001凝胶过滤层析实验中Sephadex的溶胀与回收保存
实验凝胶过滤法使蛋讲义白质脱盐
4.收集检查 用刻度离心管收集洗出液，每管收集1ml。 边收集边进行蛋白质与铵盐的检查。 （1）取洗出液2滴加入白瓷板穴中，加入钠
氏试剂1滴，如有铵盐洗脱下来，则有黄红色沉 淀。
（2）取洗出液2滴置小试管中，加入磺柳酸 1滴，如有蛋白质洗脱下来，则有白色混浊或沉 淀出现。
谢 谢 各 位 聆 听
葡聚糖凝胶的商品名称为 Sephadex，它具有三维空间的 多孔网状结构，呈珠状颗粒。
本实验用G-25使蛋白质与(NH4)2SO4分离，当 蛋白质的盐溶液进入葡聚糖凝胶时，小分子的 (NH4)2SO4扩散进入G-25的网孔中，而大分子的 蛋白质因颗粒直径大，不能进入网孔中，被排阻 在凝胶颗粒的外面。加入洗脱液洗脱时，因大分 子的蛋白质从凝胶颗粒的间隙随洗脱液向下流动， 首先被洗脱下来，而小分子的(NH4)2SO4可以扩散 进出凝胶颗粒的网孔之中，随洗脱液移动时受到 阻滞力较大，在层析柱中移动较慢，这样蛋白质 与(NH4)2SO4很容易地分离开，从而达到对蛋白质 样品脱盐的目的。
实验凝胶过滤法使蛋白质脱盐
精品
【实验目的】
学习凝胶过滤法分离纯化蛋白质的原 理与操作技术
【实验原理】
凝胶层析又称分子筛层析、排阻层析或 凝胶过滤，是以凝胶为载体，根据蛋白质的 大小和形状，即蛋白质的相对分子质量进行 分离和纯化。
该方法广泛用于生物大分子的分离、纯 化、浓缩等。
凝胶是一类具有多孔立体网状结构的不溶 性珠状颗粒。多是交联的聚糖(如葡聚糖或琼脂 糖)类物质，用它来进行物质分离，主要是根据 多孔凝胶对不同相对分子质量的物质具有不同 的排阻效应实现的。
温溶胀 24小时 以上，反复倾 泻去掉细颗粒， 或沸水浴中煮沸 2～3小时，可去 除颗粒内部的空 气及灭菌。
凝胶层析技术(凝胶过滤)
四、凝胶层析的特点
1、凝胶是一种不带电荷的惰性物质，本身不 会与被分离物质相互作用，分离效果好，重 复性高。 2、设备简单，操作简便。
五、影响凝胶层析的因素
（一）凝胶的选择： （二）凝胶粒度对分离效果的影响 40-60目为粗粒。 100-200目为细粒（应用较多）能使洗脱曲线的峰区变得对 称和狭窄。 250-400目为最细粒。 （三）洗脱流速对分离效果的影响： 一般采用流速在30-200ml/小时，过快会使色层谱变形。 （四）离子强度和附值 （五）样品液体积对分离效果的影响 通常样品液体积约为凝胶床总体积的5-10%。 （六）凝胶柱的长度，直径和分离效果的关系 （七）Vo和Vi
其结构如图：
由右旋葡萄糖单位通过1.6-糖苷键连结成链状结构，再由 3-氯-1,2-环氧丙烷（Cl-CH2-CH-CH2）作交联剂而形成 的多孔网状结构的高分子 、 （1）凝胶在使用前必须在过量的溶剂中充分地 膨胀，否则影响层析的均一性，甚至使柱破裂， 自然溶解需24小时以上，加热至沸需2小时即可。 （2）用倾斜法除去混杂的小颗粒，重复2-3次。 2、凝胶的装填 、 装柱是凝胶层析中最重要的一步操作。 a.将柱垂直安装好 b.在柱内先装入1/5的水，用玻棒搅拌凝胶沿玻 棒倒下待凝胶开始沉降时，打开出口。凝胶床 必须装得均匀，尽量一次装完，以免出现不均 匀的凝胶带，因此，在装柱时需打开下口，并 调节适当的流速。 c.连接恒压洗脱瓶，平衡流速，开始流速不能 太大，应低于层析时所需的流速。 d.经平衡后的凝胶床顶部留下1ml左右的液体。 关闭出口管上的螺旋夹。
小分子物质除了可在凝胶颗粒间隙中扩散外还可进入凝胶颗粒的微孔之中因此在向下移动的过程中它们先从凝胶内扩散至颗粒间隙后再进入另一凝胶颗粒这样不断进入和扩散必然使小分子物质的下移速度落后于大分子物质从而使样品中分子大小不同的物质流出柱外而得到分离
葡聚糖凝胶层析实验报告
葡聚糖凝胶层析实验报告一、实验目的1、学习凝胶(Gel)层析法的基本原理；2、掌握葡聚糖凝胶（Sephadex）柱层析的操作技术。
二、实验原理凝胶层析又称排阻层析，凝胶过滤，渗透层析或分子筛层析等。
对于某种型号的凝胶，一些大分子不能进入凝胶颗粒内部而完全被排阻在外，只能沿着颗粒间的缝隙流出柱外（所用洗脱液的体积为外水体积）；而一些小分子不被排阻，可自由扩散，渗透进入凝胶内部的筛孔，尔后又被流出的洗脱液带走（所用洗脱液的体积为内水体积）。
分子越小，进入凝胶内部越深，所走的路程越多，故小分子最后流出柱外，而大分子先从柱中流出。
一些中等大小的分子介于大分子与小分子之间，只能进入一部分凝胶较大的孔隙，亦即部分排阻，因此这些分子从柱中流出的顺序也介于大、小分子之间。
这样样品经过凝胶层析后，分子便按照从大到小的顺序依次流出，达到分离的目的。
