微生物革兰氏染色法和芽孢染色法
微生物染色技术
简单染色法革兰氏染色法抗酸染色法死菌鉴别染色法芽孢染色法姬姆萨染色法细菌染色法活菌：美蓝或氧化三苯基四氮唑（TTC）染料：染料是一类苯环上带有发色基团和助色基团的有机化合物。
前者赋予染料颜色特征，后者使染料能形成盐。
染料通过离子键、共价键或疏水作用实现染色常用的微生物细胞染料都是盐，分酸性染料和碱性染料两大类：美蓝（即亚甲蓝）、结晶紫、碱性复红、番红（即沙黄）、孔雀绿等都属于碱性染料；酸性复红、伊红及刚果红属于酸性染料。
碱性染料带正电荷酸性染料带负电荷。
微生物染色原理：在中性、碱性或弱酸性溶液中，细菌细胞通常带负电荷；碱性染料在电离时，其分子的染色部分带正电荷，易与细胞结合使其着色。
细胞处于酸性条件下（如细菌分解糖类产酸），所带正电荷增加，可采用酸性染料染色。
染色种类:简单染色：利用单一染料对菌体进行染色。
常用碱性染料进行简单染色，这是因为：细菌的等电点较低，pH值大约在2—5之间，故在中性、碱性或弱酸性溶液中，菌体蛋白质电离后带阴电荷；而碱性染料电离时染料离子带阳电。
因此，带阴电的细菌常和带阳电的碱性染料进行结合。
所以，在细菌学上常用碱性染料进行染色。
常用作简单染色的染料有：美蓝、结晶紫、碱性复红等。
操作步骤1．涂片：用灼烧灭菌冷却后的接种环挑取少量菌体与水滴充分混匀，涂成极薄的菌膜。
2．干燥：可自然晾干，或将涂片置于火焰高处微热烘干，但不能直接在火焰上烘烤。
3．固定：手执玻片一端，有菌膜的一面朝上，通过迅速通过火焰2-3次（用手指触涂片反面，以不烫手为宜）。
4．染色：加适量(以盖满菌膜为度)结晶紫染色液(或石炭酸复红液)，染l～2min。
5．水洗：用自来冲洗至流下的水中无染色液的颜色时为止。
6．干燥7．镜检鉴别染色：使用两种以上的染料进行染色，以区分不同类群的细菌，如革兰氏染色。
革兰氏染色:原理：G-菌的细胞壁中含有较多易被乙醇溶解的类脂质，而且肽聚糖层较薄、交联度低，故用乙醇脱色时溶解了类脂质，增加了细胞壁的通透性，使初染的结晶紫和碘的复合物易于渗出，结果细菌就被脱色，再经番红复染后就成红色。
细菌形态学检查染色方法
细菌形态学检查染色方法
细菌形态学检查是微生物学中非常重要的一部分，它可以帮助
我们了解细菌的形态特征，有助于诊断和治疗疾病。
在细菌形态学
检查中，染色方法是一项关键的技术，它可以使细菌在显微镜下更
容易观察和分辨。
以下是几种常用的细菌染色方法：
1. 革兰氏染色法，革兰氏染色法是最常用的细菌染色方法之一。
它可以将细菌分为革兰氏阳性和革兰氏阴性两类。
在这种染色方法中，先用紫普鲁士蓝染色，然后用碘液固定，再用酒精脱色，最后
用洋红染色。
革兰氏阳性细菌会呈紫色或蓝色，而革兰氏阴性细菌
则会呈粉红色。
2. 厌氧染色法，厌氧染色法是专门用于观察厌氧菌的染色方法。
它与革兰氏染色法类似，但在脱色步骤中使用氢氟酸而不是酒精，
这样可以更好地保留厌氧菌的形态特征。
3. 阳性染色法，阳性染色法用于观察细菌的细胞壁结构和形态
特征。
在这种染色方法中，通常使用甲基蓝或结晶紫等染料，可以
使细菌呈现出蓝色或紫色。
4. 阴性染色法，阴性染色法也是用于观察细菌细胞壁结构和形态特征的一种方法。
与阳性染色法不同的是，阴性染色法使用印度墨染料，可以使细菌呈现出浅红色或粉红色。
除了上述列举的染色方法外，还有许多其他特殊的染色方法，如荧光染色、折射染色等，它们都可以根据需要来选择使用。
细菌形态学检查染色方法的选择取决于所研究的细菌种类、研究的目的以及实验室的设备和条件等因素。
希望这些信息可以帮助你更好地了解细菌形态学检查染色方法。
实验一 微生物的简单染色、革兰氏染色和芽胞染色
