤PLL配制和处理（Sigma产品，武汉博士德分装，10ml/瓶。

4℃存放，有效期1年）(1) 储存液：1:10稀释液可以保存在4℃里，三个月内仍然可以使用。

稀释、储存和吸取多聚赖氨酸要使用塑料制品。

工作液：0.1%( w/v)PLL，用移液枪吸取0.3ml PLL＋3ml无菌去离子水，混匀放于10ml 无菌塑料离心管中。

封口模密封后4℃存放。

(2) 无菌处理：PLL不可以高温消毒，故应过滤除菌分装于无菌处理的细胞冻存管内，1ml/管，封口模密封，4℃保存。

另外，准备无菌去离子水50ml。

多聚赖氨酸PLL包被（1）灭菌的去离子水(三蒸水)1:10稀释多聚赖氨酸溶液。

（2）用之前将稀释的多聚赖氨酸溶液放在室内，使其温度维持在18-26℃。

（3）将玻片浸在稀释的多聚赖氨酸溶液5分钟。

（注意增加时间不会提高包被效果）。

（4）将过滤除菌的多聚赖氨酸加入一个消毒好的培养皿(超净台内操作)，然后将高压灭菌的小玻片放到多聚赖氨酸内浸泡5min，无菌晾干即可。

（底面贴紧培养皿，存在包被PLL不好的可能，放入培养板孔内注意正反面！！）或者：铺片于培养皿中，移液枪将PLL 工作液滴加于玻片上，室温10分钟后，用消毒好的纱布条吸取玻片上的PLL液。

在超静台内风干后使用，或者超静台内过夜晾干，次日使用。

或者：在60℃烘箱1小时干燥，或室温18-26℃过夜干燥待用。

步骤：（1）准备24孔细胞培养板（消毒好的培养皿）（2）多聚赖氨酸PLL包被（3）培养板每孔中滴1滴培养基，然后将玻片置于液滴上，压紧（通过表面张力的作用将玻片吸附于培养板上）（4）常规细胞消化，离心，重悬，将吹打的细胞悬液分别加到每个孔盖玻片上，让其贴壁生长，可以用移液枪加样30μl于盖玻片上（5）24孔板做完细胞爬片后，再小心用镊子将爬片取出，细胞面朝向载玻片，用中性树胶封片，照相。

（主张用20%-50%甘油封片，中性树胶封的不好容易“花片”）（6）PBS洗涤，以去除血清等物质。

细胞爬片免疫组化步骤

1.转染48小时后，弃去旧液，1ml PBS洗两遍用BD公司的固定透膜液400ul （Fixation and Permeabilization Solution）于4度冰箱内固定透膜20分钟后，PBS洗两遍
2.用弯曲的针头挑起爬片，镊子夹出置于载玻片上，内源性过氧化物酶阻断剂室温（无色液体）孵育10分钟
3.吸水纸吸去阻断剂后将玻片在摇床上PBS中洗3次，每次5分钟。

（若洗的次数多则细胞脱片程度也有可能加大，摇洗的力度也不宜过高）
4.滴加试剂A（蓝色液体）室温孵育10分钟，用吸水纸从一侧吸去，勿洗。

5滴加20倍稀释的单抗，800倍稀释的感染血清，于湿盒内37度孵育2小时。

6.吸水纸吸去稀释后的一抗，在摇床上PBS洗3次，每次5分钟。

7.滴加试剂B（黄色液体）室温孵育10分钟。

8.吸水纸吸去试剂B后，于摇床上PBS洗3次，每次5分钟。

9.滴加试剂C（橙色液体）室温孵育10分钟。

10.吸水纸吸去试剂C后，于摇床上PBS洗3次，每次5分钟。

11.显色剂DAB显色。

细胞免疫荧光实验步骤

细胞爬片免疫荧光实验步骤第一天：1. 在培养板中将已爬好细胞的玻片用PBS浸洗3次，每次3min；2. 用4%的多聚甲醛固定爬片15min， PBS浸洗玻片3次，每次3min；3. 0.5%Triton X-100( PBS配制)室温通透20min（细胞膜上表达的抗原省略此步骤）；4. PBS浸洗玻片3次，每次3 min，吸水纸吸干PBS，在玻片上滴加正常山羊血清，室温封闭30min；5. 吸水纸吸掉封闭液，不洗，每张玻片滴加足够量的稀释好的一抗并放入湿盒，4℃孵育过夜；第二天：6. 加荧光二抗： PBST 浸洗爬片3次，每次3min，吸水纸吸干爬片上多余液体后滴加稀释好的荧光二抗，湿盒中20-37℃孵育1h，PBST浸洗切片3次，每次3min；注意：从加荧光二抗起，后面所有操作步骤都尽量在较暗处进行。

