第二章 真菌检验基本技术
真菌的常规检验法
真菌的常规检验法实验室检查：♦标本采集分离培养♦直接镜检生化反应♦染色镜检免疫学试验一、临床标本的采集♦1．皮肤的角质性物质：毛发、指(趾)甲、头屑、皮屑等。
2．各种分泌物和排泄物：生殖道分泌物、耳垢、痰、粪便、尿液等。
♦3．血液和体液：体液包括胸水、腹水、脑脊液、淋巴穿刺液等。
4．脓汁及渗出物。
二、检验方法（一）标本直接检查法不染色标本检查染色标本检查（二）培养检查（三）鉴定①KOH溶液：本液适于检查致密的难以透明的材料（如毛发、指甲、鳞屑等）。
②墨汁：主要用于检查有荚膜的真菌（如新型隐球菌等）③水合氯醛－石炭酸－乳酸封固液：此液透明力较强，只限于不透明的标本。
④生理盐水：为观察真菌的出芽现象可用生理盐水代替氢氧化钾溶液。
微生物学检查步骤：取患部标本（毛发、皮屑等）__置载玻片__加10%NaOH（或10%KOH）→微加温消化→镜检（观察菌丝和孢子）直接镜检的意义①有诊断意义，如浅部真菌病等；②通过真菌的形态，可确定某些致病性真菌的属或种, 如假丝酵母菌的厚膜孢子等；③判断某些真菌种的致病性等,如皮肤癣菌、曲霉等。
直接镜检的局限性：①阴性结果不能排除真菌感染；②有假阳性结果。
因此，对直接镜检可疑结果应作复查或用其他检验方法鉴定。
2. 染色标本检查♦（1）革兰染色：各种真菌均染成革兰阳性。
♦（2）乳酸酚棉蓝染色♦（3）糖原染色：♦又称过碘Schiff（简称PAS或PASH）。
真菌细胞壁由纤维素和几丁质组成，含有多糖。
过碘酸使糖氧化成醛，再与品红－亚硫酸结合，成为红色，故菌体均染成红色。
为真菌染色最常用的方法之一。
♦（4）嗜银染色（GMS）：染成黑色♦（5）粘蛋白卡红染色法（MCS）：主要用于新生隐球菌荚膜的染色。
隐球菌荚膜和细胞壁呈红色，细胞核呈黑色。
♦（6）荧光染色：主要使用吖啶橙和氢氧化钾来染直接涂片、培养涂片及组织切片。
（二）培养检查法♦本法可确定菌种，辅助直接检查的不足。
①菌落性质：酵母菌还是霉菌；②菌落大小：致病性真菌菌落小，而条件致病性真菌菌落大；③菌落颜色：病原性真菌颜色淡，污染真菌颜色深；④致病性真菌菌落下沉，有时使培养基开裂；污染性真菌菌落不下沉，很少引起开裂。
微生物检验常用技术与方法—临床真菌检验技术与方法(微生物检验课件)
掌握真菌的检验方法。 熟悉真菌标本采集及注意事项； 熟悉真菌的鉴定程序；真菌药物 敏感试验方法。
第一节 真菌形态检验技术
一、标本的采集和处理
1. 标本的采集—— 根据真菌感染部位采集不同的标本。 浅部真菌感染 取毛发、皮屑、指（趾）甲等标本
深部真菌感染
取痰液、脓汁、血液、脑脊液等标本
培养基用途 真菌的常规培养 真菌的常规培养 观察白假丝酵母菌的厚膜孢子 观察真菌菌落色素，用于鉴别 生化反应鉴别培养（红色癣菌和石膏样癣菌） 深部真菌培养 真菌的培养与鉴定
第二节 真菌培养技术
显色鉴定培养基
代谢基质 产色基团
原
真菌的酶
理
分解代谢基质
真菌特异性酶的 底物（无色）
产色基团游离 （显色）
4. 病理组织检查 用于深部真菌感染的诊断。
5. 核酸检测
用于真菌的分型鉴定。
有ELISA、生物学方法、薄层层析法、高效液相
6. 真菌毒素的检测 色谱法等多种方法。
7. G试验
用于念珠菌、曲霉菌等深部真菌感染的早期诊断。
返回章内容
第四节 真菌检验G试验、GM试验
应用背景
• 侵袭性真菌病临床表现不典型，确 诊通常需要侵入性的组织标本，因 此有较高的漏诊率。目前国内大多 数医院都在开展非侵袭性实验室技 术如G试验和GM试验，成为真菌 感染的诊断标准之一，以提高真菌 感染的阳性率。
同化氮源试验
• 检测真菌对氮源利用能力的试验，主 要用于鉴定酵母菌。
明胶液化试验
• 某些真菌具有明胶酶，可分解明胶蛋 白，使其失去凝胶性质而不能凝固。
尿素分解试验
• 某些真菌具有尿素酶，可分解尿素。
第三节 真菌的鉴定方法
《真菌检验》课件
真菌检验的主要方法
1
采样
选择适当的采样方法和工具以收集环境中的真菌样品
2
培养
将采样得到的样品培养在适当的培养基上以促使真菌生长
3
识别
利用显微镜和分类学知识对培养得到的真菌进行鉴定
真菌检验的应用领域
室内空气质量
了解室内真菌水平以评估空气质量和呼吸健 康风险
环境研究
研究真菌在生态系统中的角色和影响，以改 善环境保护
真菌检验的发展趋势
自动化技术
利用自动化设备和软件提高 真菌检验的准确性和效率
分子生物学
应用基因检测和测序技术以 更快速、精确地鉴定真菌，发现新的应用领域
总结与展望
真菌检验是一项关键的环境科学技术 随着技术的不断发展，真菌检验将在更多领域发挥重要作用 感谢您参与我们的《真菌检验》PPT课程
食品工业
监测食品加工过程中的真菌污染以确保食品 安全
医学诊断
帮助诊断真菌感染疾病，并确定适当的治疗 方法
真菌检验的优缺点
• 优点：提供精确的真菌信息，有助于保护健康和环境 • 优点：可以快速鉴定真菌，提高工作效率 • 缺点：需要专业知识和设备，成本较高 • 缺点：某些真菌难以培养和鉴定，可能导致结果不确定