实验一微生物的简单染色、革兰氏染色和芽胞染色赵奕玲 121180169一．实验目的1．掌握细菌涂片标本的制备方法和普通染色的步骤；2．掌握革兰氏染色法的步骤和关键点；3．掌握芽胞染色的步骤要点；4．识别细菌的革兰氏染色和芽胞染色的结果；5．学习无菌操作技术。
二．实验原理一般认为革兰阳性细菌的肽聚糖层较厚，经乙醇处理后使之发生脱水作用而使孔径缩小，结晶紫与碘的复合物保留在细胞内而不被脱色；而革兰阴性细菌的肽聚糖层很薄，脂肪含量高，经乙醇处理后部份细胞壁可能被溶解并改变其组织状态，细胞壁孔径大，不能阻止溶剂透入，因而将结晶紫与碘的复合物洗去而被脱色。
虽然如此，革兰染色的差异并不能完全认为是化学的差别，也有物理结构不同的结果，因为酵母菌细胞壁的成份完全和细菌不同，但具有革兰染色阳性反应。
芽孢是芽孢杆菌属和梭菌属生长到一定阶段形成的一种抗逆性很强的休眠体结构，通常为圆形或椭圆形。
芽孢壁厚、透性低，着色、脱色均较困难。
因此，用着色力强的染色剂（如孔雀石绿）在加热条件下进行染色时，染料不仅可以进入菌体，而且也可以进入芽孢，进入菌体的染料可经水洗脱色，而进入芽孢的染色的染料则难以透出，若再用复染液（如沙黄水溶液）染色后，芽孢仍然保留初染剂的颜色，而菌体被染成复染剂的颜色，即菌体和芽孢分别染成红色和绿色易于区分。
三．实验器材载玻片，盖玻片，接种环，酒精灯，显微镜、擦镜纸、镜油、擦镜液；结晶紫、革氏碘染液、95%酒精、番红染液；枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和未知菌的18小时的液体培养液，酵母菌平板，大肠杆菌平板，牙垢。
四．实验步骤（一）革兰氏染色1.涂片左手持菌液EP管，右手持接种环，在火上对接种环灭菌后，从EP管中取一环培养液，于载玻片中央涂成薄层（事先在背面做好标记圆圈），将接种环在火焰上烧灼灭菌。
若是从平板上取材，则事先在载玻片上滴一小滴水，在火焰附近把平板打开一小口，用接种环调取菌落边缘的物质涂于水滴上。
实验二 细菌的革兰氏染色与芽孢染色
实验二细菌的革兰氏染色与芽孢染色一、目的要求1.学习微生物涂片、染色的基本技术，学习并初步掌握细菌的革兰氏染色法。
2.了解革兰氏染色法的原理及其在细菌分类鉴定中的重要性。
二、实验材料1.菌种：金黄色葡萄球菌（StapHylococcus aureus）大肠杆菌（E.coli）2.试剂：草酸铵结晶紫、路哥氏碘液、95%乙醇、番红液3.其他：显微镜、载玻片、接种环、酒精灯、无菌水、香柏油、二甲苯等。
三、实验原理革兰氏染色法是细菌学中最重要的鉴别染色法。
是1884年由丹麦病理学家Christain Gram创立的。
通过革兰氏染色可把细菌区分为两大类。
革兰氏染色的基本步骤：先用结晶紫初染、次经碘液媒染、再用95%乙醇脱色、最后用蕃红复染。
经过此法染色后，细胞保留初染剂蓝紫色的细菌为革兰氏阳性菌；如果细胞染上复染的红色的细菌为革兰氏阴性菌。
大肠杆菌是标准的革兰氏阴性菌，金黄色葡萄球菌是标准的革兰氏阳性菌。
革兰氏染色的机理，与细菌细胞壁的化学组成和结构有关。
经结晶紫初染以后，所有的细菌都被染成蓝紫色。
碘作为媒染剂，它能与结晶紫结合形成复合物，从而增强了染料与细菌的结合力。
当用乙醇脱色时，两类细菌的脱色效果是不同的，革兰氏阳性细菌的细胞壁主要由肽聚糖形成的网状结构组成、壁厚、类脂含量低，用乙醇脱色处理时细胞壁脱水、使肽聚糖层的网状结构孔径缩小，透性降低，从而使结晶紫-碘的复合物不易被洗脱而保留在细胞内；革兰氏阴性细菌的细胞壁中肽聚糖层在内层且较薄、类脂含量高，所以当脱色处理时，类脂被乙醇溶解、细胞壁透性增加，使结晶紫-碘的复合物被洗脱出来。
用蕃红复染时染上红色。
四、操作步骤基本流程：涂片→干燥→固定→染色（初染→媒染→脱色→复染）→镜检。
1.制片：取菌种培养物常规涂片、干燥、固定。
