外源基因的表达

•Ⅱ型启动子
Ⅱ型启动子所属基因绝大多数编码蛋白质。
转录起始位点
TATA框（Hogness框）：富含AT的保守序列区，它 启动子 与DNA双链的解链有关，并决定转录起始点的选择。 基本区 其中心点位于转录起始点上游－20～－30bp的位置。 CAAT框：位于转录起始位点上游－75bp处，与RNA 聚合酶的结合有关。 GC框：位于转录起始位点上游－100～－300bp处， 与转录因子的结合有关。
s factor:
6.2.1.4 启动子的分离
随机克隆法 聚合酶保护法 过滤膜结合法 PCR扩增法
6.2.2 增强子
增强子（enhancer）：是能够增强启动子转录活性的DNA 顺式作用序列，又称强化子。 增强子的特性：
双向性。
重复序列。 增强子行使功能与所处的位置无关。
特异性。
增强子不仅与同源基因相连时有调控功能，与异 源基因相连时也有功能。
序列特异性
*启动子的特征 方向性 位置特性 种属特异性
6.2.1.1 原核生物的启动子
•转录起始位点：大多数细菌启动子转录起始区的序列为 CAT，转录从第二个碱基开始，该碱基为嘌呤碱基 （A/G）。 •Pribnow框： －10bp处的TATA区，又称－10序列区。 •Sextama框： －35bp处的TTGACA区，又称－35区。 •间隔区：内部无明显的保守性，其序列的碱基组成对启 动子的功能不十分重要，但其长度却是影响启动子功能的 重要因素。
6.1.3 外源基因mRNA的有效翻译
外源基因mRNA有效翻译必须考虑的基本原则：
AUG(ATG)是首选的起始密码子。
SD序列为与核糖体16S rRNA互补结合的位点，该序 列至少含有AGGAGG序列中的4个碱基。
SD序列与翻译起始密码子之间的距离为3～9个碱基。
在翻译起始区周围序列不易形成明显的二级结构。
在真核生物基因表达系统中，转录是在核内进行的，先生 成hnRNA，再加工去掉内含子，外显子相连接，并修饰5′和3′ 末端后才形成mRNA。而mRNA只能在细胞浆中的核糖体上转 译成多肽或蛋白质，再经过加工、糖化、形成高级结构。
6.1 基因表达的机制
6.1.1 外源基因的起始转录
外源基因的起始转录是基因表达的关键步骤。转录起始 的速率是基因表达的限速步骤。选择可调控的启动子和相关 的调控序列，是构建一个表达系统首先要考虑的问题。 诱导型启动子：如lac、trp、λPR、 λPL、 tac等的启动子
6.2.3 终止子
本征终止子：不需要其他蛋白辅助因子便可在特殊的RNA 结构区内实现终止作用。 依赖终止信号的终止子：要依赖专一的蛋白质辅助因子。
①本征终止子
两大特征 发夹结构(茎环结构)：延缓RNA聚合酶的运动， 不终止RNA的合成，但为转录终止创造条件。
寡聚U组成的尾部：转录的终止信号。
②依赖型终止子
6.3 外源基因表达系统
外源基因表达系统：泛指目的基因与表达载体重组后，导入 合适的受体细胞，并能在其中有效表达，产生目的基因产物 （目的蛋白）。 基因表达载体 外源基因表达系统
受体细胞
原核生物基因表达系统：如大肠杆菌表达 系统、芽孢杆菌表达系统、链霉菌表达系 统、蓝藻表达系统等。 真核生物基因表达系统：如酵母表达系 统、植物细胞表达系统、昆虫细胞表达 系统、哺乳动物细胞表达系统等。
Low Trp
High Trp
6.2.5 绝缘子
绝缘子（insulator）： 既是基因表达的调控元件，也是一种边界元件； 它能阻止邻近的调控元件对其所界定基因的启动子起增强 或抑制作用；
绝缘子抑制增强子的功能是有极性的。它只能抑制处于绝 缘子所在边界另一侧的增强子的作用，而对处于同一结构域 的增强子没有抑制作用；
在RNA合成起始以后，ρ因子即附着在新生的RNA链上，靠ATP水解产生的 能量，沿着5’ 3’方向朝RNA聚合酶移动，到达RNA的3’－OH端后取代了暂停 在终止位点上的RNA聚合酶，并从模板和酶上释放RNA，完成转录过程。终止过 程需要消耗能量，所以， ρ因子有终止转录和核苷三磷酸酶两种功能。
6.2.4 衰减子
• 翻译水平的调节
通过与mRNA的5 ′端SD序列结合，改变其空间构象，从而 影响核糖体在mRNA上的定位； 通过与mRNA的5′端编码区（如起始密码）结合，直接抑 制翻译的起始。 SD序列（SD sequence）：系Shine-Dalgarno序列的简称， 此为纪念最早发现该序列的研究者而命名的。它是原核生物 中核糖体的结合位点，亦即存在于mRNA分子AUG起始密 码子之前的多聚嘌呤序列AGGAGGG的部分或全部，可与 16S rRNA的3 ′-末端序列互补。SD序列在核糖体同mRNA的 结合过程中起重要作用。
基因表达在原核生物与真核生物中的差别？
目前已构建出了多种基因表达系统，包括原核生物表达系 统和真核生物表达系统，不同的表达系统具有各自的特点。