真菌检验
欢迎来到《真菌检验》PPT课件 在本课程中，我们将探讨真菌检验的基本概念和实际应用案例
什么是真菌检验
真菌检验是一种用于检测和鉴定环境中真菌的方法 通过采样、培养和识别技术，我们可以确定真菌的种类和数量
为什么需要真菌检验
真菌是一类常见的微生物，广泛存在于我们的环境中 虽然大多数真菌对人类无害，但某些真菌可能引发健康问题 通过真菌检验，我们可以评估环境质量，并采取必要的控制措施
真菌检验生物学技术
真菌检验生物学技术
（一）、用PCR等技术字标本中扩增真菌DNA.国内应用PCR与反向斑点杂交快速检测及鉴定念珠菌主要种别。
国外可以用PCR-DEIA技术从血清中扩增出白色念珠菌的DNA来诊断念珠菌病。
针对真菌的共同序列而设计的‘全能引物’（pan-primer）而扩增580bp的产物，为真菌所共有。
检测血液标本即可明确体内有无真菌感染。
中华考试网
（二）、用于真菌的型别分析。
国内应用随机引物PCR扩增后进行真菌分型，结果可靠。
应用随机引物扩增物多态性分析（RAPD）可以将5种曲霉菌鉴别开（烟、黄、黑、土、构巢曲霉）。
国外结合PCR与酶标记探针在纸条上进行检测（LiPA，lineprobeassay）可鉴别出主要的致病性真菌。
（三）、检出念珠菌的基因变异快速确定念珠菌对酮康唑的耐药性。
此种耐药性由基因的1554T突变为C而致，应用Lightcycler仪器，以荧光共振能量转移和基因片段溶解温度曲线技术测定。
真菌检测步骤
真菌检查步骤1.采集标本浅部真菌的标本有毛发、皮屑、甲屑、痂等，标本在分离前常先用75%的乙醇消毒。
深部真菌的标本可根据情况取痰、尿液、粪便、脓液、口腔或阴道分泌物、血液、脑脊液、各种穿刺液和活检组织，采集标本时应注意无菌操作。
2.检查方法真菌检查的方法主要有：（1）直接涂片：为最简单而重要的诊断方法。
取标本置玻片上，加一滴10%KOH溶液，盖上盖玻片，在酒精灯火焰上稍加热，待标本溶解，轻轻加压盖玻片使标本透明即可镜检。
可用于检查有无菌丝或孢子，但不能确定菌种。
（2）墨汁涂片：用于检查隐球菌及其他有荚膜的孢子。
医学教育|网搜集整理方法是取一小滴墨汁与标本（如脑脊液）混合，盖上盖玻片后直接镜检。
（3）涂片或组织切片染色：涂片染色可更好地显示真菌形态和结构。
革兰染色适用于白念珠菌、孢子丝菌等；瑞氏染色适用于组织胞浆菌；组织切片通常用PAS染色，多数真菌可被染成红色。
（4）培养检查：可提高真菌检出率，并能确定菌种。
标本接种于葡萄糖蛋白胨琼脂培养基上，置室温或37℃培养1～3周，必要时可行玻片小培养协助鉴定。
菌种鉴定常根据菌落的形态及显微镜下形态判断，对某些真菌，有时尚需配合其他鉴别培养基、生化反应、分子生物学方法确定。
四、真菌学检验的基本技术（一）直接镜检是最简单也是最有用的实验室诊断方法，常用的方法有：①氢氧化钾/复方氢氧化钾法：标本置于载玻片上，加一滴浮载液，盖上盖玻片，放置片刻或微加热，即在火焰上快速通过2～3次，不应使其沸腾，以免结晶，然后轻压盖玻片，驱逐气泡并将标本压薄，用棉拭或吸水纸吸去周围溢液，置于显微镜下检查。
检查时应遮去强光，先在低倍镜下检查有无菌丝和孢子，然后用高倍镜观察孢子和菌丝的形态、特征、位置、大小和排列等。
浮载液：A.10%~20%的KOH。
配方：氢氧化钾10～20g，蒸馏水加至100ml，待氢氧化钾完全溶解后揺匀存放在塑料瓶内，适用于皮屑、甲屑、毛发、痂皮、痰、粪便、组织、耵聍等的检查。
真菌检测方法
真菌检测方法真菌是一类微生物，广泛存在于自然界中，包括土壤、空气、水体等环境中。
在生活和生产中，真菌不仅对人类和动植物健康造成威胁，还会对食品、饮用水、药品等产品质量产生影响。
因此，对真菌的检测至关重要。
本文将介绍几种常见的真菌检测方法。
首先，传统的真菌检测方法之一是培养法。
这是一种常用的方法，通过将样品接种在含有营养物质的培养基上，利用真菌在培养基上生长繁殖的特性，观察和统计培养基上的真菌数量和种类。
这种方法简单易行，对于一些真菌种类的检测效果较好，但是需要较长的培养周期，并且对于一些难以培养的真菌种类可能无法进行检测。
其次，PCR法是一种利用聚合酶链式反应（PCR）技术进行真菌检测的方法。
这种方法可以通过扩增真菌DNA或RNA的特定片段，来检测样品中的真菌数量和种类。
PCR法具有高灵敏度和高特异性的优点，可以快速准确地进行真菌检测，尤其适用于对样品中真菌种类进行快速筛查和鉴定。
另外，生物传感器技术也被广泛应用于真菌检测领域。
生物传感器是一种利用生物元件（如酶、抗体、细胞等）与传感器技术相结合的检测方法。
通过生物元件与目标真菌的特异性反应，可以实现对真菌的快速检测和定量分析。
生物传感器技术具有检测速度快、操作简便、灵敏度高等优点，对于一些需要快速检测的场合具有很大的应用潜力。
最后，近年来，基于光学技术的真菌检测方法也得到了广泛的关注和应用。
例如，荧光显微镜技术可以通过观察样品中真菌的荧光特性来进行检测；激光散射技术则可以通过检测样品中真菌颗粒的散射光信号来实现真菌的快速检测。