常规涂片法：取一洁净的载玻片，用特种笔在载玻片的左右两侧标上菌号，并在两端各滴一小滴蒸馏水，以无菌接种环分别挑取少量菌体涂片，干燥、固定。
实验二 细菌的形态观察(简单染色法和革兰氏染色法)
实验二细菌的形态观察（简单染色法和革兰氏染色法）一目的要求1．了解简单染色法和革兰氏染色法的基本原理，熟练掌握细菌的涂片与革兰氏染色技术。
2．初步学习细菌细胞特殊结构的染色方法，并观察细菌的特殊结构。
3．观察细菌的菌落平板，学会识别大肠杆菌、枯草杆菌和金黄色葡萄球菌的菌落特征，学会初步鉴别微生物的种类的方法。
二实验内容与原理1．简单染色法原理简单染色法是利用单一染料对细菌进行染色的一种方法，一般用于观察个体形态与细菌排列。
由于细菌在中性、碱性或弱酸性环境中带负电荷，所以通常采用一种碱性染料如美蓝、碱性复红、结晶紫对细菌进行染色。
美蓝是美蓝的盐酸盐，可解离为带正电荷的美蓝，很容易与细菌结合使菌体着色。
染色后的细菌细胞与背景形成鲜明的对比，在显微镜下更易于识别。
简单染色过程：涂片→固定→染色→水洗→干燥→镜检涂片→固定→干燥→水洗、吸干→镜检→染色 1mim2．革兰氏染色法原理革兰氏染色法是由丹麦医生 Hans Christian Gram于 1884 年创立。
它是细菌学中很重要的鉴别染色法，因为通过此法染色，可将细菌鉴别为革兰氏阳性菌（G + ）和革兰氏阴性菌（G －）两大类。
革兰氏染色过程：涂片→固定→结晶紫初染（1min）→碘液媒染（1min）→乙醇脱色（95% 酒精,30s）→番红复染（30 秒）→干燥→镜检阳性菌：紫色阴性菌：红色革兰氏染色要点：（1）初染：用结晶紫，染色 1 分钟，水洗。
（2）媒染：加碘液覆盖 1 分钟后水洗。
（3）脱色：连续滴加 95％乙醇，约 30 秒，直到滴下的乙醇无色为止，水洗。
（4）复染：加番红染色 1 分钟，水洗。
（5）干燥。
（6）镜检：先低倍镜，后油镜观察。
注意：涂片要薄而均匀，脱色程度要控制得当。
学生做大肠杆菌，金黄色葡萄球菌，枯草杆菌的革兰氏染色。
观察细菌个体形态与排列，绘图。
3．芽孢染色原理细菌的芽孢壁比营养细胞壁厚，致密，透性差，着色和脱色都比营养细胞困难，故一般采用一种碱性染料并在微火上加热，或延长染色时间，使菌体和芽孢都染上颜色以后水洗或稀酸冲去菌体的染料，芽孢仍保留颜色，再用另一种对比鲜明的染料使菌体着色，如此可明显区分芽孢和营养体结构。
环境微生物学-实验二 微生物的染色
实验二微生物染色一、实验目的1、进一步熟悉和掌握显微镜的操作方法；2、学习用压滴法制作标本片；3、学习微生物染色的原理；4、学习微生物涂片、染色的基本技术。
二、实验仪器和材料显微镜、香柏油（或液体石蜡）、二甲苯、擦镜纸、吸水纸、接种环、载玻片、酒精灯；美蓝染液，草酸铵结晶紫染液、革氏碘液、95%乙醇、蕃红染液；酵母菌、大肠杆菌、枯草杆菌。
三、染色原理微生物（尤其是细菌）的机体小且是无色透明的，在活体细菌内又含有大量的水分。
因此，对光线的吸收和反射与水溶液相差不大。
当把细菌悬浮在水滴内，放在显微镜下观察时，由于与周围背景没有明显的明暗差，难以看清它们的形状，更谈不上识别其细微结构。
通常用染料将菌体染上颜色以增加反差，在显微镜下观察。
微生物细胞是由蛋白质、核酸等两性电解质及其它化合物组成的，所以微生物细胞表现出两性电解质的性质。
两性电解质兼有碱性基和酸性基，在酸性溶液中离解出碱性基呈碱性，带正电；在碱性溶液中离解出酸性基呈酸性，带负电。
经测定，细菌的等电点pI在pH=2~5之间，故细菌在中性（pH=7）、碱性（pH > 7）或偏酸性（pH=6~7）溶液中，细菌等电点均低于上述溶液的pH值，所以细菌带负电荷，容易与带正电荷的碱性染料结合，故用碱性染料染色的居多。