三、仪器、材料和试剂1、仪器：内直径为1cm，外直径为1.5cm的层析柱，恒流泵、收集器、酶标仪、试管、烧杯、移液枪。
2、材料与试剂：交联葡聚糖、双蒸水、蛋白溶液样品。
四、实验步骤1、装柱将交联葡聚糖溶液用玻璃棒引流导入层析柱中，要注意，不能让柱子中有气泡，可以边装边用玻璃棒搅拌。
2、上样装好柱后，用移液枪将柱子中上面的水吸出，再用移液枪将1ml 的蛋白溶液加入层析柱中。
3、洗脱和收集打开恒流泵和收集器装置，待样品刚好渗入到凝胶中时，再向层析柱中加入3-4ml的蒸馏水，此时盖上层析柱的上盖，将上盖的细管插入到盛有双蒸水的烧杯中，调节恒流泵的速度和收集器时间，开始洗脱收集。
4、样品的检测收集一段时间后，将样品取出，依次编号，依次加入200μl到酶标版上，选用一个孔加入双蒸水作为对照，用酶标仪在280nm下测检测。
五、实验结果及分析1、实验结果：序号 2 4 6 8 10 12 14吸光0．051 0.045 0.051 0.071 0.195 0.127 0.067 度A序号16 8吸光0.055 0.039 0.066 0.027 0.053 0.049 0.011度A2、蛋白质样品洗脱曲线：收集样品时设置的时间为3min每管，收集得到每管的体积为1.4ml，则计算：流速=每管体积/每管时间=1.4/3=0.47ml/min。
分子凝胶层析实验报告
一、实验目的1. 理解分子凝胶层析的基本原理及其在生物大分子分离中的应用。
2. 掌握分子凝胶层析的操作步骤和注意事项。
3. 通过实验，验证分子凝胶层析对蛋白质分子量的分离效果。
二、实验原理分子凝胶层析，又称凝胶过滤层析或分子筛层析，是一种基于分子量差异进行分离的技术。
其基本原理是利用具有不同孔径的凝胶颗粒作为固定相，根据分子大小和凝胶孔径的选择性，使不同分子量的物质在层析过程中受到不同的阻滞作用，从而实现分离。
在本实验中，我们使用的凝胶为葡聚糖凝胶（Sephadex），它是由直链的葡聚糖分子和交联剂3-氯1，2-环氧丙烷交联而成的具有多孔网状结构的高分子化合物。
通过调节葡聚糖和交联剂的比例，可以控制凝胶颗粒的孔径大小，从而实现对不同分子量物质的分离。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：- 蛋白质混合样品- 标准蛋白质混合样品- 葡聚糖凝胶（Sephadex G-75）- 洗脱液（磷酸盐缓冲液，pH 7.4）- 标准分子量蛋白质（如牛血清白蛋白、卵清蛋白等）2. 实验仪器：- 凝胶层析柱- 洗脱液泵- 检测器（如紫外检测器）- 紫外分光光度计- 电子天平- 移液器四、实验步骤1. 准备凝胶层析柱，将葡聚糖凝胶（Sephadex G-75）用洗脱液充分浸泡，使其充分膨胀。
2. 将浸泡好的凝胶颗粒装入层析柱中，注意不要产生气泡。
3. 用洗脱液平衡层析柱，直至流出液清澈。
4. 将蛋白质混合样品和标准蛋白质混合样品分别加入层析柱中，用洗脱液进行洗脱。
5. 收集洗脱液，并使用紫外分光光度计检测蛋白质浓度。
6. 分析洗脱曲线，确定蛋白质的分子量。
五、实验结果与分析1. 通过实验，我们得到了蛋白质混合样品和标准蛋白质混合样品的洗脱曲线。
2. 从洗脱曲线上可以看出，不同分子量的蛋白质在层析过程中受到的阻滞作用不同，从而实现了分离。
3. 通过比较标准蛋白质的分子量和洗脱曲线上的保留时间，我们可以确定蛋白质混合样品中各蛋白质的分子量。
实验三葡聚糖凝胶柱层析纯化蛋白质
层析柱的重要参数 ：
Vt(total volume) Vo(outer volume) Vi(inner volume) Ve(elution volume) Vg(gel volume) Vt=Vo+Vi+Vg , Ve=Vo+Kd×Vi。
组分的洗脱体积（Ve）：①当样品的 体积很少时（与洗脱体积比较可以忽 略不计） ，在洗脱图中，从加样到峰 顶位置所用洗脱液体积为Ve。 ②当 样品体积与洗脱体积比较不能忽略时， 洗脱体积计算可以从样品体积的一半 到峰顶位置。③当样品体积很大时， 洗脱体积计算可以从应用样品开始到 洗脱峰升高的弯曲点（或半高处）。
常用0.02％叠氮钠或20%乙醇溶液作防腐剂。 1 厘 米 光 程 时 ， 254nm 处 透 光 率 为 60 ％ ，
280nm处透光率为100％。
3、试剂、器材：
3.1、层析介质 Sephadex G-50； 3.2、样品（包含三个组分）： ①蓝色葡聚糖2000， ②溶菌酶，③ Trp
上样量：0.4ml/柱。 3.3、洗脱液：0.15M氯化钠，即生理盐 水。
、洗脱液流速的影响：