这些基于光学技术的检测方法具有操作简便、检测速度快的优点，对于真菌检测领域具有重要的应用价值。
综上所述，针对不同的真菌检测需求，可以选择合适的检测方法进行应用。
传统的培养法适用于一般真菌的检测；PCR法适用于快速准确的真菌鉴定；生物传感器技术和基于光学技术的检测方法则具有快速、灵敏的特点，适用于一些需要快速检测的场合。
在实际应用中，可以根据具体的检测需求和实际情况选择合适的真菌检测方法，以确保检测结果的准确性和可靠性。
真菌检验技术
真菌检验技术在医学领域，真菌检验技术是诊断真菌感染、保障患者健康的重要手段。
真菌作为一类广泛存在于自然界中的微生物，有时会引发各种疾病，从轻微的皮肤感染到严重的系统性感染都有可能。
因此，准确、及时的真菌检验对于疾病的诊断、治疗和预防至关重要。
真菌检验技术多种多样，首先要提到的是直接镜检法。
这种方法相对简单快捷，医生通常会从患者的感染部位采集样本，比如皮肤鳞屑、指甲碎屑、痰液、脑脊液等。
然后将样本制作成涂片，经过染色处理后，在显微镜下直接观察。
如果能看到真菌的孢子、菌丝等结构，就可以初步判断存在真菌感染。
但直接镜检法也有一定的局限性，比如真菌数量较少时可能会漏检，而且不能准确鉴定真菌的种类。
培养法是真菌检验中另一种常用的技术。
将采集到的样本接种在适合真菌生长的培养基上，然后在一定的温度、湿度和氧气条件下培养。
经过一段时间后，如果培养基上长出了真菌菌落，就可以进一步进行鉴定和药敏试验。
培养法的优点是可以获得纯培养的真菌，便于进行更详细的鉴定和药敏分析，但它也有缺点，那就是培养周期较长，一般需要数天甚至数周的时间，而且有些真菌在常规培养基上不易生长，可能导致假阴性结果。
随着科技的不断发展，分子生物学技术在真菌检验中也得到了越来越广泛的应用。
聚合酶链反应（PCR）技术就是其中之一。
通过设计针对真菌特异性基因片段的引物，对样本中的真菌 DNA 进行扩增，然后通过检测扩增产物来判断是否存在真菌感染。
这种方法具有高度的敏感性和特异性，能够快速检测出微量的真菌 DNA，而且还可以对真菌进行种属鉴定。
此外，还有一些基于核酸杂交和基因测序的技术，也为真菌的准确鉴定提供了有力的手段。
血清学检测也是真菌检验的重要组成部分。
例如，检测患者血清中针对特定真菌的抗体或抗原。
当人体感染真菌后，免疫系统会产生相应的抗体。
通过检测这些抗体的水平，可以辅助诊断真菌感染。
但血清学检测也存在一些问题，比如在感染的早期，抗体可能还未产生，或者在某些免疫功能低下的患者中，抗体反应可能不明显。
真菌临床检验技术
真菌临床检验技术真菌临床检验在诊断和治疗真菌疾病中扮演着至关重要的角色。
由于真菌感染菌种构成的变化，新的条件致病真菌的出现，以及真菌感染率的提高，我们需要更为精细和深入的检测工作，以便确定真菌种类和其对抗真菌药物的耐药性。
对真菌进行精确的识别和耐药性分析，可以为临床治疗提供重要依据，从而有助于患者的快速恢复。
这里就带大家一起来了解常见的真菌临床检验技术。
1.标本采集标本采集是检验的基础，需根据病人的具体情况和疾病种类，选择合适的采集方法。
如果疑似浅表真菌感染，例如体癣，可刮取病变部位的边缘痂皮。
对于疑似深部真菌感染，需要采集的标本包括脓液、痰液、脑脊液、血液等。
无论何种情况，标本的采集都需要在尚未使用药物治疗前完成。
如果已经用药，需要停药一周后才能再次采集标本。
另外，标本的采集必须足量，一般情况下，活体组织需要两份（一份用于显微检查和培养，一份送给病理科进行检查），皮屑需要两块，胸腔液为20毫升，脑脊液和血液为5毫升。
在操作过程中，需要保证无菌，避免二次感染。
采集完成后的标本要尽快送检，保存时间不超过两小时，特别是对于深部真菌标本。
2.直接检查法真菌直接检验主要在显微镜下进行。
首先，取一部分患者的标本，放置在玻璃载片上，加入适量的载液。
在平均分布标本后，用另一块玻片覆盖。
待片刻，利用火焰迅速烘烤载玻片，但不可持续加热以避免结晶。
随后，轻压盖玻片，除去气泡的同时使标本尽可能压薄。
清理周围的溢液后，可以用显微镜观察。
初步选择低倍镜，观察是否存在孢子或菌丝。
确定存在后，使用高倍镜进行细致观察，描绘出孢子和菌丝的排列、大小、位置、特征和形态等。
真菌直接检查是一种较为快速和直接的检测方法，其结果可以明确患者是否被真菌感染。
如果结果为阳性，可以确诊患者的真菌感染；如果结果为阴性，仍不能排除真菌感染的可能性。
通过显微镜，我们可以明确部分病原菌种，如花斑癣菌、新型隐球菌等，也能够确定某些特定的菌属，如念珠菌属。
微生物学检验(第3版)真菌学检验基本技术
• 目的要求 • 了解真菌菌丝的孢子的形态与结构特 点。 • 掌握白色假丝状酵母菌的形态特点。
菌种：白色念珠菌。 培养基：柯玛嘉培养基。 试剂：KOH溶液、革兰氏染液。 标：皮肤、毛发、甲屑。
步骤和方法
• 一、观察真菌在柯玛嘉培养基上（分
区划线）经35 ℃孵育24小时后生成
菌落的形态特征。
（2）显微镜检查：先用低倍镜检查有 无真菌菌丝或孢子，再以高倍镜检查 菌丝、孢子的特征.