碱性染料并不是碱而是一种盐，电解时染料离子带正电，易与带负电荷的细菌结合，而使细菌着色。
碱性染料有美蓝、甲基紫、结晶紫、龙胆紫、碱性品红、中性红、孔雀绿和蕃红（沙黄）等。
微生物体内各结构与染料结合力不同，故可用各种染料分别染微生物的各结构以便观察。
四、染色方法1、简单染色法简单染色法是利用单一染料对细菌进行染色的一种方法。
此法操作简便，适用于菌体一般形态的观察。
常用的简单染色染料有美蓝、结晶紫、碱性复红、番红（沙黄）等。
2、革兰氏染色法革兰氏染色反应是细菌分类和鉴定的重要性状。
它是1884年由丹麦医师Gram创立的。
革兰氏染色法不仅能观察到细菌的形态而且还可将所有细菌区分为两大类：革兰氏阴性细菌（G－）和革兰氏阳性细菌（G+）。
芽孢染色常用方法
芽孢染色是一种常用的微生物实验室技术，用于观察和鉴定细菌的孢子形态和结构。
以下是芽孢染色的常用方法：
1. 热锡烙法（Heat-fixed smear）：将含有芽孢的菌落用细火加热，使其附着在玻璃片上固定。
2. 革兰氏染色法（Gram staining）：首先用洗涤液将玻璃片上的菌落冲洗，接着用紫晶染液染色，再用碘液做固定，用乙醇洗去多余的染色剂，最后用洗涤液冲洗，接着用红素染液染色，最后用洗涤液冲洗干净。
3. 铁血素染色法（Iron-hematoxylin staining）：将菌落固定在玻璃片上，然后用铁血素溶液浸泡一段时间，最后用去离子水冲洗干净。
4. 格拉姆染色法（Spore staining）：将菌落固定在玻璃片上，然后用绿基（Malachite Green）染液浸泡，将玻璃片放入蒸汽中加热，再用水洗去多余染液，最后用红素染液进行反染。
以上是几种常用的芽孢染色方法，具体使用哪种方法取决于实验目的和需求。
微生物学实验3 细菌革兰氏染色和芽孢染色
2022/9/12
Hale Waihona Puke 32022/9/12
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革兰氏染色视频（单击播放）
2022/9/12
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实验三 细菌的革兰氏染色与芽孢染色
一． 实验目的
1. 学习并初步掌握细菌的革兰氏染色法。
2. 学习细菌芽孢染色的原理和方法。
二． 实验材料
1. 菌种：大肠杆菌
Escherichia coli、
金黄色葡萄球菌 Staphylococcus aureus
枯草芽孢杆菌 Bacillus subtilis
2. 染色液：草酸铵结晶紫染液、路哥氏碘液、 95%乙醇脱色液、番红染液、孔雀绿染液
➢ 芽孢染色：加1~2滴无菌水于小离心管中→ 用接种环挑 取2~3环菌苔于小离心管中，混匀，制成浓的菌悬液→ 加2~3滴孔雀绿小于离心管中，混匀→置于沸水浴中加 热染色15~20min→取底部菌液数环涂片→干燥→固定 →水洗脱色至流出的水无绿色为止→用蕃红染液染色 2~3min →水洗→干燥
➢ 镜检：
3. 其他：显微镜、载玻片、接种环、酒精灯、 无菌水、香柏油、二甲苯、擦镜纸、吸水纸等
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三． 实验原理：革兰氏染色的原理？芽孢染色原理？
四． 实验步骤
➢ 革兰氏染色：涂片→干燥→固定→结晶紫染液初染 1min →水洗→碘-碘化钾溶液媒染1min →水洗→ 95% 乙醇溶液脱色至流下的乙醇溶液无明显的紫色→立即 水洗→藩红染液复染1～2min →水洗→干燥
➢ 油镜维护：
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五. 实验内容
1. 对所给的两种菌进行混合涂片进行革兰氏染色和油镜 观察（上交一张自己满意的染色片）；
