HPLC实验讲义(研究生上课)
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+
固定相
_
+
Na + (BH
+ RSO 3 )
RSO 3 )
m
S
离子对
影响保留因子k的因素：
1) 固定相—C18
2）离子对试剂种类：烷基磺酸钠→分析碱 四丁基季铵盐→分析酸 离子对试剂浓度:10~30mmol/L 3）流动相的pH—由于离子对的形成依赖于试样
组分的离解程度。
等度洗脱？ 梯度洗脱？
A内 C 对 f A对 C内
A待 C内 C待 f A内
内标法优点：
a.由于操作条件的变化而引起的误差，都将同时反 映在内标物及欲测组分上而得到抵消，所以可得到较 准确的结果。多用在国际标准和规定比较严格、要求 比较高的方法中使用。 b. 定量结果与进样量无关，进样体积不要求准确。 所以毛细管气相色谱中较常用。
流动相极性越大， 流动相极性越大， 洗脱能力越大，k、 洗脱能力越小， tR均越小
tR越大
极性+离子对试剂
流动相极 性与k的 关系 组分出峰 顺序 应用
同反相键合相
极性大先出峰
非极性至中等极性
极性大后出峰 极性化合物
极性大先出峰 有机酸、碱、盐
固定相极性变化对分离的影响
ODS C8 TMS
分析条件
柱 : Shim-pack CLC-ODS 流动相 : MeOH : H2O = 7 :3 流速 : 1.0 mL/min 温度 : 40 C 进样体积 : 10 uL 检测器 : UV-254 nm
峰 1. 苯甲酸甲脂 2. 苯甲酸乙脂 3. n-苯甲酸丙酯 4. n-苯甲酸丁酯
定量方法：
1．归一化法 2．外标法 3．内标法
1、归一化法
前提：试样中所有组分都产生信号并能检出色谱峰
mi w i (% ) 100% m1 m 2 m 3 m n
Ai f i wi % 100% A1 f1 Ai f i An f n
同系物或结构异构体 i % C
注意冲洗次序，不能直接用 有机溶剂冲洗
反相离子对色谱法（IPC）— 较强电解质
对于某些易离解的有机酸、有机碱。如生物碱类、儿 茶酚胺类、有机酸类、维生素类和抗生素类。 例：牛磺酸
反相色谱中，在极性流动相中加入离子对试剂，使被测组分 与其中的反离子形成中性离子对，增加k和tR，以改善分离。
流动相
B H RSO 3Na BH+ RSO 3 ( BH
定量分析方法
定量依据 mi (或ci ) Ai
由于同一检测器对不同物质的响应值不同， 所以不能用峰面积来直接计算物质的量。
定量校正因子
f i' — 绝对校正因子（需要准 确知道进样量）
' mi fi Ai
f g — —相对校正因子（与操 作条件变化无关）
f i' mi Ai As mi fg ' f s m s As Ai m s
100%乙腈
60%乙腈
80%乙腈
50%乙腈
40%乙腈
2.改变有机溶剂类型
首选乙腈-水，乙腈黏度小，在低波长（185-210nm）下 无吸收，效果不好可改为甲醇-水、四氢呋喃-水 一些强亲脂性或强疏水性化合物，可选用高比例四氢 呋喃或四氢呋喃-乙腈（流动相中不含水，成为非水反向 液相色谱）
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
mV 500 400
Ethyl Paraben
200
100
0 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 min
Methyl Paraben
Butyl Paraben
300
Propyl Paraben
mV 500
400
Ethyl Paraben
200
基线 拖尾因子（不对称因子）
100 0
化学键合相色谱
硅氧烷Si-O-Si-C
R1 Si--OH + X--Si--R2 R3
R2=（CH2)3NH2(氨基柱）
R1 Si--O--Si--R2 + R3 HX
=(CH2)3CN（氰基柱）