7. 复染核：滴加DAPI避光孵育5min，对标本进行染核，PBST 5min×4次洗去多余的DAPI；8. 用吸水纸吸干爬片上的液体，用含抗荧光淬灭剂的封片液封片，然后在荧光显微镜下观察采集图像。

细胞免疫荧光步骤1.在24孔板里加500微升培养基，放爬片，接种细胞（做实验以30-50%汇合度较好。

10000-30000左右2.给药处理24h。

3.PBS洗三遍。

4. 4％冷的多聚甲醛固定15分钟，PBS洗三遍，每次5min，摇床。

（避光）5.0.5％Triton X－100（PBS配）破膜15min，PBS洗三遍，每次5min，摇床。

6.5%BSA （牛血清白蛋白，PBS配）封闭60分钟,不用洗。

7.加一抗孵育（5%BSA配），4℃摇床过夜。

8. 收集一抗，PBS洗三遍，每次5min，摇床。

孵育二抗Alexa Fluor 488（1:1000 ）,室温60min（避光）9. 回收二抗，PBS洗三遍，摇床，每次5min。

10. 0.5ug/mLDAPI（5%BSA配，2滴/ml）染核15min。

细胞爬片制备详细过程.doc

【爬片的准备】1.爬片可用一般的盖玻片，也可用专用爬片；2.应用盖玻片，可根据自己的需要剪裁成合适的大小，以备置于6孔板、12孔板或24孔板；裁剪时可用前护士输液用于打开玻璃安瓶的小沙轮，或者是口腔科的那种小沙轮，轻轻划一下后，稍用力一掰就分开了。

如果接种大皿的话，我一般不将盖玻片切开，直接清洁后放入培养皿中，到染色时再将之切开，这样既保证了细胞均一性，又可同时做几个指标的染色。

3.将剪裁好的爬片，置于浓硫酸中浸泡并过夜，第二天先用自来水冲洗20遍，再置于无水酒清中浸泡6小时，再用三蒸水冲洗3遍（个人认为主要目的是将酸冲洗干净就可以了，如果不干净的话，细胞帖壁不好），放在饭盒或者玻璃培养皿中烘干后进行高压消毒。

4.高压后取出放入烤箱中烤干，备用。

烤干后可放入超净台中。

5.关于多聚赖氨酸，很多人都将玻片用此处理，以使细胞与玻片结合更牢。

但我在做爬片时从来没用过多聚赖氨酸，细胞贴壁仍然很好，且在做后续的免疫细胞化学染色、TUNEL等凋亡检测、免疫荧光等也从未脱过片。

【细胞爬片】1.胰酶消化细胞后计数重悬细胞于完全培养基中。

2.加细胞时，根据玻片的大小，先在每个孔里准备放爬片的位置滴少量培养基，目的是使玻片与培养皿靠培养基的张力粘合到一起，然后放玻片，防止加细胞悬液时玻片漂起，造成双层细胞贴片。