2. 对已进行芽孢染色的枯草芽孢杆菌进行涂片、脱色和 复染，并镜检。
染色方法生物
染色方法生物
1.革兰氏染色法：
-通过一系列步骤（初染、脱色、复染）区分细菌为革兰氏阳性菌（G+）和革兰氏阴性菌（G-），利用结晶紫初染，碘液媒染后，乙醇脱色过程中，两类菌对染料的保留能力不同，最后用稀释复红复染。
2.单染色法：
-使用一种染料直接染色，以观察微生物的整体形态和分布，不区分不同类型微生物。
3.乳酸酚棉蓝染色法：
-主要用于酵母菌、霉菌等真菌的染色，可以清晰地显示孢子、菌丝体及细胞壁结构。
4.抗酸染色法：
-如齐尼染色或荧光抗酸染色法，用于鉴别结核杆菌等抗酸性菌。
5.芽孢染色法：
-用于突出显示某些细菌如芽孢杆菌属和梭状芽孢杆菌属产生的内孢子，如孔雀绿染色法和石炭酸复红染色法。
6.荚膜染色法：
-例如印度墨水染色或荚膜染色，用于检测细菌表面的荚膜结构。
7.鞭毛染色法：
-如暗视野染色或Leifson's染色法，用于观察细菌的鞭毛结构。
8.死活染色法：
-包括LIVE/DEAD染色、美蓝染色等，用来区分活细胞和死细胞。
9.细胞化学染色法：
-如偶氮偶联法、联苯胺法、普鲁士蓝法、雪夫反应（PAS反应）、金属沉着法等，主要用于血液细胞、组织切片或特定生化成分的定位和定量分析。
2.细菌的革兰染色法、芽孢染色法
革兰氏染色的机理：
主要由于两类细菌的细胞壁成分{肽聚糖 （不溶于乙醇）和脂类（溶于乙醇）}和结 构{肽聚糖层的交联程度及厚度}不同而造 成的。 革兰氏阳性菌肽聚糖含量高（90％）交联 程度高，肽聚糖层厚（用乙醇不易脱色） 革兰氏阴性菌肽聚糖含量低（10％）交联 程度低，肽聚糖层薄（用乙醇易脱色）。
三、实验器材
1、菌种： 枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）（1
号—培养12h，用于革兰氏染色；2号—培养18h， 用 于 芽 孢 染 色 ） ， 培 养 24 小 时 的 大 肠 杆 菌 （Escherichia coli）用于革兰氏染色。
2、染色液和试剂： 草酸铵结晶紫染液、卢哥氏碘
→水洗→复染（番红2-3min）→水洗→干燥
→镜检
芽孢染色结果
（芽孢呈绿色，营养体呈红色）
注意事项
1、供芽孢染色用的菌种应控制菌龄，使 大部分芽孢仍保留在菌体上为宜。 2、染色加热过程要及时补充染液，切勿 让涂片干涸。
五、实验作业
绘出枯草杆菌和大肠杆菌的形态图，并注明两菌 的革兰氏染色的反应性。
液、95%酒精、番红染液、5％孔雀绿水溶液、生理 盐水、乙醚-乙醇溶液、香柏油。
3、器材： 废液缸、洗瓶、载玻片、接种环、酒精灯、
擦镜纸、显微镜等。
四、实验方法
革兰氏染色
制片→初染（结晶紫1min）→水洗→媒染
（碘液1min）→水洗→脱色（乙醇20-30s）
→水洗→复染（番红2min）→水洗→干燥→ 观察
革兰氏染色法是细菌学上最常用的鉴别染色法因为通过此法染色可将细菌鉴别为革兰氏阳性菌g主要由于两类细菌的细胞壁成分肽聚糖不溶于乙醇和脂类溶于乙醇和结构肽聚糖层的交联程度及厚度不同而造革兰氏阳性菌肽聚糖含量高90交联程度高肽聚糖层厚用乙醇不易脱色革兰氏阴性菌肽聚糖含量低10交联程度低肽聚糖层薄用乙醇易脱色
微生物革兰氏染色法和芽孢染色法ppt课件
精品
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实验结果
阳性菌（蓝紫色） 阴性菌（红色）
精品
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细菌芽孢染色法
实验目的
学习并掌握芽孢染色方法；初步了解芽孢杆 菌的形态特征。
实验原理