=(CH2)2OCH2CH(OH)CH2OH（二羟基柱） =(CH2)17CH3（C18柱） =(CH2)7CH3（C8柱） =(CH2)3C6H3（苯基柱）
常用代表性的弱酸的pKa值
pK1 醋酸 柠檬酸 磷酸 4.87 3.13 2.16 4.76 7.21 6.40 12.32 pK2 pK3
缓冲液的使用注意事项：
使用前必须过滤 使用后一定要对柱子进行清洗 ，以免造成腐蚀、磨损及 阻塞:首先用5～10％的甲醇水溶液冲洗30-60min（0.51ml/min），再用甲醇冲洗30min(0.1-0.5ml/min) 易受到细菌和霉菌的影响
内标法缺点：
找合适内标物困难；
出峰顺序
极性强的物质先出峰
如果样品有
CH3CH2CH2--- : 碳链
: 芳香基
作用力强
如果样品有
-COOH -NH2 -OH
: 羧基 : 氨基 : 羟基
作用力弱
地西泮
5.9min
10.9min
1 2 1.甲醇-水（70:30） 2.甲醇-水（80:20）
有机溶剂比例越大，其表面张力越小，k也越小， 出峰越早。 加入电解质（如缓冲液或中性盐），表面张力随 盐浓度增加而增加，k越大，出峰越晚。
流动相的选择
中性化合物流动相的选择 酸性和碱性化合物流动相的选择 较强电解质化合物流动相的选择
中性化合物流动相的选择
1.改变有机溶剂的比例：
秘诀1： 由强到弱： 一般先用强溶剂100%的乙腈(或甲 醇)/水(或缓冲溶液)进行试验， 这样可以很快地得到分离结 果，然后根据出峰情况调整有机溶剂(乙腈或甲醇)的比例。 秘诀2 三倍规则 ：每减少10%的有机溶剂(甲醇或乙腈) 的量，k约增加3倍，此为3倍规则。这是一个聪明而又省力 的办法。调整的过程中，注意观察各个峰的分离情况。 秘诀3 粗调转微调：当分离达到一定程度，应将有机溶 剂10%的改变量调整为5%，并据此规则逐渐降低调整率， 直至各组分的分离情况不再改变。
乙腈-水
0 20 40 60 80 100
甲醇-水
80 90 100
0 10
20
30
40
50
60
70
四氢呋喃-水
40%乙腈、50%甲醇和30%四氢呋喃洗 脱效果相当。
3.使用三元或四元混合有机溶剂 甲醇-四氢呋喃-水、甲醇-乙腈-水
反相离子抑制色谱——弱电解质
分析弱酸、弱碱或两性化合物等弱电解质物质
色带 (色谱）
色谱法是一种分离技术
试样
流动相
A+B
B A
固定相
B A B A B
色谱柱
检测器
色谱过程—多次吸附→ 解吸→再吸附 →再解吸 （“分配”过程） A、B性质和结构上的微小差异→吸附能力和溶解能力有 微小差异→差异累积→先后出峰 S A B t0 t1 t2 t3 t4
色谱是一种分离技术. 色谱的主要目的是对混合源自文库中的 目标物分离和定量
化学键合相色谱
正相键合相色谱法 流动相极性<固定相极性 反相键合相色谱法 流动相极性>固定相极性 反相离子对色谱法
化学键合相色谱法
反相键合相
固定相 非极性如C18、C8 苯基柱
正相键合相
极性 如氨基、氰 基键合相
离子对
多用非极性
流动相
极性（甲醇-水、乙 非极性（烷烃+适 腈-水） 量极性调整剂）
t R 2 t R1 R (W1 W2 ) / 2
容量因子（保留因子）
HPLC的分类
一、分离原理 二、按实际应用情况
化学键合相色谱 离子抑制色谱 离子对色谱 手性色谱法 亲和色谱法 电色谱法 胶束色谱法
吸附色谱-分子 分配色谱-分子 离子交换色谱-阴阳离子 分子排阻色谱-高分子物质
组织提取物、多肽、 蛋白质、核酸
注意：a. pH值范围2—8
b.三乙胺、醋酸胺、乙腈—扫尾剂（含氮 碱 性竞争剂），如碱性药物分析。
O O O S OH O S Cl O O S N NH HN NH
SOCl2
N
HCl HCl
N
N
选择缓冲液的步骤：
1 .确定最佳分离状态时的流动相pH 2. 选择具有与流动相的pH值相近的pKa缓冲液（即使浓度 很低也具有较强的缓冲能力） 3 .确认检测波长下缓冲液是否有大的吸收 （在波长210nm附近进行检测时，不能用醋酸和柠檬酸的缓冲液）