破梳状菌丝
单纯菌丝
关节菌丝
螺旋菌丝
结节菌丝
假菌丝
各种孢子形态
三、革兰氏染色
• 对白色念珠菌涂片，革兰氏染色，观 察其形态特征。
白假丝酵母菌Candida albicans
四、真菌鉴定-----芽管形成试验
方法：取无菌小试管1支，加0.2ml动物或 人血清，接种少许真菌，充分震荡混和 数分钟后置37 ℃孵化，每隔1小时用接
种环取出含菌血清置于载玻片上加盖玻 片后镜检，共检查3次。 结果：白假丝酵母菌可由孢子长出短小芽 管。
芽管
•
（示
教）
• 将标本直接接种于柯玛嘉培养基上 （分区划线）经32℃－35 ℃孵育24 小时，可形成菌落。白假丝酵母菌 菌落显翠绿色、光滑念珠菌菌落显 紫色 .热带念珠菌菌落显铁兰色 、克 柔念珠菌菌落显粉红色 。
步骤和方法
二、直接涂片法 （一）不染色标本直接检查 （1）制片：用小镊子取甲屑或皮肤少许 或病人头发1根，置于载玻片中央， 滴加KOH溶液1－2滴，稍待片刻，盖 上盖玻片.
真菌感染的常规检验方法
真菌感染的常规检验方法真菌的临床实验室检查一般包括标本采集、直接镜检、染色镜检、分离培养、生化反应及免疫学试验等。
以直接镜检和分离培养最重要。
1标本采集不同真菌感染应采用不同的临床标本。
浅部真菌感染可以采集毛发、皮屑、指(趾)甲、痂等，标本在分离前常先用75％的乙醇消毒。
深部真菌感染的检查可取痰、尿液、口腔或阴道分泌物、脑脊液、各种穿刺液和活检组织等。
采集标本时应注意无菌操作。
采集标本后应及时转运至实验室进行检查，一般不超过1～2h，以免标本变质污染。
标本须在用药前采集，对已用药者则需停药一段时间后再采集标本。
2检查方法2.1 直接检查法直接镜检是最简单也是很有价值的实验室诊断方法。
其优点在于简便、快速，无菌部位的阳性结果可直接确定真菌感染。
但是，除了少数真菌外，多数不能确定其种类。
由于阳性率较低，阴性结果亦不能排除诊断，有时需反复检查或做其他方法检查以进一步确定。
直接镜检对于浅表和皮下真菌感染最有帮助。
2.1.1 不染色标本检查取皮屑、毛发、指(趾)甲屑等标本置于载玻片中央，滴加100～200g／L KOH溶液1～2滴，以盖玻片覆盖后在火焰上微微加热，使组织或角质溶解、透明后，先于低倍镜检查有无真菌菌丝或孢子，再以高倍镜检查其特征，可初步诊断真菌感染。
2.1.2 染色标本检查有些真菌如深部真菌需要染色后才能更清楚地观察，常用的染色方法如下。
(1)革兰染色法：多用于白假丝酵母菌、孢子丝菌和新近感染的组织胞浆菌等。
所有真菌均为革兰阳性。
(2)乳酸酚棉蓝染色法：取标本于载玻片上，滴加染液，加上盖玻片后于镜下观察，真菌被染成蓝色。
该法适用于各种真菌的直接检查，培养物涂片检查及小培养标本保存等。
(3)荧光染色法：用0.1％吖啶橙对标本涂片和组织切片进行染色，在荧光显微镜下观察，白假丝酵母菌、皮炎芽生菌、球孢子菌为黄绿色，新型隐球菌、鼻孢子菌为红色，组织胞浆菌为红黄色，曲霉菌为绿色。
2.2 分离培养法真菌培养是目前鉴定真菌的唯一方法。
检验科真菌学常见检测与分析方法
检验科真菌学常见检测与分析方法在检验科真菌学中，常见的检测与分析方法有多种，本文将详细介绍其中的几种方法。
一、直接镜检法直接镜检法是最常用的真菌检测方法之一。
该方法通过将待检样品直接放置在显微镜下观察，利用显微镜放大功能，检测并鉴定真菌的存在。
该方法操作简便，可以迅速获取初步结果，但其只能观察到菌丝、孢子等大型的真菌结构，对于微小的真菌可能存在漏检的情况。
二、培养法培养法是真菌学研究中较为常用的方法之一。
通过将待检样品放置于培养基上，促使真菌生长繁殖，从而观察和鉴定真菌的种类和数量。
培养法可以提供更多的细节信息，如真菌的形态、颜色、生长速度等，有助于进一步分析和鉴定。
然而，培养法需要较长的时间，一般需要数天至数周，且对于一些难以培养的真菌无法得到准确的结果。
三、PCR技术PCR（聚合酶链反应）是一种在分子生物学中广泛应用的技术。
在真菌学中，PCR技术可以用来检测和分析真菌DNA，从而确定真菌的存在和种类。
该方法的优势在于其高度敏感性和快速性，能够快速检测到微量真菌，并且可以对样品中的复杂菌群进行分析。
然而，PCR技术需要专门的实验设备和试剂，且对实验操作要求较高。
四、质谱分析质谱分析是一种基于质荷比的分析方法，可以用于真菌学中的检测和鉴定。
通过将待检样品进行质谱分析，可以得到真菌的分子质谱图谱，进一步进行真菌的鉴定和分类。