芽孢：某些细菌在一定的环境条件下，能在 菌体内部形成一个圆形或卵圆形小体，是细菌的 休眠形式。产生芽孢的都是革兰氏阳性菌。
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革兰氏染色原理
第一步：初染:结晶紫使菌体着上蓝紫色； 第二步：媒染:碘和结晶紫形成大分子复 合物，能被细胞壁阻留在细胞内；第三 步：酒精脱色:细胞壁成分和构造不同， 出现不同的反应——G+菌：细胞不能被 酒精脱色，仍呈紫蓝色；G-菌：酒精将 细胞脱色，细胞无色；第四步:番红复染， G-菌呈红色， G+菌呈紫蓝色。
精品
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细菌芽孢染色法
实验步骤
1）改良的Schaeffer-Fulton氏染色法 制备菌悬液 孔雀绿染液(2滴)水浴加热染色15-20 min 取1小滴，涂片，固定 水洗 番红染液复染23min，倾去染液，水洗 镜检 2）Schaeffer-Fulton氏染色法 涂片固定 孔雀绿染液在微火上加热染色5min 水洗 番红染液复染2min 水洗 镜检
实验二
革兰氏染色法和芽孢染色法
精品
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革兰氏染色法
实验目的
学习并掌握革兰氏染色方法；了解革兰氏染 色法的原理及其在细菌分类鉴定中的重要性。
实验原理
革兰氏染色法是细菌细胞的复合染色法，由 丹麦病理学家Hans Christian Gram 于1884年 创立。该法是细菌学中最重要的鉴别染色法。
精品
微生物实验预习报告 细菌革兰氏染色法及芽孢染色法实验
细菌革兰氏染色法及芽孢染色法实验一、实验目的1. 初步掌握细菌涂片方法及革兰氏染色的步骤；2. 掌握细菌芽孢染色的方法。
二、实验内容1. 制作细菌染色装片。
2. 进行革兰氏染色法操作。
三、实验材料和用具大肠杆菌(E．coli)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)菌液，枯草芽抱杆菌(Bacillus subtilis)的斜面菌种。
革兰氏染色液(结晶紫染液、卢戈氏碘液、95％乙醇、石炭酸复红液等)、香柏油、二甲苯和5％孔雀绿水溶液。
显微镜、擦镜纸、接种环、载玻片、吸水纸、试管、小滴管、酒精灯和烧杯。
四、操作步骤(一) 革兰氏染色1．涂菌用无菌操作方法从试管中沾取菌液一环，用接种环在洁净无脂的载玻片上做一薄而匀、直径约1cm的菌膜。
涂菌后将接种环火焰灭菌。
2. 干燥于空气中自然干燥。
亦可把玻片置于火焰上部略加温加速干燥(温度不宜过高)。
3．固定目的是杀死细菌并使细菌粘附在玻片上，便于染料着色，常用加热法．即将细菌涂片向上，通过火焰3次，以热而不烫为宜，防止茵体烧焦、变形。
此制片可用于染色。
4. 初染于制片上滴加结晶紫染液，染1min后，用水洗去剩余染料。
5. 媒染滴加卢戈氏碘液，1min后水洗。
6. 脱色滴加95％乙醇脱色，摇动玻片至紫色不再为乙醇脱退为止(根据涂片之厚薄需时30s至1min水洗。
7. 复染滴加石炭酸复红液复染1min，水洗。
8．用滤纸吸干,油镜镜检。
(二)芽孢染色法1．方法1(1) 取37℃培养18-24h的枯草芽孢杆菌作涂片，并干燥，固定(参见“细胞单染色法”) 。
(2) 于载片上滴人3—5滴5％孔雀绿水溶液。
(3) 用试管夹夹住载玻片在火焰上用微火加热，自载玻片上出现蒸汽时开始计算时间约4-5min。
加热过程中切勿使染料蒸干，必要时可添加少许染料。
(4) 倾去染液，待玻片冷却后，用自来水冲洗至孔雀绿不再褪色为止。
(5) 用0.5％沙黄水溶液(或o．05％碱性复红)复染1min，水洗。