使用梯度洗脱的原因
当等度洗脱时：
MeOH / H2O = 6 / 4 分析时间长
分离度差 MeOH / H2O = 8 / 2
( column : ODS )
使用梯度洗脱的原因
采用梯度洗脱：
95% 甲 醇 浓 度
30%
在最短时间内获得最佳的分离 分离多组分、性质相差较大的混合样品。
分离简单混合物一般用等度洗脱，复杂样品用梯度。
HPLC基础理论及使用注意事项
第一部分 色谱基础理论回顾 第二部分 HPLC硬件基础知识及各部件使用
注意事项
第三部分 HPLC使用过程中常遇见的问题及
处理方法
第一部分 色谱基础理论回顾
色谱的发展历史
1903年俄国植物化学家茨维特(Tswett)首次提出“色谱 法”(Chromotography)。 30年代，奥地利化学家R.库恩利用Tsweet的色谱法分离了60多种 类胡萝卜素。相继出现了纸色谱、离子交换色谱和薄层色谱等液相色 谱技术。 1952年，英国学者Martin和Synge 提出了气相色谱法，精辟阐述 了气相色谱完整的理论和方法，使色谱从最初的定性分离手段进一步 演化为具有分离功能的定量测定手段。1958年，出现毛细管气相色谱； 60年代，推出了GC-MS。 1960年中后期，生物技术飞速发展，为了分离蛋白质、核酸等不 易气化的大分子物质，在气相色谱理论和实践的发展的基础上，以及 机械、光学、电子等技术上的进步，液相色谱又开始活跃。到60年代 末期把高压泵和化学键合固定相用于液相色谱就出现了HPLC。1970年 中期以后，微处理机技术用于液相色谱，进一步提高了仪器的自动化 水平和分析精度。 20世纪80年代是色谱技术蓬勃发展的时期，出现各种联用技术。 20世纪80年代以后，毛细管电泳技术。20世纪90年代以来，以 毛细管电泳为基础的微分析芯片又将分析科学带入一个全新的领域。 90年代－毛细管电泳电色谱
Ai 100% A1 Ai An
优点：
a.简便，准确 b.定量结果与进样量、重复性无关（前提→ 柱子不超载） c.色谱条件略有变化对结果几乎无影响
缺点：
a.所有组分必须在一定时间内都出峰 b.必须已知所有组分的校正因子 c.不适合微量组分的测定
2、外标法
以待测组分纯品为对照物，与试样中待测 组分的响应信号相比较进行定量的方法
0.0
0.5
Methyl Paraben
1.0
1.5
2.0
2.5
Butyl Paraben
3.0
色谱基本参数
300
Propyl Paraben
min
保留时间、死时间、调整保留时间 保留体积、死体积、调整保留体积 峰高（峰面积） 峰宽 分离度 分配系数
t R t 0 (1 k ) Vs t R t 0 (1 K ) Vm
样品离子化后，其疏水性降低，亲水性增加，其保留 值可能会减低10-20倍。 措施：在流动相中加入少量的弱酸、弱碱或缓冲 溶液，调节流动相的pH，抑制溶质的解离。
目的：增加其与固定相之间的缔合作用，增大分配比，
使保留值增大而得以分离。
弱酸(3≤pKa≤7)或者弱碱(7≤pKa≤8)时：
弱酸—50mmol/L磷酸盐缓冲液或1%醋酸/甲酸调酸性 弱碱—50mmol/L磷酸盐缓冲液+30mmol/L三乙胺
a．工作曲线法：i纯品→工作曲线，同体积样品与之比较 b．外标一点法：一种浓度对照品对比样品中待测组分含量 前提：截距为0，对照品浓度与待测组分浓度接近
Ci Ai (C i ) s ( Ai ) s
图示
A
c
线性方程，标准溶液5份以上 相关系数r（3个9以上）
back
外标法特点：
1）不需要校正因子，不需要所有组分出峰 2）结果受进样量、进样重复性和操作条件影响大 要求操作条件稳定，进样量重复性好，否则对 分析结果影响较大。
3、内标法
标准溶液：对照品 + 内标物
供试品溶液：样品+相同量的内标物
待测物
对照品 内标物 内标物
m 对 f 对 A对 f 对 A内 m 对 m内 f内A内 f f内 A对 m内