质谱分析具有高灵敏性和高分辨率的特点，可以准确地确定真菌的种类。
然而，质谱分析设备昂贵且操作复杂，需要专业的技术人员进行操作和解读结果。
综上所述，真菌学的常见检测与分析方法包括直接镜检法、培养法、PCR技术和质谱分析。
每种方法都有其优势和局限性，选择合适的方法需要根据具体情况和实验目的进行综合考虑。
在真菌学研究和检测过程中，通过运用这些方法，可以对真菌进行准确的检测和分析，为疾病的防控和治疗提供重要的科学依据。
真菌的常规检验法
真菌的常规检验法实验室检查：♦标本采集分离培养♦直接镜检生化反应♦染色镜检免疫学试验一、临床标本的采集♦1．皮肤的角质性物质：毛发、指(趾)甲、头屑、皮屑等。
2．各种分泌物和排泄物：生殖道分泌物、耳垢、痰、粪便、尿液等。
♦3．血液和体液：体液包括胸水、腹水、脑脊液、淋巴穿刺液等。
4．脓汁及渗出物。
二、检验方法（一）标本直接检查法不染色标本检查染色标本检查（二）培养检查（三）鉴定①KOH溶液：本液适于检查致密的难以透明的材料（如毛发、指甲、鳞屑等）。
②墨汁：主要用于检查有荚膜的真菌（如新型隐球菌等）③水合氯醛－石炭酸－乳酸封固液：此液透明力较强，只限于不透明的标本。
④生理盐水：为观察真菌的出芽现象可用生理盐水代替氢氧化钾溶液。
微生物学检查步骤：取患部标本（毛发、皮屑等）__置载玻片__加10%NaOH（或10%KOH）→微加温消化→镜检（观察菌丝和孢子）直接镜检的意义①有诊断意义，如浅部真菌病等；②通过真菌的形态，可确定某些致病性真菌的属或种, 如假丝酵母菌的厚膜孢子等；③判断某些真菌种的致病性等,如皮肤癣菌、曲霉等。
直接镜检的局限性：①阴性结果不能排除真菌感染；②有假阳性结果。
因此，对直接镜检可疑结果应作复查或用其他检验方法鉴定。
2. 染色标本检查♦（1）革兰染色：各种真菌均染成革兰阳性。
♦（2）乳酸酚棉蓝染色♦（3）糖原染色：♦又称过碘Schiff（简称PAS或PASH）。
真菌细胞壁由纤维素和几丁质组成，含有多糖。
过碘酸使糖氧化成醛，再与品红－亚硫酸结合，成为红色，故菌体均染成红色。
为真菌染色最常用的方法之一。
♦（4）嗜银染色（GMS）：染成黑色♦（5）粘蛋白卡红染色法（MCS）：主要用于新生隐球菌荚膜的染色。
隐球菌荚膜和细胞壁呈红色，细胞核呈黑色。
♦（6）荧光染色：主要使用吖啶橙和氢氧化钾来染直接涂片、培养涂片及组织切片。
（二）培养检查法♦本法可确定菌种，辅助直接检查的不足。
①菌落性质：酵母菌还是霉菌；②菌落大小：致病性真菌菌落小，而条件致病性真菌菌落大；③菌落颜色：病原性真菌颜色淡，污染真菌颜色深；④致病性真菌菌落下沉，有时使培养基开裂；污染性真菌菌落不下沉，很少引起开裂。
临床真菌学检验基本技术
二、真菌分类及存在形式
1、Ainsworth（1973）分类系统 特点：成立菌物界，分2门，真菌门下分成5个亚门；取 消藻状菌纲，依据鞭毛的有无划分成鞭毛菌亚门、接合 菌亚门。
2、Alexopoulos & Mims （1979） 分类系统
特点：成立菌物界，菌物界Myceteae、Fungi分3个门； 真菌类依鞭毛的有无分2门。 3、菌物分别归属藻界、真菌界、和原生生物界的分类系统
三、真菌的一般检查
（1）、一般镜检
B、胶带粘贴法
用透明胶带直接贴于取材部位，数分钟后揭 下，充分展平后，直接置贴于加有一滴浮液的载 玻片上此液可以是10%~20%的KOH，也可以采 用乳酸酚棉蓝染液（易于观察）。该法常用于花 斑癣患处的直接检查。
三、真菌的一般检查
（2）、常规染色
▪ 乳酸酚棉蓝染色
特点：将藻界、真菌界、和原生生物界分开成三个 独立的界属
➢与医学有关的真菌有四个亚门
接合亚门：毛霉、根霉等 子囊霉亚门：酵母菌属、小孢子霉属等 担子霉亚门：新生隐球菌、灵芝、食用菌等 半知霉亚门：假丝酵母菌属、球孢子菌属等
➢最新的真菌分类
接合菌门 子囊菌门 担子菌门 壶菌门
➢根据菌落形态分类：
酵母菌 酵母样菌 霉菌 双相真菌
3、现 代 形 态学技术， 如自动成像分析、电 子颗粒体积、分数几 何学分析形态学的特 点。
二、分子生物学鉴 定
1、表型 分 类 受限， 生理生化技术在丝状 真菌鉴定方面，或是 费时费事或是结果不 准。
2、PCR技术，可以分 析少量真菌细胞，甚 至单个真菌抱子。
3、选择通用寡核昔酸 对真菌种特异性引物， 测定其核昔酸序列。
菌 丝 和 孢 子
三、真菌的一般检查
《真菌检验》PPT课件