洗脱液的流速与样品分离的分辨率相关。 流速过快，会使色谱峰变形， 流速过慢，样品扩散倾向加剧。 一般流速控制在30－200ml/h。
今天洗脱流速控制在1ml/min。
、洗脱液的离子强度和pH值的影响：
纯化蛋白时,通常选用离子强度＞0.02的盐 溶液作洗脱剂，以增加样品的溶解度和 消除凝胶的吸附作用；
Kd是分配系数：用于衡量两个物质的分离分辩率， 是凝胶层析的一个特征常数，只与被分离物质 分子大小和凝胶孔径大小有关，与层析柱的长 短粗细无关。
Kd值的计算：Kd=(Ve-Vo)/Vi
层析柱装填及柱效测定及凝胶过滤层析基础知识
层析柱装填及柱效测定及凝胶过滤层析基础知识一、实验目的和内容目的：1. 掌握凝胶过滤层析的原理，掌握凝胶柱柱效测定方法；2. 熟悉凝胶层析的一般过程；3. 了解凝胶介质的选择原则和应用领域。
内容：1. Sephadex G-50凝胶柱的装填；2. 凝胶柱柱效测定；3．凝胶再生的方法。
二、实验仪器和试剂1. 实验仪器层析柱（1×40 cm），砝码天平，玻璃棒，分部收集器，核酸蛋白质检测仪，记录仪，滴头吸管2. 实验材料和试剂Sephadex G-50，0.02mol/L pH8.0的PBS缓冲液，5％丙酮（PBS缓冲液作为溶剂）三、实验步骤清洗层析柱测定层析柱的内径、高度，计算所需凝胶的体积根据Sephadex G-50的膨胀体积，计算所需干凝胶的质量称取相应质量的干凝胶，加入其总吸液量10倍的0.02 mol/L PBS在100℃水浴中加热溶胀1小时以上，溶胀之后将极细的小颗粒倾泻出去用真空干燥器抽尽凝胶中空气，并将凝胶上面过多的溶液倾出关闭层析柱出水口，向柱管内加入约1/4柱容积的洗脱液（重复使用的填料，从此步开始）边搅拌，边将薄浆状的凝胶液连续倾入柱中，使其自然沉降等凝胶沉降约2-3cm后，打开柱的出口，调节合适的流速，使凝胶继续沉积待沉积的胶面上升到离柱的顶端约5cm处时停止装柱，关闭出水口通过2-3倍柱床体积的洗脱液使柱床稳定(流速0.5～1 mL/min)始终保护凝胶上端有一段液体准备好恒流泵、分部收集器、核酸蛋白检测仪及记录仪打开柱上端的螺丝帽塞子，吸出层析柱中多余液体直至与胶面相切沿管壁将5%丙酮溶液0.6 mL小心加到凝胶床面上，应避免将床面凝胶冲起（参考完成时间11：30）打开下口夹子，使样品溶液流入柱内，同时收集流出液，当样品溶液流至与胶面相切时，夹紧下口夹子按加样操作，用1 mL洗脱液冲洗管壁2次加入3－4 mL洗脱液于凝胶上，旋紧上口螺丝帽将层析柱进水口连通恒流泵，柱出水口与核酸蛋白质检测仪比色池进液口相连，比色池出液口再与自动部分收集器相连，用两根导线将检测仪与记录仪连接起来，设置好基线的位置洗脱时，打开上、下进出口夹子，用0.02mol/LpH8.0的PBS，以0.5～1 mL/min流速洗脱，记录t r(记录仪纸速设为12cm/h，电压200mv；核酸蛋白监测仪检测波长254nm，灵敏度为0.1A)，计算单位高度的柱效（参考完成时间16：00）柱效计算公式：N = 5.54•［θr/( W 1/2)］2其中，θr为平均洗脱时间，W 1/2为半峰宽。
葡聚糖凝胶柱(sephadex column)使用及注意事项(1)
葡聚糖凝胶柱(sephadex column)使用及注意事项(1)1 Sephadex G型葡聚糖凝胶只适合在水中使用，Sephadex G-25羟丙化后就是Sephadex LH-20。
其既有分子筛作用，在由极性与非极性溶剂组成的溶剂中还有反相层析效果。
虽然价位很高，但由于性能颇佳，可再生利用，所以倍受亲睐。
此外上柱样品损失很少，对处理小样品较好，这也是我们实验室常用的原因之一。
2 Sephadex LH20 的原理。
Sephadex LH20的分离原理主要有两方面：以凝胶过滤作用为主，兼具反相分配的作用（在反相溶剂中）。
因为凝胶过滤作用，所以大分子的化合物保留弱，先被洗脱下来，小分子的化合物保留强，最后出柱。
如果使用反相溶剂洗脱， Sephadex LH20对化合物还起反相分配的作用，所以极性大的化合物保留弱，先被洗脱下来，极性小的化合物保留强，后出柱。
如果使用正相溶剂洗脱，这主要靠凝胶过滤作用来分离。
3 Sephadex LH20 洗脱溶剂。
看完第2点后，就应该清楚Sephadex LH20 洗脱溶剂因分为两类：反相和正相两种。
用得最多的是反相溶剂洗脱，以甲醇－－水系统最为常见，先用水，逐渐增加甲醇比例，最后用100％甲醇冲柱。
正相系统以氯仿－－甲醇最为常见，先用50％氯仿－－甲醇，逐渐增加甲醇比例，最后用100％甲醇冲柱。
4 Sephadex LH20 样品的处理和洗脱溶剂的选择。