m待 f 待 A待 f待 A内 m待 m内 f内A内 f f内 A待 m内 A内 C 待 A待 C内
固定相
_
+
Na + (BH
+ RSO 3 )
RSO 3 )
m
S
离子对
影响保留因子k的因素：
1) 固定相—C18
2）离子对试剂种类：烷基磺酸钠→分析碱 四丁基季铵盐→分析酸 离子对试剂浓度:10~30mmol/L 3）流动相的pH—由于离子对的形成依赖于试样
组分的离解程度。
等度洗脱？ 梯度洗脱？
A内 C 对 f A对 C内
A待 C内 C待 f A内
内标法优点：
a.由于操作条件的变化而引起的误差，都将同时反 映在内标物及欲测组分上而得到抵消，所以可得到较 准确的结果。多用在国际标准和规定比较严格、要求 比较高的方法中使用。 b. 定量结果与进样量无关，进样体积不要求准确。 所以毛细管气相色谱中较常用。
流动相极性越大， 流动相极性越大， 洗脱能力越大，k、 洗脱能力越小， tR均越小
tR越大
极性+离子对试剂
流动相极 性与k的 关系 组分出峰 顺序 应用
同反相键合相
极性大先出峰
非极性至中等极性
极性大后出峰 极性化合物
极性大先出峰 有机酸、碱、盐
固定相极性变化对分离的影响
ODS C8 TMS
分析条件
柱 : Shim-pack CLC-ODS 流动相 : MeOH : H2O = 7 :3 流速 : 1.0 mL/min 温度 : 40 C 进样体积 : 10 uL 检测器 : UV-254 nm
峰 1. 苯甲酸甲脂 2. 苯甲酸乙脂 3. n-苯甲酸丙酯 4. n-苯甲酸丁酯
定量方法：
1．归一化法 2．外标法 3．内标法
1、归一化法
前提：试样中所有组分都产生信号并能检出色谱峰
mi w i (% ) 100% m1 m 2 m 3 m n
Ai f i wi % 100% A1 f1 Ai f i An f n
同系物或结构异构体 i % C
注意冲洗次序，不能直接用 有机溶剂冲洗
反相离子对色谱法（IPC）— 较强电解质
对于某些易离解的有机酸、有机碱。如生物碱类、儿 茶酚胺类、有机酸类、维生素类和抗生素类。 例：牛磺酸
反相色谱中，在极性流动相中加入离子对试剂，使被测组分 与其中的反离子形成中性离子对，增加k和tR，以改善分离。
流动相
B H RSO 3Na BH+ RSO 3 ( BH
定量分析方法
定量依据 mi (或ci ) Ai
由于同一检测器对不同物质的响应值不同， 所以不能用峰面积来直接计算物质的量。
定量校正因子
f i' — 绝对校正因子（需要准 确知道进样量）
' mi fi Ai
f g — —相对校正因子（与操 作条件变化无关）
f i' mi Ai As mi fg ' f s m s As Ai m s
100%乙腈
60%乙腈
80%乙腈
50%乙腈
40%乙腈
2.改变有机溶剂类型
首选乙腈-水，乙腈黏度小，在低波长（185-210nm）下 无吸收，效果不好可改为甲醇-水、四氢呋喃-水 一些强亲脂性或强疏水性化合物，可选用高比例四氢 呋喃或四氢呋喃-乙腈（流动相中不含水，成为非水反向 液相色谱）
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
mV 500 400
Ethyl Paraben
200
100
0 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 min
Methyl Paraben
Butyl Paraben
300
Propyl Paraben
mV 500
400
Ethyl Paraben
200
基线 拖尾因子（不对称因子）
100 0
化学键合相色谱
硅氧烷Si-O-Si-C
R1 Si--OH + X--Si--R2 R3
R2=（CH2)3NH2(氨基柱）
R1 Si--O--Si--R2 + R3 HX
=(CH2)3CN（氰基柱）
=(CH2)2OCH2CH(OH)CH2OH（二羟基柱） =(CH2)17CH3（C18柱） =(CH2)7CH3（C8柱） =(CH2)3C6H3（苯基柱）