❖ 糠秕马拉癣菌主要寄居在人体皮肤和毛干的最表层，可 在健康人皮肤上分离到，为条件致病菌。
❖ 侵入表皮后，在皮肤角质层外2/3处生长、繁殖，引起一 种慢性、无症状或轻微症状的皮肤斑疹，呈灰白色、褐 色或淡黄色，上面附着细小糠皮样鳞屑，有时可融合成 片，似汗渍斑点，俗称汗斑即花斑癣（tinea versicolor） 。皮损最常见于胸、背、臂的上半部皮脂腺丰富部位。 病程缓慢，多年不愈，对健康无碍，但影响美观。油性 皮肤易感，而且与遗传、免疫缺陷等因素有关，诱发因 素为高温多汗。近年大量研究显示，糠秕马拉癣菌还可 引起毛囊炎，可能为脂溢性皮炎的重要发病原因之一。
❖ 4.鉴定 糠秕马拉癣菌的主要特征是：病损皮屑Wood’s灯 照射呈金黄色荧光，嗜脂性生长，酵母型菌落，腊肠样 菌丝，厚壁孢子。根据病发上结节的颜色、硬度、大小 ，即可对何德毛结节菌和白吉尔丝孢酵母菌初步诊断， 直接镜检看到子囊或子囊孢子，可确定为何德毛结节菌 。
，具有无性期和有性期两种形态。大多数从环境和人 体分离到的菌株处于无性期，属于丛梗孢科。按菌落 特征及大分生孢子的形态将皮肤癣菌分为3个属，即
毛癣菌属(Trichophyton )、 ❖ 小孢子菌属(Microsporum ) ❖ 及表皮癣菌属(Epidermophyton)。 ❖ 有性期属于裸囊菌科、节皮菌属(Arthroderma)。皮肤
❖ 组织
2009年3月
上海交通大学医学院
2009年3月
上海交通大学医学院
2009年3月
上海交通大学医学院
2009年3月
上海交通大学医学院
2009年3月
上海交通大学医学院
2009年3月
上海交通大学医学院
2009年3月
上海交通大学医学院
9-微生物学检验技术-第二章-真菌检验基本技术(思维导图)
9-微生物学检验技术-第二章-真菌检验基本技术做真菌实验注意事项
1、孢子具有空气散播等特性，所以真菌的检验操作应在生物安全柜中进行
2、每天工作前后应对工作区域进行消毒
3、不可直接嗅闻培养基上培养物产生的气味
4、不可对组织包浆菌、球孢子菌进行玻片培养，因为其孢子可在空气中播散
真菌的形态学检查
直接镜检
若发现有真菌菌丝或孢子存在时，可初步判定为真菌感染
标本制备处理液
KOH溶液，用于毛发、指甲及鳞屑，必要时可加入二甲基亚砜
生理盐水、
水合氯醛-苯酚-乳酸封固液
染色镜检革兰染色各种真菌均为阳性。
真菌的培养与鉴定技术
分离培养
鉴定试验
药物敏感试验
其他非培养检验技术
免疫学检验技术
分子生物学检验技术
G试验和GM 试验
目前临床常用的诊断侵袭性真菌感染的方法
G实验，不能用于隐球菌和结合菌的感染
GM试验，该实验能作为侵袭性曲霉菌感染的早期依据，国际公认的曲霉菌诊断
方法。
真菌检验技术—真菌的培养技术(微生物检验课件)
❖ 通过培养可确定菌种，辅助直接检查的不足； ❖ 通常用沙保氏培养基（SDA）（22～28℃）； ❖ 深部真菌可用血琼脂或脑心葡萄糖血琼脂37℃培养；
❖ 温度 :22 ℃ ～ 28℃(深部真菌:28 ℃ / 37℃)需氧、 湿度高;PH :4.0～6.0 (弱酸性)
真菌的分离培养
真菌培养是目前鉴定真菌的惟一方法。培养 真菌的温度为28℃，但深部真菌为37℃。菌落是 鉴别真菌的方法。注意以下几点：
①菌落性质：酵母菌还是霉菌； ②菌落大小:病原性真菌菌落小，而条件致病性真
菌菌落大；
③菌落颜色:病原性真菌颜色淡，污染真菌颜色深；
④致病性真菌菌落下沉，有时使培养基开裂；污
❖ 生长速度 : 慢(1～4周见典型菌落) ❖ 菌落特征 :酵母/酵母样菌 :光滑 柔软、湿润;丝状
菌:疏松 (绒毛状、棉絮状、粉末状);颜色 (正 / 背 面)
常用培养方法
❖ 试管法---初代培养、菌种保存 ❖ 大培养---纯种的培养、研究 ❖ 小培养---菌种鉴定 (玻片法 钢圈法 方块法)
第二章 真菌检验基本技术
第二章真菌检验基本技术一、形态学检查意义：1、有诊断意义；2、代表组织相；3、判断某些真菌的致病性。
取材：皮屑：75%酒精消毒皮损选皮损边缘、疤壁、脓液处刮取皮屑 10%KOH涂片+沙保弱琼脂培养两周甲屑：取病甲于正常甲交界处，贴近甲床部甲屑10%~20%KOH溶液溶解标本，镜检75%酒精浸泡干燥后，沙保弱琼脂（加放线菌酮及氯霉素）培养四周染色方法:1、革兰染色：各种真菌均为革兰阳性，深紫色2、乳酸酚棉蓝染色：适用于各种真菌的直接检查、培养物涂片检查及小培养标本保存等。
3、墨汁染色：用于检查有荚膜的真菌，如新生隐球菌。