如果样品极性大，这选用反相溶剂洗脱（甲醇－－水），样品用最少体积的甲醇－－水（尽可能甲醇少一些）溶解，过滤后，湿法上样（一定要滤喔！要是把 Sephadex LH20 堵啦，就得将Sephadex LH20的柱头部分弃去，很心痛呀）。
如果样品极性小，这选用正相溶剂洗脱（氯仿－－甲醇），样品用最少体积的氯仿－－甲醇溶解，过滤后，湿法上样。
5 Sephadex LH-20的步骤。
(1) 选择条件：梯度洗脱在Sephadex使用中并不象在正相柱层析中那么重要。
血红蛋白的提取和分离
[基础全练]1．分离不同种类的蛋白质依据的原理不包括()A．分子的形状和大小B．所带电荷的性质和多少、吸附性质C．对其他分子的亲和力D．蛋白质分子的组成元素解析：根据分离蛋白质的方法可以知道，分离不同种类的蛋白质依据的原理包括分子的形状和大小、所带电荷的性质和多少、吸附性质、对其他分子的亲和力和蛋白质分子的溶解度等。
蛋白质分子的组成元素不是分离不同蛋白质的依据。
答案：D2．如图能正确表示相对分子质量不同的蛋白质在凝胶中的行进过程的是()解析：相对分子质量小的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程长，移动的速度慢；相对分子质量大的蛋白质不容易进入凝胶内部的通道，路程短，移动的速度快，故B正确。
答案：B3．凝胶色谱法分离蛋白质时，凝胶的种类较多，但其作用的共同点是() A．改变蛋白质分子通过凝胶时的路径B．吸附一部分蛋白质，从而影响蛋白质分子的移动速度C．将酶或细胞固定在凝胶中D．与蛋白质分子进行化学反应，从而影响其移动速度解析：凝胶的种类较多，但每种凝胶内部都有孔隙。
当相对分子质量不同的蛋白质通过凝胶时，相对分子质量较小的蛋白质分子可以进入凝胶内部，通过的路程较长，洗脱时从凝胶柱中出来得较晚；相对分子质量较大的蛋白质分子则可以较早地洗脱出来，从而达到分离蛋白质的目的。
答案：A4．下列有关凝胶色谱操作的叙述，不正确的是()A．干的凝胶要用蒸馏水充分溶胀后，才能装填B．在装填凝胶色谱柱时，不得有气泡产生C．在装填凝胶色谱柱时，下端的尼龙管先打开后关闭D．在样品洗脱过程中，不能让洗脱液流干解析：在装填凝胶色谱柱时，下端的尼龙管应始终打开，C错误。
答案：C5．下列关于DNA的粗提取实验和血红蛋白的提取实验，叙述正确的是() A．前者选择鸡血细胞作为实验材料较好，后者选择哺乳动物成熟的红细胞作为实验材料较好B．样品预处理时，前者静置1天处理除去上清液；后者需要加入清水，反复低速短时间离心洗涤，至上清液无黄色C．在DNA粗提取实验中，往2 mol/L氯化钠溶液中加入蒸馏水析出DNA时，应该缓慢加入，直到出现黏稠物即止D．洗涤红细胞的目的是去除血浆中的葡萄糖、无机盐等解析：鸡血细胞有细胞核，适于提取DNA；哺乳动物成熟红细胞无细胞核和众多细胞器，适用于提取血红蛋白。
[新版]血红蛋白凝胶过滤层析
![[新版]血红蛋白凝胶过滤层析](https://img.taocdn.com/s3/m/b00656b50129bd64783e0912a216147917117eba.png)
血红蛋白凝胶过滤层析摘要：本实验利用凝胶过滤的特点，先向层析柱中加入FeSO4溶液，形成一个还原带，然后加入血红蛋白样品（血红蛋白与高铁氰化钾的混合液）。
由于血红蛋白分子量大，在凝胶床中流速快，当其流经还原带时，褐色的高铁血红蛋白立即变为紫红色的亚铁血红蛋白。
亚铁血红蛋白继续下移，与缓冲液溶解的O2 结合，形成鲜红色的氧合血红蛋白。
铁氰化钾是小分子量化合物，呈黄色带远远地落在后边。
这样，就可以形象直观地观察到凝胶过滤的分离效果。
关键词:凝胶柱，抗凝血，磷酸缓冲溶液凝胶过滤是一种利用凝胶按照分子大小分离物质的层析方法，又称分子筛层析或排阻层析。
目前常用于凝胶过滤的的凝胶类介质主要有4大类，即葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶和琼脂糖-聚丙烯酰胺混合凝胶等层析介质。
它们都是不溶于水的高聚物，内部有很微细的多孔网状结构。
以Sephadex为例，它是由一定平均分子量的葡聚糖与环氧氯丙烷交联生成的高聚物，网眼的大小由葡聚糖的分子量与环氧氯丙烷的用量来控制。
葡聚糖的分子量越大、环氧氯丙烷用量越大，则交联度越大，凝胶的网眼越小。
Sephadex有很强的亲水性，在水或缓冲液中能吸水膨胀。
交联度越大，网眼越小，吸水量也越少。
本实验利用Sephadex将血红蛋白从鸡血中进行分离，通过层析柱可以形象的看见分离的过程。