常用代表性的弱酸的pKa值
pK1 醋酸 柠檬酸 磷酸 4.87 3.13 2.16 4.76 7.21 6.40 12.32 pK2 pK3
缓冲液的使用注意事项：
使用前必须过滤 使用后一定要对柱子进行清洗 ，以免造成腐蚀、磨损及 阻塞:首先用5～10％的甲醇水溶液冲洗30-60min（0.51ml/min），再用甲醇冲洗30min(0.1-0.5ml/min) 易受到细菌和霉菌的影响
内标法缺点：
找合适内标物困难；
出峰顺序
极性强的物质先出峰
如果样品有
CH3CH2CH2--- : 碳链
: 芳香基
作用力强
如果样品有
-COOH -NH2 -OH
: 羧基 : 氨基 : 羟基
作用力弱
地西泮
5.9min
10.9min
1 2 1.甲醇-水（70:30） 2.甲醇-水（80:20）
有机溶剂比例越大，其表面张力越小，k也越小， 出峰越早。 加入电解质（如缓冲液或中性盐），表面张力随 盐浓度增加而增加，k越大，出峰越晚。
流动相的选择
中性化合物流动相的选择 酸性和碱性化合物流动相的选择 较强电解质化合物流动相的选择
中性化合物流动相的选择
1.改变有机溶剂的比例：
秘诀1： 由强到弱： 一般先用强溶剂100%的乙腈(或甲 醇)/水(或缓冲溶液)进行试验， 这样可以很快地得到分离结 果，然后根据出峰情况调整有机溶剂(乙腈或甲醇)的比例。 秘诀2 三倍规则 ：每减少10%的有机溶剂(甲醇或乙腈) 的量，k约增加3倍，此为3倍规则。这是一个聪明而又省力 的办法。调整的过程中，注意观察各个峰的分离情况。 秘诀3 粗调转微调：当分离达到一定程度，应将有机溶 剂10%的改变量调整为5%，并据此规则逐渐降低调整率， 直至各组分的分离情况不再改变。
乙腈-水
0 20 40 60 80 100
甲醇-水
80 90 100
0 10
20
30
40
50
60
70
四氢呋喃-水
40%乙腈、50%甲醇和30%四氢呋喃洗 脱效果相当。
3.使用三元或四元混合有机溶剂 甲醇-四氢呋喃-水、甲醇-乙腈-水
反相离子抑制色谱——弱电解质
分析弱酸、弱碱或两性化合物等弱电解质物质
色带 (色谱）
色谱法是一种分离技术
试样
流动相
A+B
B A
固定相
B A B A B
色谱柱
检测器
色谱过程—多次吸附→ 解吸→再吸附 →再解吸 （“分配”过程） A、B性质和结构上的微小差异→吸附能力和溶解能力有 微小差异→差异累积→先后出峰 S A B t0 t1 t2 t3 t4
色谱是一种分离技术. 色谱的主要目的是对混合源自文库中的 目标物分离和定量
化学键合相色谱
正相键合相色谱法 流动相极性<固定相极性 反相键合相色谱法 流动相极性>固定相极性 反相离子对色谱法
化学键合相色谱法
反相键合相
固定相 非极性如C18、C8 苯基柱
正相键合相
极性 如氨基、氰 基键合相
离子对
多用非极性
流动相
极性（甲醇-水、乙 非极性（烷烃+适 腈-水） 量极性调整剂）
t R 2 t R1 R (W1 W2 ) / 2
容量因子（保留因子）
HPLC的分类
一、分离原理 二、按实际应用情况
化学键合相色谱 离子抑制色谱 离子对色谱 手性色谱法 亲和色谱法 电色谱法 胶束色谱法
吸附色谱-分子 分配色谱-分子 离子交换色谱-阴阳离子 分子排阻色谱-高分子物质
组织提取物、多肽、 蛋白质、核酸
注意：a. pH值范围2—8
b.三乙胺、醋酸胺、乙腈—扫尾剂（含氮 碱 性竞争剂），如碱性药物分析。
O O O S OH O S Cl O O S N NH HN NH
SOCl2
N
HCl HCl
N
N
选择缓冲液的步骤：
1 .确定最佳分离状态时的流动相pH 2. 选择具有与流动相的pH值相近的pKa缓冲液（即使浓度 很低也具有较强的缓冲能力） 3 .确认检测波长下缓冲液是否有大的吸收 （在波长210nm附近进行检测时，不能用醋酸和柠檬酸的缓冲液）
使用梯度洗脱的原因
当等度洗脱时：
