细胞工程

•器官培养 以植物的根、茎、叶、花、果等器官为外植体的
•组织培养 以分离出植物各部位的组织（如木质部、表皮、
皮层、胚乳组织、薄壁组织、髓部等），或已诱导的愈伤组织 为外植体的离体无菌培养。
•细胞培养 以单个游离细胞为接种体的离体无菌培养。 •原生质体培养 以除去细胞壁的原生质体为外植体的离体无
菌培养。
动物细胞工程
• 细胞核移植与动物克隆
制备
（1）胚状体制备及其同步生长 （2）人工胚乳的制备 （3）配制包埋剂及包埋
人工种子
人工种子
模仿天然种子结构制造出来的生命有机体，能象 种子一样萌发再生，长成植物。其核心“部件”是—个 被外层物包埋的具有类似种胚功能的胚状体，在其发 育早期与不定芽相似，但具有极性，可以分化出茎端 和根端。 胚状体可从悬浮培养的单细胞或通过试管培养的 愈伤组织、花粉或胚囊而获得，一般在培养物的表面 产生，是无性繁殖的产 物。 我国利用组织培养法已成功地在烟草、水稻、小 麦、 玉米、甘蔗、棉花等作物上诱导出了胚状体。 将胚状体包埋在一个能提供营养的胶质种囊里，便成 了所谓的“人工种 子”。
单克隆抗体技术
根据阿根廷科学家米尔斯坦和德 国科学家柯勒设计的实验方案:
• 实验目的:制备单克隆抗体。 • 实验原理：B淋巴细胞能产生抗体，骨髓瘤细 胞能无限增殖，杂交瘤细胞既能产生抗体又能 无限增殖。 • 实验材料：小白鼠 • 实验器材：培养皿、针筒等等。
单克隆抗体技术
单克隆抗体制备过程
单克隆抗体技术
植物细胞工程
植物再生途径
体细胞胚（胚状体、不定根）
外植体
（胚性愈伤组织 或脱分化细胞） 不定器官
具有根颈的两极器官 先茎后根 先根后茎
完整植株
单极器官
外植体—能被诱发产生无性增殖系的器官或组织切段。
通过哪种途径再生，与试验材料、培养基特 别是添加的激素有关。
细胞工程
植 物 细 胞 工 程
通常采用的 技术手段 所采用技术 的理论基础
在无菌和人为控制外因（营养成分、光、 温、湿）的条件下，体外培养植物组织器 官，进而从中分化、发育出整体植株的技术。
单个 细胞 营养培养基 克隆植株
植物细胞工程
植物组织培养分类
•胚胎培养
以从胚珠中分离出来的成熟或未成熟胚为外植体 的离体无菌培养。 离体无菌培养，如根尖和切段，茎尖，叶片、叶柄，花器的花 瓣、雄蕊（花药、花丝）、胚珠、子房、果实等。
原生质体融合
融合体 再生壁
原生质体B 细胞分裂
杂种植株
愈伤组织
杂种细胞
植物体细胞融合
• 去壁的常用方法
酶解法（纤维素酶、果胶酶等）
• 原生质体融合方法
物理法：离心、振动、电刺激等 化学法：聚乙二醇（PEG）
植物体细胞融合
关于细胞融合
两个植物细胞融合的障碍？
细胞壁，不是原 生质。 胞壁的化学成分。
基本概念
•灭菌
用物理或化学因子，使存在于物体 中的所有生活微生物，永久地丧失 其生活力，包括最耐热的细菌芽孢。 这是一种彻底的杀菌措施，通过 灭菌的物品不在存在任何有生命的有 机体。
基本概念
•无菌
即没有活的微生物存在。例如，实 验室中的无菌操作技术、食品工厂 的无菌包装、防止微生物污染的无 菌室、经过灭菌或过滤后的无菌空 气等。
不损伤细胞如何去除细胞壁？ 酶解法，依据细
去壁后的原生质叫做什么？ 原生质体，物理， 化学，膜的流动性。 融合的方法、原理？
植物体细胞融合
植物原生质体制备
• 取材、除菌 • 酶解：纤维素酶、果胶 酶、蜗牛酶等。 • 分离：过滤、离心。 • 洗涤：渗透压稳定剂。 • 鉴定：荧光显微镜法。
植物体细胞融合
植物组织培养 植物体细胞融合
植物细胞的全能性
细胞工程 细胞的全能性 • 定义
生物体的细胞具有使后代细胞形成完 整个体的潜能的特性。 生物体的每一个细胞都包含有该物种 所特有的全套遗传物质，都有发育成 为完整个体所必需的全部基因，从理 论上讲，生物体的每一个活细胞都应 该具有全能性。
• 原理
细胞工程 植物细胞培养
植物原生质体融合
• 化学诱导法：PEG、高 Ca2+、高pH。 • 物理诱导法：微电极法。
植物体细胞融合
杂合体的鉴别与筛选
• 显微镜鉴别法
• 遗传互补法 • 细胞与分子生物学鉴别法 • 在生植株形态特征鉴别法