整个过程注意无菌操作。

3.根据自己的需要选择合适的细胞密度种入培养板内即可4.待细胞贴壁后，可去上清加含药培养基。

5.按照实验设计，作用一定时间后取玻片。

取玻片时由于玻片与培养皿底结合较紧，张力较大，我一般将注射器针头针尖向背面弄个小钩，这样将爬片轻轻勾起，用小镊子取出就可以了。

如果要做诸如24h，48h，72h等这样时间点的实验的话，将所需数量的爬片取出时应用酒精灯火焰烧一下针头和镊子。

末取出的可接着继续培养。

【细胞爬片的固定】细胞爬片取出后，一般用PBS洗2遍，然后再做固定。

当然，根据研究目的，PBS洗也不是一定要做的，比如做凋亡的TUNEL染色时就避免洗，因为凋亡的细胞在洗的过程中有可能会脱落。

细胞爬片步骤与方法

细胞爬片是细胞培养中比较经常会用到的，现将自己操作的一些方法与技巧拿与大家分享，如有不当的地方还望大家给与指正：【爬片的准备】1、爬片可用一般的盖玻片，也可用专用爬片；2、应用盖玻片，可根据自己的需要剪裁成合适的大小，以备置于6孔板、12孔板或24孔板；3、将剪裁好的爬片，置于浓硫酸中浸泡并过夜，第二天先用自来水冲洗20遍，再用三蒸水冲洗3遍（个人认为主要目的是冲洗干净就可以了），放在饭盒或者培养皿（一定是玻璃的哦，要不然就……）中烘干后进行高压消毒。

【培养板的准备】1、泡酸过夜2、冲洗，烘干（1、2步骤与前大致相同）3、放入超净工作台用紫外线照1～2小时就可以用了（在照之前可以将爬片一并放入，若细胞贴壁能力不强，可经多聚赖氨酸浸片后放入。

贴壁能力强的话，就可以省略了，进行紫外线消毒）注：此步自己的经验是爬片可以先浸入消毒后的PBS内，紧接着放入培养板内。

目的：浸过PBS 的爬片依靠表面的液体，可以用培养板孔底贴和紧密，以利于细胞长到爬片上。

（自己刚开始做的时候，经常就是细胞全都长在了爬片与培养板之间，爬片上细胞罕见。

）【细胞爬片】1、胰酶消化细胞后计数2、根据自己的需要选择合适的细胞密度种入培养板内即可3、第二天即可进行干预措施用甲醇:丙酮=1:1新鲜配置固定,适用于一切培养细胞,效果不错!不需要预冷,固定时间大概要10分钟,各种细胞均适用.用PBS溶解（使用前用盐酸和碳酸氢钠调节ph值为7.2（PH值不影响溶解性））一般浓度都是5mg/ml。

我用磁力搅拌器搅拌溶解的，千万不要加热。

搅拌时，烧杯上面要套上一个遮光的袋子（我用袋装牛奶袋），不到10分钟，见完全溶解。

尽快用0.22um 的微孔滤膜过滤。

分装至已经高压过ependoff管中，每管1.0ml.（－20度保存），余下一部分4度保存，两周内使用。

我做了好多次，发现没有问题。

祝好运！。

细胞爬片制备

细胞爬片制备细胞爬片制备是一种常用的实验技术，用于研究细胞的形态、结构和功能。

本文将介绍细胞爬片制备的原理、步骤和注意事项。

一、原理细胞爬片制备是通过将细胞附着在载玻片上，使其保持形态并能够观察和分析。

一般来说，细胞爬片制备包括以下几个步骤：细胞培养、处理、固定和染色。

二、步骤1. 细胞培养：将需要研究的细胞株培养在含有合适培养基的培养皿中，确保细胞的健康生长。

2. 处理：根据实验需要，给予细胞相应的处理，例如添加药物、激素或基因转染等。

3. 固定：用适当的固定剂处理细胞，使其保持在原位，不发生移动或变形。

4. 染色：使用合适的染料对细胞进行染色，以便观察细胞的形态和结构。

三、注意事项1. 细胞培养要注意无菌操作，避免细胞受到污染。

2. 处理细胞时要根据实验设计进行，注意处理时间和浓度的控制。

3. 固定细胞时要选择合适的固定剂和浓度，避免对细胞造成损伤。

4. 染色时要选择适当的染料，并按照染色剂的使用方法进行操作，避免染色不均匀或过度染色。

四、实验结果的分析与展示细胞爬片制备完成后，可以使用显微镜观察细胞的形态和结构，并进行图像的采集和分析。

可以根据实验的需要，选择合适的显微镜镜头和放大倍数，获得清晰的细胞图像。

通过图像分析软件可以对细胞的形态、大小、数量等进行定量化分析，进一步研究细胞的功能和特性。

细胞爬片制备是细胞生物学研究中常用的技术方法之一，可以帮助科研人员观察和分析细胞的形态和结构。

通过细胞爬片制备，可以了解细胞的生理状态和功能，对细胞的研究提供重要的实验依据。

在进行细胞爬片制备时，需要注意细胞的培养、处理、固定和染色等步骤，以及实验结果的分析和展示。

只有掌握了细胞爬片制备的技术原理和操作要点，才能获得准确、可靠的实验结果，推动细胞生物学的发展。

细胞爬片制作(Hela细胞为例)