4、荧光染色:通常有三种染色方法：直接涂片染色、培养物涂片染色及组织切片染色。
常见深部真菌的荧光反应5、糖原染色：原理是真菌细胞壁由纤维素和几丁质组成，含有多糖。
染色后真菌及组织内的多糖成分均为红色，核为蓝色，背景为淡绿色。
6、其他:瑞氏染色法，常用于组织或骨髓标本中组织胞浆菌和马尔尼菲青霉菌等真菌的检查。
嗜银染色法（GMS法）。
黏蛋白-卡红（MCS）染色法用于新生隐球菌的鉴别。
二、培养与鉴定技术常用真菌培养基及用途培养方法：1、试管培养法：一般用于菌种穿戴接种于保存。
不易污染。
2、大培养法：易污染，对球孢子菌、组织胞浆菌等传染性强的真菌培养不合适。
3、小培养法：是观察真菌结构及生长发育的有效方法。
分为玻片培养、小型盖片直接培养法及琼脂方块培养法。
生长现象：生长速度、菌落大小、表面形态、菌落性质、菌落颜色、菌落边缘、菌落底部。
鉴定试验1、毛发穿孔试验：石膏样小孢子菌穿孔试验阳性，红色毛癣菌穿孔试验阴性。
2、明胶液化试验3、芽管形成试验：试验要设阳性（白假丝酵母菌）和阴性对照（热带假丝酵母菌），并注意控制培养时间。
4、厚膜孢子形成试验：白假丝酵母菌在Tween-80培养基上能产生厚膜孢子。
5、酚氧化酶试验：此酶为新生隐球菌所特有。
用已知新生隐球菌和浅白隐球菌分别做阳性和阴性对照。
6、脲酶试验：石膏样癣菌、狗小孢子菌、新生隐球菌产生脲酶。
真菌生物学检验基本技术
菌 营养菌丝（伸入到培养基内） 丝 气生菌丝→ 生殖菌丝（露出于培养基表面）
有性 由同一菌体或不同菌体上的二个细胞 绝大多数属于非致病
孢子 融合形成
性真菌所具有
分生 无 孢子
小孢子菌属、 分生孢子梗的顶 大分生孢子 表皮癣菌属 端或侧面
孢
小分生孢子 毛癣菌属
性 子
芽生孢子 隐球菌、念珠菌
孢 叶状 孢子
整理课件
（二）免疫性
1．非特异性免疫：
人类对真菌感染有天然免疫力。皮肤分泌 短链脂肪酸和乳酸、血液中转铁蛋白、中 性粒细胞和单核巨噬细胞的吞噬作用，以 及正常菌群的拮抗作用。 2．特异性免疫：
真菌感染中细胞免疫是机体排菌杀菌及复 原的关键，T细胞分泌的淋巴因子、以T细 胞为主导的迟发型变态反应引起免疫病理 损伤能局限和消灭真菌，以终止感染。
④生理盐水：为观察真菌的出芽现象可用 生理盐水代替氢氧化钾溶液。
整理课件
2.条件致病性真菌感染： 主要是内源性感染（如白色念珠菌）， 亦有外源性感染（如曲霉菌）。 条件： 慢性消耗性疾病。糖尿病、白血病、长 期应用化疗、皮质类固醇激素的患者。免疫 力低下，菌群失调。
整理课件
3．过敏性真பைடு நூலகம்病： 由真菌性过敏原（如孢子抗原）引起过 敏症，如哮喘，变态反 应性肺泡炎和癣菌 疹等。 4．真菌毒素中毒症： 侵犯害肝、肾、脑、中枢神经系统及造 血组织。如黄曲霉毒素、某些镰刀菌素和黑 葡萄穗素。
若发现真菌菌丝或孢子存在时，即可初步 判定为真菌感染。
1）标本制备： 2）检查方法： 3）封固液：
整理课件
①KOH溶液：本液适于检查致密的难以透 明的材料（如毛发、指甲、鳞屑等）。 ②墨汁：主要用于检查有荚膜的真菌（如 新型隐球菌等）。
真菌鉴定方法
真菌鉴定方法第一篇：真菌鉴定方法真菌鉴定方法一般常用的有：1、直接鉴定法2、通过筛子检验3、比重检验法4、染色检验法5、洗涤检验法6、保湿萌芽检验7、分离培养检验真菌主要是酵母，霉菌和大型真菌三种，最常用的鉴定方法就是表形观察，霉菌和大型真菌可以通过菌丝的颜色，孢子的形态进行区分，辅以23srRNA就基本ok，酵母可以通过发酵代谢观察辅以23rRNA进行鉴定，真菌鉴定方法。
真菌是细菌的一种吗?随着生活水平的逐渐提高，人们的卫生防病意识也在不断加强。
大多数人知道细菌可以导致疾病，并习惯用“有病菌”或“有细菌”来形容一个脏的环境或物品。
那么，真菌又是怎么回事，是细菌的一种吗?的确，真菌也很微小，也能使人生病，但它和细菌有着本质的区别。
我们知道，植物和动物都是由细胞组成的，细胞内都有细胞核，鉴定材料《真菌鉴定方法》。
而微生物中只有真菌具有真正的细胞核和完整的细胞器，故又称真核细胞型微生物;细菌仅有原始核结构，无核膜和核仁，细胞器很少，属于原核细胞型微生物;而病毒则没有细胞结构，属于原生微生物。
真菌在自然界中分布极广，有十万多种，其中能引起人或动物感染的仅占极少部分，约300种。
很多真菌对人类是有益的，如面粉发酵，做酱油、醋、酒和霉豆腐等都要用真菌来发酵。
工业上许多酶制剂、农业上的饲料发酵都离不开真菌。