实验 细菌的革兰氏染色及芽孢染色法
（三）实验器材
1.活材料：
2.染色液和试剂：
革兰氏染色：培养12h-16h枯草杆菌（Bacillus subtilis）和培养24h大肠杆菌（Escherichia coli） 芽孢染色：培养36 小时 的苏云金杆菌（Bacillus thuringiensis）或者枯草杆菌（Bacillus subtilis）
（7）水洗：用水洗去碘液。 （8）脱色：将玻片倾斜，连续滴加95%乙醇 脱色20—25s至流出液无色，立即水洗。 （9）复染：滴加蕃红复染2min。 （10）水洗：用水洗去涂片上的蕃红染色液。 （11）干燥：将染好的涂片放空气中晾干或者 用吸水纸吸干。 （12）镜检：镜检时先用低倍，再用高倍，最 后用油镜观察，并判断菌体的革兰氏染色反应性。
2.芽孢染色法原理：
Байду номын сангаас
细菌的芽孢具有厚而致密的壁，透性低，不易着 色，若用一般染色法只能使菌体着色而芽孢不着 色（芽孢呈无色透明状）。芽孢染色法就是根据 芽孢既难以染色而一旦染上色后又难以脱色这一 特点而设计的。所有的芽孢染色法都基于同一个 原则：除了用着色力强的染料外，还需要加热， 以促进芽孢着色。当染芽孢时，菌体也会着色， 然后水洗，芽孢染上的颜色难以渗出，而菌体会 脱色。然后用对比度强的染料对菌体复染，使菌 体和芽孢呈现出不同的颜色，因而能更明显地衬 托出芽孢，便于观察。
（五）实验报告
1.给出Bacillus thuringiensis和 Escherichia coli的形态图，并注明两菌的革 兰氏染色的反应性。 2. 当你对一株未知菌进行革兰氏染色时，怎样 能确证你的染色技术操作正确，结果可靠？ 3.绘图说明你所观察的枯草芽孢杆菌菌体形态， 芽孢的形态及着生位置。它们各呈什么颜色。 4.若涂片中观察到的只是大量游离芽孢，很少看 到芽孢囊和营养细胞，你认为这是什么原因？
实验五显微镜油镜的使用细菌的革兰氏染色及芽孢染色张理珉ppt课件-文档资料
一般光学显微镜（内置光源）的 调整要求
放大倍数的选择（物镜的选择，一般有4×、 10×、40×、100×）
光照强度（照明）的调节（灯泡电压高低的 调整）
聚光镜的调整（升降）——光线的会聚 孔径光栏的调整（大小）——通光量 瞳距调节（具体后面介绍） 屈光度调节（具体后面介绍） 以上各项综合调整，达到的唯一目的——物
实验五
显微镜油镜的使用 细菌的革兰氏染色和芽孢染色
目的要求
1、掌握细菌观察制片染色技术 2、掌握革兰氏染色和芽孢染色的原
理及方法步骤 3、掌握显微镜观察技术（油镜的原
理及使用）
实验内容一
显微镜油镜的使用 及显微技术的介绍
常用的度量单位
单位 1厘米 1毫米 1微米 1纳米 1埃
缩写 cm mm μm nm Å
明场观察显微镜的调节
瞳距调节 屈光度调节 光路转换 聚光镜中心 孔径光栏设置
瞳距调节
刻度指示
屈光度调节
屈光度调节指示
调节
光
路
100%
80%
转
换
20%
100%
聚光镜中心调节
②10X物镜
① 标本
④ 聚光镜升降旋钮 ③ 视场光阑
③ 孔径光阑 ⑤ 光轴中心调节螺钉
孔径光栏调节
二、一般光学显微镜的结构组成
普通光学显微镜光路及原理
显微镜的数值孔径值
镜口角——指从物镜光轴上的像点发出的光线与物镜前透镜有效直径的边缘 所张开的角度，即形成的光锥（ α：光锥角度的一半）； 数值孔径和显微镜的光学性能有密切的关系，它与显微镜的分辨力成正比， 与焦距成反比，与镜像亮度的平方根成正比 NA=η·sinα
可以调节背景和物体的颜色变化而达到理想的效果。 缺点：
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革兰氏染色法
实验器材