细胞爬片SOP（以Hela为例）
1、在六孔板中加入细胞爬片，然后铺上5X105个细胞培养24h.
2、待细胞贴壁后，配制转染混合液，将2ugDNA加至250ul无血清DMEM中混匀，室温静置5min；加5ul soinfection 转染试剂加至250ul 无血清DMEM中混匀，室温静置5min；然后将两者混匀室温孵育30min.
3、将转染混合液缓慢而分滴加至6孔板中培养48-72h
4去细胞上清，用PBS清洗2次，新配80%冷丙酮固定液加入细胞中，室温作用10min，
5、PBS洗2遍，每次洗5min。

加入2%BSA（每孔500ul）封闭30min，再次PBS清洗两次
6、加入0.1% Triton-X100（每孔500ul）孵育10min,PBS清洗两次
7、加入稀释好的一抗（每孔50ul）至孔板中间部位，室温孵育1h。

8、PBS清洗3次，加入稀释好的二抗（每孔50ul）至孔板中间部位，室温孵育1h。

9、用PBS清洗三次后进行细胞核染色。

加1:200稀释好DAPI染色，室温作用30min。

10、用PBS清洗2次后，将爬片取出，用吸水纸吸干表面水并去除周边细胞，用记号笔圈出孵育抗体的细胞。

11、滴一滴封片剂在载玻片上，然后将细胞爬片倒放在载玻片上，用白色指甲油封片。

细胞爬片RNA FISH具体步骤及说明

细胞爬片RNA FISH具体说明及步骤一、检测原理RNA荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization），简称为RNA FISH，是一种重要的非放射性原位杂交技术。

传统的RNA FISH，直接在oligos上标记荧光素，根据碱基互补配对原则，与待检测的RNA特异结合，通过荧光显微镜以检测荧光信号，该方法一般需要20个oligos以上，以便检测到较强较多的荧光信号点。

本系统中SA（链霉亲和素蛋白）是一类四聚体蛋白，大小为66KDa，每一分子SA能够与四分子生物素进行高度特异性的结合，且两者之间的亲和力较强。

应用该原理，我们将染料Cy3偶联到SA蛋白上，一分子SA能偶联上6个Cy3；同时在探针上标记生物素，将两者在体外进行亲和连接，大约每个SA能与4条oligo-Biotin结合，每个SA上有6个Cy3，也就是每一条探针上连接了6个Cy3，因此该方法具有一定的放大信号的作用二、实验方法贴壁细胞（以48孔板为例）1.按照1×104细胞/孔的密度将贴壁细胞接种于48孔板（孔内提前放入已处理好的且大小合适的盖玻片）中（建议事先铺在Confocal专用培养皿中），于培养箱中培养过夜；2.吸弃培养基，PBS洗两次，每次5min；3.吸弃PBS，每孔加入100μl 4%多聚甲醛，室温固定15min；4.吸弃4%多聚甲醛，每孔加入100μl 0.5% Buffer A（现用现配）室温处理细胞15min（细胞通透）；5.吸弃0.5% Buffer A，PBS洗两次，每次5min；6.每孔加入100μl 1×封闭液，37°C孵育30min；7.吸弃1×封闭液，每孔加入100μl 2×Buffer C，37ºC培养箱放置30min；8.Buffer E提前在73ºC水浴锅孵育30 min，至澄清透亮；探针稀释：可参看标签或报告单上所示参数：nmole/OD260，例如：nmole/OD260= 4.17，则在每OD探针干粉制品中加入41.7μl灭菌DEPC水，混匀后即得浓度约为100μmol/L的储存液，建议进行分装后避光储存于-20°C，避免多次冻融操作；10.配制探针工作液：将探针储存液稀释至1μmol/L，放入75°C水浴锅变性10min，然后与SA-Cy3按比例加入到PBS，（以10μl体系为例，即1μl 1μmol/Lbiotin-probe+1μl1μmol/LSA-Cy3+8μl PBS），37度孵育30min（可做预实验确定探针和SA-Cy3的比例，例如1:1，2:1，4:1，8:1等）；11.将上述10μl探针工作液和90μl Buffer E混匀；12.吸弃2×Buffer C，每孔加入100μl变性后的探针混合液，采取避光措施后置于37ºC培养箱中杂交过夜（12-16h）；13.杂交次日，将样本从37ºC培养箱取出，吸弃探针混合液，每孔加入100μl0.1% Buffer F于37ºC洗涤10min；14.吸弃0.1% Buffer F，每孔加入100μl的2×Buffer C，60ºC洗涤10min，洗涤3次；15.吸弃2×Buffer C，每孔加入100μl 的2×Buffer C，37°C洗涤10min，洗涤3次；（如果背景深时，建议适当提高洗涤温度及次数）16.吸弃2×Buffer C，每孔加入100μl稀释后的DAPI工作液，避光染色10 -20min；17.吸弃DAPI工作液，PBS洗涤2次，每次5min；18.滴加甘油或抗淬灭剂，盖上盖玻片，封片胶封片于荧光显微镜下观察。