1、实验材料及试验方法1.1实验仪器：烧杯、移液管、胶头滴管、容量瓶、玻璃棒、比色皿、PH试纸、电子天平、层析柱、洗耳球、铁架台、钥匙、称量纸1.2实验试剂（1）磷酸缓冲液（PH 7.0）：称取Na2HPO4·2H2O 2.172g，NaH2PO4·2H2O 1.076g，溶于蒸馏水中，定容至1000mL。
（2）Na2HPO4－EDTA－Na2 溶液：称取 2.69g EDTA－Na2，3.56gNa2HPO4·2H2O，加蒸馏水溶解并定容至100mL。
（3）40m mol/L FeSO4溶液:称取FeSO4·7H2O 1.11g 溶于100mL水中（用时现配）。
SephadexG-100凝胶层析
SephadexG-1凝胶层析Tina 发表于 2006-2-21 12:27:00材料与仪器Sephadex G-100，0.5 mol/L pH8.0 Tris-HCl，浓缩液层析柱二、方法与步骤1）Sephadex G-100 凝胶预处理a)100ml烧杯，称取5克sephadex G-100,加入50ml去离子水，浸泡溶胀24小时。
b)倾去sephadex G-100溶胀后凝胶上层的水，加入凝胶等体积的1.0 mol/LNaOH液处理，用搅棒轻轻搅动，并浸泡1小时处理后倾去。
用去离子水洗涤。
洗涤过程中，用倾去法除去细颗粒。
其方法是用搅棒将凝胶搅匀（注意不要过分用力搅拌，以防止颗粒破碎），放置数分钟，将未沉淀的细颗粒随上层水倒掉。
浮选3-5次，直至上层没有细颗粒为止，再浸泡水洗至PH中性。
c)将Sephadex G-100凝胶水溶液盛放于抽滤瓶中，用洗耳球塞住杯口，减压抽气30分钟，除去凝胶溶液内的气泡，将脱气后的凝胶溶液轻轻倒入烧杯中，其中盛有1/2去离子水。
2) 装柱a)层析柱(1.0 50cm)用水清洗干净，柱的上、下端联接塑料管接上小乳胶管，装上螺旋夹。
将层析柱垂直装好。
校直过程用下端绑有钥匙的绳子挂于铁架的不同位置，从多角度校正使柱垂直。
打开柱上端口，从柱底下出口管朝柱内注入水，使柱底全部充满水而不留气泡，关闭柱出口。
最终柱内留存有2 cm的水。
从出口处接上一根直径2 mm细塑管，塑管另一端固定在柱的上端部位。
b)搅动凝胶溶液（切勿搅动太快，以免空气再逸入），使形成均一的薄胶浆，并立即沿玻棒倒入层析管内，让加入的凝胶在柱内自然沉降，待柱底面上积起约1-2 cm的凝胶床后，打开柱出口水流。
随着柱内水的流出，上面不断加入凝胶液，使形成的凝胶床面上有凝胶连续下降（如果凝胶床面上不再有凝胶颗粒下降，应该用搅棒均匀地将凝胶床搅起数厘米高，然后再加凝胶，不然就会形成界面，影响层析效果）。
c)凝胶沉积到柱内凝胶是否均匀，有否“纹路”或气泡。
凝胶层析试验报告
摘要凝胶色谱技术是六十年代初发展起来的一种快速而又简单的分离分技术，由于设备简单、操作方便，不需要有机溶剂，对高分子物质有很高的分离效果。
凝胶色谱法又称分子排阻色谱法。
根据分离的对象是水溶性的化合物还是有机溶剂可溶物，又可分为凝胶过滤色谱（GFC）和凝胶渗透色谱（GPC）。
GFC一般用于分离水溶性的大分子，如多糖类化合物。
本实验用凝胶色谱法对食用油中的甘油三酯进行了分离提取。
关键词：凝胶色谱甘油三酯食用油第一章简介凝胶层析法凝胶层析又称分子筛过滤、排阻层析等。
它的突出优点是层析所用的凝胶属于惰性载体，不带电荷，吸附力弱，操作条件比较温和，可在相当广的温度范围下进行，不需要有机溶剂，并且对分离成分理化性质的保持有独到之处。
对于高分子物质有很好的分离效果。
一、凝胶的选择根据实验目的不同选择不同型号的凝胶。
如果实验目的是将样品中的大分子物质和小分子物质分开，由于它们在分配系数上有显著差异，这种分离又称组别分离，一般可选用Sephadex G-25和G-50，对于小肽和低分子量的物质（1000-5000）的脱盐可使用Sephadex G-10，G-15及Bio-Gel-p-2或4。
如果实验目的是将样品中一些分子量比较近似的物质进行分离，这种分离又叫分级分离。
一般选用排阻限度略大于样品中最高分子量物质的凝胶，层析过程中这些物质都能不同程度地深入到凝胶内部，由于Kd不同，最后得到分离。
二、柱的直径与长度根据经验，组别分离时，大多采用2-30cm长的层析柱，分级分离时，一般需要100cm左右长的层析柱，其直径在1-5cm范围内，小于1cm产生管壁效应，大于5cm则稀释现象严重。
长度L与直径D的比值L/D一般宜在7-10之间，但对移动慢的物质宜在30-40之间。
三、凝胶柱的制备凝胶型号选定后，将干胶颗粒悬浮于5-10倍量的蒸馏水或洗脱液中充分溶胀，溶胀之后将极细的小颗粒倾泻出去。