在原核生物中，基因表达是以操纵子的形式进行的。当操 纵子的调节基因与RNA聚合酶作用时，结构基因则开始转录成 相应的mRNA，与此同时， mRNA立即与核糖体结合转译出相 应的多肽或蛋白质，转录完毕时转译也完成，随之mRNA也被 水解掉。
终止位点上游50～90bp区域，是ρ因子的识别位点。 ρ 因子依赖型终止子也能形成茎环结构，但茎环的GC含量较 低，因此RNA聚合酶在此移动的速度减慢，但停留时间较 短，并且茎环结构的下游没有寡聚U结构，RNA聚合酶只能 在ρ因子的协助下才能有效终止转录。
ρ因子是一个相对分子量为2.0×105的六聚体蛋白质分 子，它能水解各种核苷三磷酸，实际上是一种NTP酶。由 于它催化NTP的水解， ρ因子能促使新生的RNA链从三元 转录复合物中解离出来，从而终止转录。
衰减子（attenuator）：是位于mRNA分子前导序列中的一段控 制蛋白质合成起始速率的调节区，亦即发生弱化作用的转录终 止信号序列，又称弱化子。 衰减子最先发现于大肠杆菌色氨酸（trp）操纵子中。
trp前导区的4个片段（1、2、3、4）能以两种不同的方式进行碱基配对， 有时以1-2和3-4配对，有时只以2-3配对。 在前导肽基因中有两个相邻的色氨酸密码子，所以前导肽的翻译对 tRNATrp的浓度很敏感。当培养基中trp浓度很低时，负载有trp的tRNATrp也 就少，这样翻译通过两个相邻trp密码子的速度就很慢，当4区被转录完成时， 核糖体才进行到1区（或停留在两个相邻的trp 密码子处），这时前导区结构 是2-3配对，不形成3-4配对的终止结构，所以转录可继续进行，直到trp操纵 子中的结构基因全部转录。而当trp浓度高时，核糖体可顺利通过两个相邻 的trp密码子，在4区被转录之前，核糖体就到达2区，这样使2-3不能配对， 3-4区可自由配对形成茎－环状终止子结构，终止转录。所以，弱化子对 RNA聚合酶的影响依赖于前导肽翻译中核糖体所处的位置。
第六章 外源基因的表达
基因重组的主要目的是要使目的基因在某一细胞中能 得到高效表达，即产生人们所需要的高产目的的基因产物， 如蛋白质、多肽类生物药物。 基因工程技术的核心是基因表达技术。 基因表达是指结构基因在调控序列的作用下转录成 mRNA，经加工后在核糖体的协助下又转译出相应的基因 产物——蛋白质，再在受体细胞环境中经修饰而显示出相 应的功能。从基因到有功能的产物这整个转录、转译及所 有的加工过程就是基因表达的过程，它是在一系列酶和调 控序列的共同作用下完成的。
绝缘子对基因表达的调控是一个非常复杂的过程，它是通 过细胞内特定的蛋白质因子相互作用而产生调控效应的。
6.2.6 反义子
反义RNA（antisence RNA）：同某种天然mRNA反向互补的 RNA分子称为反义RNA，它是由双链DNA中的无意义链转录产 生的，可以用来阻止被其转化的细胞中存在的与之互补mRNA 的转译活性。现在编码反义RNA的基因已在基因工程中得到应 用，此项技术特称为反义技术学（antisence techology）。 反义子：编码反义RNA的DNA称为反义子。 反义子在DNA的复制、转录和翻译三个水平对基因的表达 起调节作用，其中以对蛋白质合成的抑制最为普遍。
• 复制水平的调节
直接抑制——反义RNA与引物RNA前体互补，使得引物 RNA无法与DNA模板结合，进而抑制DNA复制的频率。 间接抑制——反义RNA通过阻断复制激活蛋白因子的合成 而间接抑制DNA的复制。
• 转录水平的调节
反义RNA通过与mRNA的5 ′端互补结合而阻止转录的延伸； 作用于mRNA的poly(A)区域，抑制mRNA的成熟及其运输； 与真核生物mRNA结合而影响其剪切加工。
6.1.5 目的基因沉默
位置效应的基因沉默： 是指基因在基因组中的 位置对其表达的影响 基因沉默的 作用机制 转录水平的基因沉默： 是在DNA水平上的基因 调控 转录后水平的基因沉默： 是在RNA水平上的基因 调控
6.2 基因表达的调控元件
6.2.1 启动子
启动子（promoter）：是一段提供RNA聚合酶识别和结合 的DNA序列，它位于基因的上游。RNA聚合酶正是通过 与它的结合而启动基因的转录。原核基因启动子具有－10 和－35序列等结构元件，而真核基因启动子则具有TATA 盒及上游元件等特征结构。
不同基因组使用密码子具有选择性。 主密码子（major codon） 罕用密码子（rare codon） 如果外源基因mRNA的主密码子与受体细胞基因组的 主密码子相同或接近，则该基因表达的效率就高； 反之，若外源基因含有较多的罕用密码子，其表达效 率就低。
6.1.4 表达蛋白在细胞中的稳定性
避免外源基因表达蛋白降解的对策： 构建融合蛋白表达系统 构建分泌蛋白表达系统 构建包涵体表达系统 选择蛋白水解酶基因缺陷型的受体系统
辅助区
•Ⅲ型启动子
内启动子： 位于转录起始位点的下游，如tRNA和5SRNA 的启动子。 外启动子： 位于转录起始位点的上游，缺乏相应的内部 序列，如脊椎动物U6核小RNA和7SKRNA启 动子，结启动