细胞爬片实验操作步骤

细胞爬片实验操作步骤嘿，咱今儿就来唠唠细胞爬片实验操作步骤这档子事儿！细胞爬片实验啊，就像是一场精心编排的舞蹈，每一步都得踩在点儿上。

先得准备好那些个“舞台道具”，什么培养皿啦、细胞啦、盖玻片啦，一个都不能少。

把盖玻片小心翼翼地放进培养皿里，这就好比给舞台搭好了架子。

然后呢，就是把细胞这个主角请出来啦！把细胞混悬液均匀地滴在盖玻片上，可别滴多了也别滴少了，这就跟做饭放盐似的，得恰到好处。

滴完后，轻轻地把培养皿放进培养箱里，让细胞在里面舒舒服服地生长。

过了一段时间，等细胞长到差不多了，就得给它们来点特别照顾啦。

这时候要给细胞进行固定，就像是给它们拍张定妆照，让它们乖乖地待在那儿。

固定好了，接下来就是染色啦！这可真是个神奇的过程，就像给细胞穿上了漂亮的彩衣。

不同的染色剂能让细胞呈现出不同的模样，有的红啦，有的蓝啦，可有意思了。

染完色，还得把多余的染色剂洗掉，可不能让细胞花里胡哨的。

然后呢，把爬片取出来，放在显微镜下观察。

哇塞，你就能看到细胞们在那小小的世界里活动啦，就像在看一场微观世界的大戏！你说这细胞爬片实验有趣不有趣？就好像我们在操控着一个小小的细胞世界，看着它们成长、变化。

这过程中可不能马虎，一个不小心可能就前功尽弃啦。

所以得打起十二分精神来，每一步都要仔仔细细的。

做细胞爬片实验，不就跟我们过日子一样嘛，得用心经营，每一个环节都不能马虎。

你想想，要是做饭的时候盐放多了或者火候没掌握好，那做出来的菜能好吃吗？同理，细胞爬片实验要是哪个步骤没做好，那得出的结果能可靠吗？所以啊，咱做这个实验的时候，就得像个细心的大厨，精心烹制每一道“细胞大餐”。

只有这样，才能让我们看到细胞最真实、最美丽的一面呀！你说是不是这个理儿？总之呢，细胞爬片实验操作步骤可不能小瞧，得认真对待。

这可不仅仅是个实验，更是我们探索微观世界的奇妙之旅啊！让我们一起在这个小小的细胞世界里遨游吧！。

细胞爬片

第一，盖玻片需要过酸，并且自来水、蒸馏水冲洗干净。

两张或者以上的玻片很容易因为虹吸作用粘到一起，很容易冲不干净，很容易把两张完全重叠在一起的玻片当成一张，一定要看清楚，晾干片子最好是在消毒饭盒中进行，饭盒底面放上纱布，将玻片斜靠在饭盒侧壁，玻片正面不要接触纱布，否则会粘上毛毛的。