自然溶胀费时较长，加热可使溶胀加速，即在沸水浴中将湿凝胶浆逐渐升温至近沸，1-2小时即可达到凝胶的充分胀溶。
凝胶过滤层析的基本操作
凝胶过滤层析的基本操作①凝胶介质的选择根据待分离蛋白质的分子量选择具有相应分离范围的凝胶。
对于未知蛋白，应选用分离范围较宽的凝胶，如用Sephacryl S-300。
对于分子量在3~5kDa的蛋白质，脱盐时应选用Sephadex G 50或G 25；而对于小分子量多肽物质（1~5kDa），脱盐则应选用Sephadex G 10或Sephadex G 15。
②凝胶介质的处理和装柱商品凝胶一般是干粉，使用前应用水溶胀。
一般情况下，1份凝胶加十份水，自然溶胀至少24小时。
溶胀后，将上清中细小的凝胶碎块弃除，重新搅拌悬起，待凝胶沉淀后，再次弃去凝胶碎块，重复数次，直到液相澄清为止。
为加速溶胀，可将凝胶煮沸一小时，该法同时具有灭菌的作用。
凝胶过滤层析柱的长与直径的比例应为50~100:1。
装柱时柱体要垂直，先在柱内加入约1/3柱床体积的水或缓冲液，然后沿柱一侧将缓冲液中的凝胶（凝胶：缓冲液=3：1）搅拌均匀，缓慢并连续地一次性注入柱内。
装柱过程中，要避免柱内缓冲液流干，注意保持柱体凝胶均匀无气泡和裂缝。
装完后，可用2 ml蓝色葡聚糖溶液检查柱体的均匀性。
如柱体均匀，可见蓝色区带均匀平稳地通过凝胶，不留任何条纹。
要保持凝胶和缓冲液温度一致，以减少气泡的产生。
③上样凝胶过滤柱层析对于样品的体积有严格的要求。
样品体积不应超过柱床体积的1~5 %，如超过5 %，则会导致分离效率降低，低于1 %则分离效率也不会提高，所以蛋白质样品应尽可能浓缩至10~20 mg/ml。
样品本身对洗脱液的相对粘度不能超过2，样品粘度过高，会使层析区带不稳定，或流速不规律，区带变宽或扭曲。
上样前样品应经0.2 μm 孔径滤膜过滤或10，000 g离心5 min，去除残渣，加样时避免破坏柱体表面，保持其表面均匀平整。
④洗脱洗脱液应保持一定的离子强度以消除凝胶中含有的游离羧基和硫酸根等与蛋白质的结合作用。
Sephadex和Sepharose CL凝胶层析所用的洗脱液的离子强度至少应为0.02 mol/L；Sephacryl凝胶应为0.05 mol/L。
血红蛋白凝胶过滤层析
血红蛋白凝胶过滤层析摘要：本实验利用凝胶过滤的特点，先向层析柱中加入FeSO4溶液，形成一个还原带，然后加入血红蛋白样品（血红蛋白与高铁氰化钾的混合液）。
由于血红蛋白分子量大，在凝胶床中流速快，当其流经还原带时，褐色的高铁血红蛋白立即变为紫红色的亚铁血红蛋白。
亚铁血红蛋白继续下移，与缓冲液溶解的O2 结合，形成鲜红色的氧合血红蛋白。
铁氰化钾是小分子量化合物，呈黄色带远远地落在后边。
这样，就可以形象直观地观察到凝胶过滤的分离效果。
关键词:凝胶柱，抗凝血，磷酸缓冲溶液凝胶过滤是一种利用凝胶按照分子大小分离物质的层析方法，又称分子筛层析或排阻层析。
目前常用于凝胶过滤的的凝胶类介质主要有4大类，即葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶和琼脂糖-聚丙烯酰胺混合凝胶等层析介质。
它们都是不溶于水的高聚物，内部有很微细的多孔网状结构。
以Sephadex为例，它是由一定平均分子量的葡聚糖与环氧氯丙烷交联生成的高聚物，网眼的大小由葡聚糖的分子量与环氧氯丙烷的用量来控制。
葡聚糖的分子量越大、环氧氯丙烷用量越大，则交联度越大，凝胶的网眼越小。
Sephadex有很强的亲水性，在水或缓冲液中能吸水膨胀。
交联度越大，网眼越小，吸水量也越少。
本实验利用Sephadex将血红蛋白从鸡血中进行分离，通过层析柱可以形象的看见分离的过程。
1、实验材料及试验方法1.1实验仪器：烧杯、移液管、胶头滴管、容量瓶、玻璃棒、比色皿、PH试纸、电子天平、层析柱、洗耳球、铁架台、钥匙、称量纸1.2实验试剂（1）磷酸缓冲液（PH 7.0）：称取Na2HPO4·2H2O 2.172g，NaH2PO4·2H2O 1.076g，溶于蒸馏水中，定容至1000mL。
（2）Na2HPO4－EDTA－Na2 溶液：称取 2.69g EDTA－Na2，3.56gNa2HPO4·2H2O，加蒸馏水溶解并定容至100mL。
（3）40m mol/L FeSO4溶液:称取FeSO4·7H2O 1.11g 溶于100mL 水中（用时现配）。
凝胶过滤层析实验
凝胶过滤层析实验凝胶过滤作为实验室最常用的层析方法之一，无疑是众多层析方法中最娇贵的存在。
原理凝胶过滤层析是根据蛋白质分子大小不同而达到分离效果的，凝胶过滤填料中含有大量微孔，只允许缓冲液及小分子量蛋白质通过，而大分子蛋白质及一些蛋白复合物则被阻挡在外。