许多真菌还可食用，如蘑菇、银耳、香菇、木耳等。
真菌还是医药事业中的宝贵资源，有的可以用于生产抗生素和维生素以及酶类;有的本身就可以入药用于医治疾病，如中药马勃、茯苓、冬虫夏草等。
真菌还可引起动、植物和人类的多种疾病，在人类主要有三种类型：①真菌感染;②变-态反应性疾病;③中毒性疾玻霉菌亦称“丝状菌”。
属真菌。
体呈丝状，丛生，可产生多种形式的孢子。
多腐生。
种类很多，常见的有根霉、毛霉、曲霉和青霉等。
霉菌可用以生产工业原料(柠檬酸、甲烯琥珀酸等)，进行食品加工(酿造酱油等)，制造抗菌素(如青霉素、灰黄霉素)和生产农药(如“920”、白僵菌)等。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
染色方法
4、荧光染色:通常有三种染色方法：直接涂片染色、培养物涂片染 色及组织切片染色。
常见深部真菌的荧光反应
菌种名称 白假丝酵母菌 新生隐球菌 组织胞浆菌 曲霉 皮炎芽生菌
荧光反应 黄绿色 红色 红黄色 绿色 黄绿色
染色方法
5、糖原染色：原理是真菌细胞壁由纤维素和几丁质组成，含有多糖。 染色后真菌及组织内的多糖成分均为红色，核为蓝色，背景为淡绿色。
6、脲酶试验：石膏样癣菌、狗小孢子菌、新生隐球菌产 生脲酶。
7、糖同化或发酵试验：发酵试验是检测真菌最常用的生 化试验。同化试验原理是某些真菌在不含碳源而仅含氮源 的合成固体培养基上不生长。
药物敏感试验
目的： 1、提供两种以上有相当活性的、敏感的抗真菌药物； 2、检测体内药物真菌药物的治疗效能和抗真菌药物的研发。
2、大培养法：易污染，对球孢子菌、组织胞浆菌等传染 性强的真菌培养不合适。
3、小培养法：是观察真菌结构及生长发育的有效方法。 分为玻片培养、小型盖片直接培养法及琼脂方块培养法。
生长现象
1、生长速度 2、菌落大小 3、表面形态 4、菌落性质：分为酵母型、酵母样型、丝状菌落 5、菌落颜色 6、菌落边缘 7、菌落底部
GM试验能够作为侵袭性曲霉菌感染的早期依据。
谢谢
心脑浸液葡萄糖血琼脂
培养基用途
常规培养
观察白假丝酵母菌的厚膜孢子
观察真菌菌落色素，用于鉴别 用生化反应鉴别真菌（红色廯菌和石膏样廯 菌） 深部真菌培养
念珠菌显色培养基 菌株
白色念珠菌 克柔念珠菌 热带念珠菌 其他不产色素
颜色 绿色 粉色 蓝色 白色
培养方法
1、试管培养法：一般用于菌种穿戴接种于保存。不易污 染。
鉴定试验
1、毛发穿孔试验：石膏样小孢子菌穿孔试验阳性，红色 毛癣菌穿孔试验阴性。
2、明胶液化试验 3、芽管形成试验：试验要设阳性（白假丝酵母菌）和阴
性对照（热带假丝酵母菌），并注意控制培养时间。 4、厚膜孢子形成试验：白假丝酵母菌在Tween-80培养
基上能产生厚膜孢子。
鉴定试验
5、酚氧化酶试验：此酶为新生隐球菌所特有。用已知新 生隐球菌和浅白隐球菌分别做阳性和阴性对照。
甲屑： 取病甲于正常甲交界处，贴近甲床部甲屑
75%酒精 浸泡干燥
沙保弱琼脂（加放 线菌酮及氯霉素） 培养四周
10%~20%KOH 溶液溶解标本
镜检
染色方法
1、革兰染色：各种真菌均为革兰阳性，深紫色 2、乳酸酚棉蓝染色：适用于各种真菌的直接检查、培养物涂片检查
及小培养标本保存等。 3、墨汁染色：用于检查有荚膜的真菌，如新生隐球菌。
6、其他:瑞氏染色法，常用于组织或骨髓标本中组织胞浆菌和马尔尼 菲青霉菌等真菌的检查。嗜银染色法（GMS法）。黏蛋白-卡红 （MCS）染色法用于新生隐球菌的鉴别。
二、培养与鉴定技术
常用真菌培养基及用途
培养基名称 沙保弱培养基 放线菌酮-氯霉素琼脂 玉米粉聚山梨脂-80琼脂
马铃薯葡萄糖琼脂
尿素琼脂
推荐抗真菌药物敏感试验的方法有：稀释法、纸片扩散法。
三、其他非培养检验技术
免疫学检验技术：皮肤试验、血清学测定 隐球菌乳胶抗原凝集试验： 1、99%中枢神经系统感染患者阳性； 2、早期、快速检测隐球菌病； 3、滴度可反应治疗效果及预后。
分子生物学检验技术
G试验和GM试验
G试验可早期诊断多种临床常见的侵袭性真菌感染疾病， 但不能用于检测隐球菌和接合菌感染。
第二章 真菌检验基本技术
目录
一、形态学检查 二、培养与鉴定技术 三、其他非培养检验技术
一、形态学检查
意义：
1、有诊断意义； 2、代表组织相； 3、判断某些真菌的致病性。
一、形态学检查
取材： 皮屑：
75%酒精消毒皮损
选皮损边缘、疤壁、脓液处
刮取皮屑
10%KOH涂片
沙保弱琼脂培养两周
一、形态学检查