然后高压蒸汽灭菌，烤箱中烤干。

第二，爬片前最好用多聚赖氨酸或者层粘蛋白或者胶原溶液处理玻片，未处理过的细胞不容易贴壁，细胞系还好，原代细胞很少能贴得牢。

这一步至关重要，否则在后面用PBS洗片时很容易将细胞洗掉。

用这些促进细胞贴壁的溶液处理玻片后，放到培养皿之前需要用培养基冲洗一到三遍！层粘蛋白和胶原还好，多聚赖氨酸有几次我没冲结果细胞全部不贴壁。

第三，传代消化下来的细胞一定不要过多稀释，将浓一点的细胞悬液吹打混匀后滴在玻片上，几个小时后再追加培养基。

第四，玻片在培养皿中容易漂起，如果事先在皿中铺上液体很可能会不容易揭下来，或者揭下来时出印子在镜下很难看。

漂起的玻片很容易两面都培养出细胞的，这时背面的细胞必须去除，挺难操作的，用PBS冲洗可能会伤到正面的细胞，用小镊子夹玻片很容易夹碎，也很容易脱落，小心点好。

第五，将玻片拿出后一定要记好哪边是正面，最好做玻片时将玻片切成长方形的。

目前市场售的多为18mm x 18mm的盖玻片，或者24mmx24mm的盖玻片，正方形，很难分辨反正面，在某个角上打个缺口，对正方形是不中用的。

可以用小砂轮切一下改成长方形，至于在某个角上用砂轮做个标记，理论上很简单，实际操作有难度。

第六，上面步骤都没问题后，玻片就需要进一步处理了，这里有几个细节，分述如下：1.PBS对玻片是冲洗还是浸泡，我个人认为浸泡好，我吃过冲洗的亏，每一步后都要冲洗2-3次，有时还没等试验做完，大部分细胞已经被冲掉了，呵呵！我当时欲哭无泪啊！2.4%的多聚甲醛或者别的固定液的温度是多少，有人认为4°C的好，有人认为37°C的好，我个人感觉，娇贵的原代细胞先在常温下固定较好，然后放到4°C冰箱中。