因此，高分子量的蛋白质在填料颗粒间隙中流动，比低分于量蛋白更早地被洗脱下来。
最大的蛋白质分子最早流出柱子，因为它们在到达柱底前经过的体积最小。
中等大小的蛋白质可以进入填料分子中较大的孔内，因此它们晚一些到达柱底，而小蛋白质可以逬入所有填料的孔内，有最大的通过体积，故最后到达柱底。
材料与仪器蛋白质溶液缓冲液、蓝色葡聚糖溶液、乙醇、乙腈、乙酸、胃蛋白酶低压层析系统操作步骤1.凝胶的填装1.1凝胶的溶胀如果凝胶是脱水的干粉（例如Sephadex）在使用前需要溶胀。
1.1.1一份凝胶加10份的缓冲液，原则上应将凝胶颗粒放入洗脱缓冲液中。
1.1.2在摇床上或手动搅拌混合，避免使用电力搅拌器。
因为机械搅拌力会导致凝胶颗粒破裂成碎片，这些细小的碎片将干扰层析。
如果出现细小的凝胶碎片可将凝胶浆悬浮，待凝胶颗粒沉降后，去除上清，重复几次，直到液相不再混浊为止。
1.1.3自然溶胀需要24 h至数天，为了加速溶胀，可用热法溶胀。
即在沸水浴中将凝胶浆逐渐升温至近沸，这样可加速溶胀平衡，通常1～2 h即可完成。
这种方法不但省时，还可以排除气泡和消毒。
1.1.4无论凝胶是否需要溶胀，为了防止气泡影响层析，需用水泵或真空泵对凝胶浆抽气1 h。
1.2装柱1.2.1将层析柱垂直安装在无直接光照、无空气对流处，以防止由于温度变化使层析柱内产生气泡。
通常放在专用的层析冷柜中；1.2.2装柱前取3/4体积的凝胶和1/4体积的缓冲液制成凝胶浆；1.2.3对于经常使用的层析柱，建议使用一个商品化的流动相接头（flow adaptors）。
它对柱床表面有保护作用，还可以避免样品中的大颗粒混入凝胶中，从而延长层析柱的寿命；1.2.4将缓冲液加入层析柱，当有缓冲液流出时关闭柱的出口。
葡聚糖凝胶柱的使用方法
葡聚糖凝胶柱的使用方法：1 预处理称取Sephadex G-2550－100目约5g;加入蒸馏水100ml;置室温下3h进行溶胀..2 装柱凝胶层析柱的直径与柱长之比一般为1:15..柱的底部用装有细玻璃管的橡皮塞塞紧;用洗净的玻璃丝约200目尼龙布垫底或购买类似规格的商品柱..然后将柱垂直安装好;先加入1/3柱体积蒸馏水;接着将溶胀好的凝胶边搅匀边连续装入;使它们在柱内自然沉降..同时大开下口慢速流出蒸馏水..装柱后的凝胶必须均匀;不能有气泡或明显条纹..否则;必须到出重装;装好后;用蒸馏水平衡2－3h即可加样品分离..3 加样加样前;首先把柱内凝胶上面多余的蒸馏水放出;直到柱内液面与凝胶表面相齐或留一极薄液层为止..然后;由柱的上端加水解液2ml;注意不要让溶液把凝胶冲松浮起;加完样品后;打开下口缓慢放出液体至液面与凝胶面相齐;再用少量蒸馏水冲洗原来盛样品的容器2－3次;待全部进入层析柱后;即可进行洗脱..4 洗脱与收集洗脱时;用蒸馏水作洗脱剂;并且要连续不断地进行;使凝胶柱上端保持一定的液层;防止凝胶柱表面的液体流干..本实验洗脱液流出的速度应控制在0.8－1.0ml/min..洗脱液的收集采用分管连续顺序收集;每管收集3ml;共收集10管..据经验;4或5号管核苷酸浓度最大;可作为层析鉴定的样品液..但因层析柱长度的差异;管号会有变化;必要时可用紫外检测A260nm;找出浓度最大的管号..5 凝胶的再生和回收凝胶柱使用一次后;必须反冲疏松一次;平衡后再使用..若使用数次;就需要再生处理..用0.1mol/L NaOH-0.5mol/L NaCl溶液浸泡;然后用蒸馏水洗至中性备用..若实验完毕;将再生后的凝胶在布氏漏斗上用蒸馏水洗涤抽干;再用95%乙醇洗两次;在60℃烘箱中烘干;回收保存..实验五. 葡聚糖凝胶层析实验目的1.掌握葡聚糖凝胶的特性及凝胶层析的原理..2．学习葡聚糖凝胶层析的基本操作技术..实验原理凝胶层析又称分子排阻层析或凝胶过滤;是以被分离物质的分子量差异为基础的一种层析分离技术;这一技术为纯化蛋白质等生物大分子提供了一种非常温和的分离方法..层析的固定相载体是凝胶颗粒;目前应用较广的是：具有各种孔径范围的葡聚糖凝胶Sephadex和琼脂糖凝胶Sepharose..葡聚糖凝胶是由直链的葡聚糖分子和交联剂3—氯1;2—环氧丙烷交联而成的具有多孔网状结构的高分子化合物..凝胶颗粒中网孔的大小可通过调节葡聚糖和交联剂的比例来控制;交联度越大;网孔结构越紧密；交联度越小;网孔结构就越疏松;网孔的大小决定了被分离物质能够自由出入凝胶内部的分子量范围..可分离的分子量范围从几百到几十万不等..葡聚糖凝胶层析;是使待分离物质通过葡聚糖凝胶层析柱;各个组分由于分子量不相同;在凝胶柱上受到的阻滞作用不同;而在层析柱中以不同的速度移动..