MeOH / H2O = 6 / 4 分析时间长
分离度差 MeOH / H2O = 8 / 2
( column : ODS )
使用梯度洗脱的原因
采用梯度洗脱：
95% 甲 醇 浓 度
30%
在最短时间内获得最佳的分离 分离多组分、性质相差较大的混合样品。
分离简单混合物一般用等度洗脱，复杂样品用梯度。
HPLC基础理论及使用注意事项
第一部分 色谱基础理论回顾 第二部分 HPLC硬件基础知识及各部件使用
注意事项
第三部分 HPLC使用过程中常遇见的问题及
处理方法
第一部分 色谱基础理论回顾
色谱的发展历史
1903年俄国植物化学家茨维特(Tswett)首次提出“色谱 法”(Chromotography)。 30年代，奥地利化学家R.库恩利用Tsweet的色谱法分离了60多种 类胡萝卜素。相继出现了纸色谱、离子交换色谱和薄层色谱等液相色 谱技术。 1952年，英国学者Martin和Synge 提出了气相色谱法，精辟阐述 了气相色谱完整的理论和方法，使色谱从最初的定性分离手段进一步 演化为具有分离功能的定量测定手段。1958年，出现毛细管气相色谱； 60年代，推出了GC-MS。 1960年中后期，生物技术飞速发展，为了分离蛋白质、核酸等不 易气化的大分子物质，在气相色谱理论和实践的发展的基础上，以及 机械、光学、电子等技术上的进步，液相色谱又开始活跃。到60年代 末期把高压泵和化学键合固定相用于液相色谱就出现了HPLC。1970年 中期以后，微处理机技术用于液相色谱，进一步提高了仪器的自动化 水平和分析精度。 20世纪80年代是色谱技术蓬勃发展的时期，出现各种联用技术。 20世纪80年代以后，毛细管电泳技术。20世纪90年代以来，以 毛细管电泳为基础的微分析芯片又将分析科学带入一个全新的领域。 90年代－毛细管电泳电色谱
Ai 100% A1 Ai An
优点：
a.简便，准确 b.定量结果与进样量、重复性无关（前提→ 柱子不超载） c.色谱条件略有变化对结果几乎无影响
缺点：
a.所有组分必须在一定时间内都出峰 b.必须已知所有组分的校正因子 c.不适合微量组分的测定
2、外标法
以待测组分纯品为对照物，与试样中待测 组分的响应信号相比较进行定量的方法
0.0
0.5
Methyl Paraben
1.0
1.5
2.0
2.5
Butyl Paraben
3.0
色谱基本参数
300
Propyl Paraben
min
保留时间、死时间、调整保留时间 保留体积、死体积、调整保留体积 峰高（峰面积） 峰宽 分离度 分配系数
t R t 0 (1 k ) Vs t R t 0 (1 K ) Vm
样品离子化后，其疏水性降低，亲水性增加，其保留 值可能会减低10-20倍。 措施：在流动相中加入少量的弱酸、弱碱或缓冲 溶液，调节流动相的pH，抑制溶质的解离。
目的：增加其与固定相之间的缔合作用，增大分配比，
使保留值增大而得以分离。
弱酸(3≤pKa≤7)或者弱碱(7≤pKa≤8)时：
弱酸—50mmol/L磷酸盐缓冲液或1%醋酸/甲酸调酸性 弱碱—50mmol/L磷酸盐缓冲液+30mmol/L三乙胺
a．工作曲线法：i纯品→工作曲线，同体积样品与之比较 b．外标一点法：一种浓度对照品对比样品中待测组分含量 前提：截距为0，对照品浓度与待测组分浓度接近
Ci Ai (C i ) s ( Ai ) s
图示
A
c
线性方程，标准溶液5份以上 相关系数r（3个9以上）
back
外标法特点：
1）不需要校正因子，不需要所有组分出峰 2）结果受进样量、进样重复性和操作条件影响大 要求操作条件稳定，进样量重复性好，否则对 分析结果影响较大。
3、内标法
标准溶液：对照品 + 内标物
供试品溶液：样品+相同量的内标物
待测物
对照品 内标物 内标物
m 对 f 对 A对 f 对 A内 m 对 m内 f内A内 f f内 A对 m内
m待 f 待 A待 f待 A内 m待 m内 f内A内 f f内 A待 m内 A内 C 待 A待 C内