制作细胞爬片的方法

制作细胞爬片的方法细胞爬片是一种常用的实验技术，用于研究细胞的结构与功能。

通过制作细胞爬片，可以观察细胞的形态、活动和相互作用，从而揭示细胞的生理和病理过程。

本文将介绍几种常用的制作细胞爬片的方法。

一、细胞培养制作细胞爬片首先需要进行细胞培养。

细胞培养可分为原代细胞培养和细胞系培养两种方式。

1. 原代细胞培养原代细胞是从组织或动物体内获得的初代细胞，其细胞增殖能力有限。

原代细胞培养需要先将组织切碎，并经过消化和传代培养扩增细胞数量。

培养基的选择应根据细胞类型的不同，可使用DMEM、RPMI-1640等培养基，并添加适当的血清、生长因子等。

2. 细胞系培养细胞系是指从组织中分离出来的，具有细胞无限增殖能力的细胞。

细胞系培养相对简单，常用的细胞系包括HeLa、293T等。

培养细胞系需要使用与细胞类型相匹配的培养基，并注意保存细胞的纯度和稳定性。

二、细胞准备在制作细胞爬片之前，需要将细胞转移到玻璃基质上以形成单层细胞。

以下是几种常见的细胞准备方法。

1. 机械刮取法机械刮取法是一种简单有效的细胞准备方法。

将培养皿中的细胞用细胞刮刀轻轻刮去，使细胞均匀地分布在玻璃基质上。

2. 酶消化法酶消化法适用于粘附性较强的细胞。

将培养皿中的细胞用适量的胰蛋白酶等酶溶液消化，使细胞悬浮于培养基中。

然后将细胞悬浮液加入预先涂覆在玻璃基质上的培养皿中，适当晃动培养皿以均匀分布细胞。

3. 离心沉积法离心沉积法适用于较大颗粒的细胞，如神经元等。

将细胞悬液离心，去除上清液后，用滴管吸去细胞上清液，仅保留底部的细胞沉淀。

然后将培养基加入沉淀中，并用移液管轻轻混合，将细胞均匀分布到玻璃基质上。

三、固定和染色为了使细胞保持在制作的细胞爬片上并保持形态完整，需要对细胞进行固定处理。

固定可选择用甲醛或乙醇等化学物质固定。

1. 甲醛固定法将4%甲醛溶液加入适量的PBS缓冲液中，将制备好的细胞爬片浸泡于甲醛溶液中，固定15-30分钟后，用PBS洗涤细胞片数次，使甲醛完全去除。

实验报告-细胞爬片

细胞生物学实验报告实验三细胞爬片1引言1.1 实验目的1．巩固细胞传代技术。

2．掌握细胞爬片的方法。

3. 为细胞骨架的观察提供实验材料。

1.2 实验原理细胞爬片：细胞爬片就是让玻片浸在细胞培养基内，细胞在玻片上生长，主要用于组织学，免疫组织化学，切片，细胞涂片，原位杂交等。

细胞爬片采用的玻片可以是普通的盖玻片也可以用细胞爬片专用玻片。

使用普通盖玻片时，要按照玻璃器皿的清洗方法进行清洗，并进行高压灭菌。

专用玻片通常已经过处理可直接使用。

2实验仪器、试剂及操作步骤2.1 实验仪器超净工作台、倒置相差显微镜、CO2培养箱、酒精灯、75％酒精棉球、酒精喷壶、试管架、滴管筒（头）、废液缸、镊子、玻璃平皿、盖玻片（无菌）、35mm细胞培养皿（六孔板）、培养瓶等2.2 实验试剂DMEM培养基、血清、抗生素、胰蛋白酶消化液等2.3 实验材料鼠胚成纤维细胞、鸡胚成纤维细胞2.4 实验步骤1.实验室和超净工作台消毒，紫外照射20Min左右。

2.穿好实验服，进无菌室前穿鞋套、洗手。

3.关闭紫外灯，开日光灯和开风机，超净工作台台面应整洁，用75%酒精擦双手消毒，擦拭台面。

4.在显微镜下观察细胞生长状况。

5.用灭菌小镊子将处理好盖玻片轻轻放入35mm培养皿中。

6.打开细胞瓶盖并在酒精灯上轻轻烧口消毒，倒掉或吸出培养基。

7.加一滴管胰酶轻轻漂洗一下细胞，使其湿润整个细胞层，弃胰酶，再加入一滴管胰酶，盖好瓶盖。

8.显微镜下观察细胞的消化状态，待细胞大部分收缩、突起、变圆，细胞边界清晰时，即可竖立或翻转培养瓶停止消化，在超净台内靠近火焰处弃胰酶。

9.加两滴管的DMEM培养基反复冲瓶壁上的细胞层，至全部冲下，滴管轻轻吹打，混匀，成细胞悬液，进行细胞计数。

取少量细胞悬液与EP试管里，检查计数板并清洗，先将盖玻片安放在计数室上面，然后摇匀样品取悬液，从盖玻片边缘滴加细胞悬液，连续2-3次，直至充满计数板和盖玻片间的空隙。

将加好样品的计数板置于显微镜载物台的中央，然后按下列步骤操作：1）找计数室，先在低倍镜下寻找计数板上的大方格位置。

免疫荧光-做实验不会制备“细胞爬片”怎么行？

免疫荧光-做实验不会制备“细胞爬片”怎么行？我们在做免疫荧光（IF），激光共聚焦(Confocal)，凋亡检测（TUNEL）时，免不了要制备细胞爬片，爬片质量完全决定了最后拍照的质量以及实验数据的精准性。

今天，医学方小编就教大家如何制备好的细胞爬片。

爬片的准备1爬片可用一般的盖玻片，也可用专用细胞爬片（价格比较昂贵）但是细胞贴壁牢固，拍出照片效果好；2可根据自己的需要，到染色时再将之切开，这样既保证了细胞均一性，又可同时做几个指标的染色剪裁成合适大小，置于6孔板、12孔板或24孔板；细胞爬片（以常用24孔板为例）1胰酶消化细胞后计数重悬细胞于完全培养基中。