植物细胞工程
• 单倍体育种
单倍体(haploid):只有一个染色体组（只含有体细 单倍体 胞染色体数目一半）的细胞或者个体。 天然：如孤雌繁殖途径，植物细胞不经受精而发育 天然 成单倍体胚，继而长成单倍体植株。 人工诱导：例如，用花药或花粉培养。单倍体植物 人工诱导 很小，生活力弱，完全不育（染色体不平衡）。 * 单倍体通过加倍以后可以得到纯二倍体。缩短育 种时间，保证基因纯合存在，不会发生分离。
植物细胞工程
染色体加倍
秋水仙素的作用：抑制处在分裂盛期的细胞纺锤 丝的形成，染色体的长度收缩；但不影响染色体 的纵裂。由此使细胞停顿在分裂中期，染色体虽 能复制，但不能分向两极，造成染色体数目加倍 而成多倍体。当药剂洗净后，细胞便可恢复正常 的分裂。
植物细胞工程
• 人工种子的研制
人工种子及人为制造的种子，是一种 含有植物胚状体或芽、营养成分、激素以 及其他成分的人工胶囊。
植物细胞工程
单倍体在植物育种上的重要性
单倍体染色体加倍可获得纯合二倍体 有利于远缘杂交新类型的培育和稳定 与诱变育种相结合可加速育种进程 可作为外源基因转化的受体系统
植物细胞工程
花粉培养
花粉的分离
机械分离法 自然散落法
花粉的培养
浅层液体培养法 看护培养法
植物细胞工程
单倍体培养物的加倍
染色体的人工加倍方法 • 物理法：如温度骤变、机械损伤、电离和非电离 辐射、离心力等 。 • 化学法：如秋水仙素、吲哚乙酸、氧化亚氮 (N20) 等处理。 应用最普遍而有效的方法是用秋水仙素处 理。
定义 两个来自不同植物的体细胞融合成
一个杂种细胞，且把杂种细胞培育 成新的植物体的方法。
优势 打破了不同种生物间的生殖隔离限
制，大大扩展了可用于杂交的亲本 组合范围。
纯化后的原生质体
原生质体的融合
(1) (2) (1) (5) (3)
(4)
植物细胞工程
植物体细胞融合
植物A细胞 去壁 植物B细胞 原生质体A
植物细胞具有全能性。从植物的幼胚、根、茎、 叶、花和果实等不同器官的组织中分离的单个细 胞，经过特殊培养形成愈伤组织，并可进一步诱 导生成完整的植株。
植物组织培养
细胞的全能性
培养液中添加矿质和有 细胞分化时利用，试 管苗未形成时细胞赖 机养料的作用？ 以生存的条件。 整个过程进行彻底灭菌 一些微生物的代谢生 消毒、严格无菌操作？ 长比未分化的细胞快。
细胞培养
动物、植物、微生物细胞在体外 无菌条件下保存和生长。
取材 消毒 预处理 培养基灭菌 接种 体外培养
基本概念
• 消毒
杀死或消除所有病原微生物的措 施，达到防止传染病传播的目的。
例如，将物体煮沸（100℃）10min或60 〜70℃加热处理30min，可杀死病原菌的营养 体，但决非杀死所有芽孢，常用于牛奶、食品以 及某些物体表面的消毒。
人工种子应用前景
作为21世纪极具发展潜力和经济价值的高科技 成果，人工种子的突出优点： ① 不受环境因素制 约，一年四季进行工厂化生产；② 胚状体是经人 工无性繁育产生，有利于保存种系的优良性状； ③ 与试管苗相比，人工种子成本更低，更适合于 机械化田间播种，并可根据需要在人工胚乳中添 加适量的营养物、激素。农药、抗生素、除草剂 等，以利胚状体的健康生长。
动物细胞工程 无血清培养 •无血清培养基
①基础培养基：普通干粉培养基（DME、HamF12） ②基质因子（胎球蛋白、胶原、多聚赖氨酸等） ③生长因子、激素、维生素等微量物质
动物细胞工程 培养物的长期保存
• 经典传代法：关键？无菌传代。 经典传代法 • 冷冻保存法：具有操作简便、保存期长的特点。 冷冻保存法 以液氮保存法为例：
（1）将成熟培养物（细胞）与5％～10％的甘油或二甲亚矾 混匀，封装于若干个安瓶瓶中； （2）缓慢降温（每分钟1～3℃）至-30℃； （3）继续降温（每分钟15～30℃）至-150℃； （4）转移至液氮冻存，可无限期保存。 若安瓶瓶置-70℃冷存，保活期通常只有几个月。在90℃下培养物可保存半年以上。
单克隆抗体技术
单克隆抗体的应用