1）菌种： 大肠杆菌和枯草芽孢杆菌 2）染色剂：结晶紫，番红 3）器材：显微镜、酒精灯、载玻片、接种环、
双层瓶、擦镜纸等
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革兰氏染色法
实验步骤
混合涂片法涂片、干燥、固定 结晶紫初染1min， 水洗 碘液媒染1min，水洗 用滤纸吸去残水后， 将玻片倾斜，在白色背景下，用95%乙醇脱色，直至 流出的乙醇无色时，立即水洗 番红复染2min，水 洗 干燥后，镜检
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7
芽孢染色法原理
用弱碱性染料孔雀绿在加热条件下染色，使染料 不仅进入菌体，也可进入芽孢内。进入菌体的染 料经水洗后被脱色，而芽孢一经着色后难以被水 洗脱，当用对比度大的复染剂染色后，芽孢仍保 留初染剂的颜色，而菌体被染成复染剂的颜色， 使芽孢和菌体易于区分。
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细菌芽孢染色法
实验器材 1）菌种：枯草芽孢杆菌 2）染色剂：5%孔雀绿水溶液、0.5%番 红水溶液 3）器材：显微镜、滴管、酒精灯、载玻 片、接种环等
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细菌芽孢染色法
实验步骤
1）改良的Schaeffer-Fulton氏染色法 制备菌悬液 孔雀绿染液(2滴)水浴加热染色15-20 min 取1小滴，涂片，固定 水洗 番红染液复染23min，倾去染液，水洗 镜检 2）Schaeffer-Fulton氏染色法 涂片固定 孔雀绿染液在微火上加热染色5min 水洗 番红染液复染2min 水洗 镜检
第一步：初染:结晶紫使菌体着上蓝紫色； 第二步：媒染:碘和结晶紫形成大分子复 合物，能被细胞壁阻留在细胞内；第三 步：酒精脱色:细胞壁成分和构造不同， 出现不同的反应——G+菌：细胞不能被 酒精脱色，仍呈紫蓝色；G-菌：酒精将 细胞脱色，细胞无色；第四步:番红复染， G-菌呈红色， G+菌呈紫蓝色。
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实验结果Leabharlann 营养细胞（红色） 芽孢（绿色）
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实验二
革兰氏染色法和芽孢染色法
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革兰氏染色法
实验目的
学习并掌握革兰氏染色方法；了解革兰氏染 色法的原理及其在细菌分类鉴定中的重要性。
实验原理
革兰氏染色法是细菌细胞的复合染色法，由 丹麦病理学家Hans Christian Gram 于1884年 创立。该法是细菌学中最重要的鉴别染色法。
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革兰氏染色原理
注：乙醇脱色是革兰氏染色操作的关键环节，脱色 不足，阴性菌被染成阳性菌；脱色过度，阳性菌被 染成阴性菌
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实验结果
阳性菌（蓝紫色） 阴性菌（红色）
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细菌芽孢染色法
实验目的
学习并掌握芽孢染色方法；初步了解芽孢杆 菌的形态特征。
实验原理
芽孢：某些细菌在一定的环境条件下，能在 菌体内部形成一个圆形或卵圆形小体，是细菌的 休眠形式。产生芽孢的都是革兰氏阳性菌。