2加细胞时，根据玻片的大小，先在每个孔里准备放爬片的位置滴少量培养基，目的是使玻片与培养皿靠培养基的张力粘合到一起，然后放玻片，防止加细胞悬液时玻片漂起，造成双层细胞贴片。

整个过程注意无菌操作，玻片是无菌处理的，可以酒精灯外火焰附近做。

3根据自己的需要，选择合适的细胞密度（细胞太密影响拍照效果），将计数分好的细胞混匀后铺到孔中，种入24孔板一个孔内即可。

4待细胞贴壁后，可去上清加处理组培养基。

5按照实验设计，作用一定时间后取玻片。

取玻片时由于玻片与培养皿底结合较紧，张力较大，小编会将注射器针头针尖向背面弄个小钩，这样将爬片轻轻勾起，用小镊子取出就可以了。

如果要做诸如24h，48h，72h等不同时间点实验的话，将所需数量的爬片取出时应用酒精灯火焰烧一下针头和镊子。

爬片细胞的固定处理以下为常用的固定液：1冷丙酮可用于一般的免疫组化染色。

将纯丙酮预先放入冰箱-20℃后便为冷丙酮（此温度不会为固体的）细胞爬片取出后，PBS洗2遍，加入冷丙酮于-20℃（丙酮有很强的挥发性，注意将含有丙酮和爬片的器皿盖严，防止其挥发）固定10min。

取出后，室温吹干，然后放入-20℃保存。

2多聚甲醛(常用4%)：避光保存，可用于免疫荧光以及TUNEL染色。

室温固定15-30min后，将表面液体吹干， -20℃保存395％乙醇，可用于免疫组化。

细胞爬片步骤

细胞爬片细胞爬片【玻片的准备】1. 爬片可用一般的盖玻片，也可用专用爬片；2．将剪裁好的爬片，置于浓硫酸中浸泡并过夜，第二天先用自来水冲洗20遍，再用三蒸水冲洗3遍，放在饭盒或者培养皿中烘干后进行高压消毒再烘干。

4.多聚赖氨酸处理玻片，以使细胞与玻片结合更牢。

【细胞爬片】1. 胰酶消化细胞后计数重悬细胞于完全培养基中。

2. 加细胞时，根据玻片的大小，先在每个孔里准备放爬片的位置滴少量培养基，目的是使玻片与培养皿靠培养基的张力粘合到一起，然后放玻片，防止加细胞悬液时玻片漂起，造成双层细胞贴片。

整个过程注意无菌操作。

3. 根据自己的需要选择合适的细胞密度种入培养板内即可。

4. 待细胞贴壁后，可去上清加含药培养基。

5. 按照实验设计，作用一定时间后取玻片。

取玻片时由于玻片与培养皿底结合较紧，张力较大，我一般将注射器针头针尖向背面弄个小钩，这样将爬片轻轻勾起，用小镊子取出就可以了。

将所需数量的爬片取出时应用酒精灯火焰烧一下针头和镊子。

【细胞爬片的固定】1.细胞爬片取出后，一般用PBS洗x2遍，然后再做固定。

2.室温固定15分钟后，弃去固定液，PBS洗3x3min，洗尽液体。

3.将表面液体吹干，入-20℃保存以下为常用的固定液（1）. 多聚甲醛(常用4%)：可用于免疫电镜；也可用于免疫荧光以及TUNEL染色。

主要检测组织内一些性能娇弱的抗原特别是细胞表面抗原，室温固定15分钟后，将表面液体吹干，入-20℃保存（2）. 甲醛(福尔马林)应用最广缺点：甲醛放置过久可氧化为甲酸，使溶液pH降低，影响染色；分子间交联形成的网格结构可能部分或完全掩盖某些抗原决定簇，使之不能充分暴露。

可造成假阴性的染色结果。

（3）. 冷丙酮可用于一般的免疫组化染色。

2 / 2（4）. 95％乙醇，可用于免疫组化。

优点：穿透性强、抗原性保存较好。

缺点：但醇类对低分子蛋白质、多肽及胞浆内蛋白质保存效果较差，使蛋白变性的作用轻，固定后可再溶解；染色过程中，温育时间长，抗原可流失而减弱反应强度。