主要用于疾病的诊断、治疗和预防。与常规抗 体相比，具有特异性强、灵敏度高的优点。如；各 种癌症、肝炎病毒、SARS病毒、细菌及血吸虫等 数百种疾病的诊断；在疾病治疗方面，单克隆抗体 犹如人体卫士，能识别“自己”与“异己”，一旦发现 致病因素便与之结合将其杀死。若在单抗上带上抗 癌药物制成“生物导弹”，将药物定向带到癌细胞所 在部位，既消灭了癌细胞又不会伤害健康细胞。
培养
动物细胞工程
大量培养动物细胞方法
• 微导管培养法 • 微载体培养法 • 微胶囊培养法
动物细胞工程
动物细胞培养
动物细胞工程 组织培养法
目的组织 漂洗 切割 1〜2mm2小块 培养瓶 倒置15〜30min 翻回平卧 37℃培养
动物细胞工程 培养物传代
难题：组织培养物细胞贴壁生长？ 物理法（冲洗、刮取）、化学法（酶 解）剥离，漂洗后移置于新培养瓶。
基本概念
•培养基
人工配制适于微生物生长繁殖 或积累代谢产物的营养基质。
细胞工程基础
细胞融合/细胞杂交
通过生物学、化学或物理学的方法，使两 个（或多个）不同种类的体细胞合并、染色体 重组，从而产生具有两个亲本遗传性状的新细 胞。 原生质体制备 诱导细胞融合 筛选杂合细胞
细胞工程
植物细胞工程
• 植物组织培养
细胞工程
动物细胞工程
• 细胞培养
离体细胞在无菌培养条件下的分裂、生 长，在整个培养过程中细胞不出现分化，不 再形成组织。
• 组织培养
动物体的某类组织在体外培养时，细胞 一直保持原已分化的特性，该组织的结构和 功能持续不发生明显变化。
动物细胞工程 细胞培养法
组织器官（细胞来源） 剪碎 胰蛋白酶
单个细胞 洗涤 离心
悬浮细胞培养系统 固定化细胞培养系统
无菌空气入口
海藻酸钠+细胞悬浮液
空气出口 盖子 喷嘴
含CaCl2的培养基
大规模植物细胞固定化装置
植物细胞工程 固定化植物细胞技术路线
无菌大量培 养植物细胞 4%海藻酸 钠，灭菌
等 量 混 合
尼 龙 网
2% CaCl2 浸浴
海藻酸 钙固定 的细胞
植物细胞工程
• 植物细胞原生质体融合
植物细胞全能性的必要条件
离体、完全营养、外界条件
植物细胞工程
植物组织培养过程
离体植物 脱分化 再分化 器官、组 愈伤组织 织或细胞
根、芽
营养生长
植物体
细胞工程 植物组织培养条件
含有全部营养成分的培养基、一 定的温度、空气、无菌环境、适合的 pH、适时光照等。
胚性愈伤组织
植物组织培养
脱分化阶段
本 章 要 点
• 细胞工程基础 • 植物细胞工程 • 动物细胞工程 • 微生物细胞工程
细胞工程
细胞工程基础
细胞工程定义
在细胞水平上研究、开发、利用 各类细胞的工程。将一种生物细胞中 携带全套遗传信息的基因或染色体全 部转入另一种生物细胞，从而改变细 胞的遗传性，改造生物的性状和功能。
细胞工程基础
动物细胞工程 污染的防治
•灭菌与无菌操作 •防止细胞系株之间的交叉污染
（1）在一个工作区内不能同时放置两种以上细 胞株，除非由于细胞融合等工作需要的暂 时存放。 （2）两种细胞株不能共用培养器具，即使器具 消毒后也是如此。
动物细胞工程
• 动物细胞融合
物理法（电激诱导） 化学法（PEG) 生物法 紫外线
脱分化的目的？ 恢复全能性
脱分化和再分化 的主要因素？
植物激素（分裂素、 生长素）
植物组织培养 成活阶段
小苗（玻璃瓶） 人工气室 移栽室外
叶肉组织
愈伤组织
新植株
植物细胞工程
• 次生代谢产物
植物在生长过程中，体内积累的一些 中间分子，通常不参与植物的基本生命过 程。如生物碱、苷类、黄酮类等。 工业化
仙台病毒
丧失感染活性 （不感染细胞） 保百度文库融合活性 （诱导细胞融合）
融 合 过 程 示 意 图
动物细胞工程
• 单克隆抗体技术
概念 • 单: 单个细胞 • 克隆: 无性繁殖 • 抗体: 化学性质单一、特异性强。
动物细胞工程
单克隆抗体
将免疫Ｂ淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合 在一起，形成杂交瘤细胞。这种细胞既能 够像肿瘤细胞那样长期进行无性繁殖，又 能像Ｂ淋巴细胞那样分泌抗体。由于这种 抗体是由单一的无性繁殖细胞系B淋巴细 胞产生的，故称为单克隆抗体。