分子量大于允许进入凝胶网孔范围的物质完全被凝胶排阻;不能进入凝胶颗粒内部;阻滞作用小;随着溶剂在凝胶颗粒之间流动;因此流程短;而先流出层析柱；分子量小的物质可完全进入凝胶颗粒的网孔内;阻滞作用大;流程延长;而最后从层析柱中流出..若被分离物的分子量介于完全排阻和完全进入网孔物质的分子量之间;则在两者之间从柱中流出;由此就可以达到分离目的..本实验以葡聚糖凝胶G—25作为固定相载体;来分离蓝色葡聚糖—2000和溴酚蓝..蓝色葡聚糖—2000分子量接近2×106; 而溴酚蓝分子量为670;二者分子量相差较大;前者完全排阻;而后者则可完全进入凝胶颗粒网孔内;二者通过层析柱的时间不同而分开..实验材料1.实验器材层析柱1×20cm附有一小段乳胶管及螺旋夹；洗脱液瓶带下口的三角瓶;250m1；试管及试管架；量筒10m1；721型分光光度计2.实验试剂1 Tris—醋酸缓冲液pH7.0:取0.0lmol/L Tris溶液含0.1mol/L KCl900ml;用浓醋酸调pH至7.0;加蒸馏水至1000m1..2 溴酚蓝溶液：称取溴酚蓝10毫克;溶于5毫升乙醇中;充分搅拌使其溶解;然后逐滴加入Tris—醋酸缓冲液pH7.0至溶液呈深蓝色..3 蓝色葡聚糖—2000溶液：称取蓝色葡聚糖—2000 10毫克;溶于2毫升Tris—醋酸缓冲液pH7.0中即成..4 样品溶液：取溴酚蓝溶液0.1毫升;蓝色葡聚糖—2000溶液0.5毫升混匀后为上柱样品溶液..5葡聚糖凝胶G-25 Sephadex-G-25实验操作1.实验凝胶的制备：商品凝胶是干燥的颗粒;使用时需经溶胀处理;称取4克葡聚糖凝胶G—25;加50毫升蒸馏水;搅拌均匀;在室温溶胀6小时;或沸水浴溶胀 2小时;一般采用后一种方法..再用倾泻法除去凝胶上层水及细小颗粒;用蒸馏水反复洗涤几次;再以缓冲溶液pH7.0的Tris—醋酸溶液洗涤2—3次;使pH和离子强度达到平衡;最后抽去溶液及凝胶颗粒内部气泡;凝胶可保存在缓冲液内..2.装柱：将层析柱洗净;垂直固定在铁支架上;选择有薄膜端作为层析柱下口;将下口接上乳胶管并用螺旋夹夹紧..层析柱中加入洗脱液;打开下口螺旋夹;让溶液流出;排除残留气泡;最后保留约2厘米高度的洗脱液;拧紧螺旋夹..将凝胶轻轻搅动均匀;用玻璃棒沿层析柱内壁缓缓注入柱中;待凝胶沉积到柱床下已超过l厘米时;打开下口螺旋夹;继续装柱至柱床高度达到8厘米;关闭出口..装柱过程中严禁产生气泡;尽可能一次装完;避免出现分层..再用洗脱液平衡l至2个柱床体积;凝胶面上始终保持有一定的洗脱液..平衡后;拧紧下端螺旋夹..3.加样品：打开螺旋夹使柱面上的洗脱液流出;直至床面与液面刚好平齐为止;关闭下端出口..取溴酚蓝及蓝色葡聚糖—2000混合液0.3毫升;小心地加于凝胶表面上;切勿搅动层析柱床表面..打开下端出口;使样品溶液进入凝胶内;并开始收集流出液..当样品溶液恰好流至与凝胶表面平齐时;关闭下端出口..用少量洗脱液清洗层析柱加样区;共洗涤三次;每次清洗液应完全进入凝胶柱内后;再进行下一次洗涤..最后在凝胶表面上加入洗脱液;保持高度为3—4cm..4.洗脱与收集：连接好凝胶柱层析系统;调节洗脱液流速为每分钟1毫升;进行洗脱..仔细观察样品在层析柱内的分离现象;收集洗脱液;每收集3毫升即换一支收集管试管预先编号;收集约20管左右;样品即可完全被洗脱下来..将各收集管中的洗脱液分别用721型分光光度计在波长540nm处测定其光密度..5.凝胶回收处理方法：将样品完全洗脱下来后;继续用三倍柱床体积的洗脱液冲洗凝胶后;将柱下口放在小烧杯中;慢慢打开;再将上口慢慢松开;使凝胶全部回收至小烧杯中;备用..2 Sephadex LH20 的原理..Sephadex LH20的分离原理主要有两方面：以凝胶过滤作用为主;兼具反相分配的作用在反相溶剂中..因为凝胶过滤作用;所以大分子的化合物保留弱;先被洗脱下来;小分子的化合物保留强;最后出柱..如果使用反相溶剂洗脱; Sephadex LH20对化合物还起反相分配的作用;所以极性大的化合物保留弱;先被洗脱下来;极性小的化合物保留强;后出柱..如果使用正相溶剂洗脱;这主要靠凝胶过滤作用来分离..3 Sephadex LH20 洗脱溶剂..看完第2点后;就应该清楚Sephadex LH20 洗脱溶剂因分为两类：反相和正相两种..用得最多的是反相溶剂洗脱;以甲醇－－水系统最为常见;先用水;逐渐增加甲醇比例;最后用100％甲醇冲柱..正相系统以氯仿－－甲醇最为常见;先用50％氯仿－－甲醇;逐渐增加甲醇比例;最后用100％甲醇冲柱..4 Sephadex LH20 样品的处理和洗脱溶剂的选择..如果样品极性大;这选用反相溶剂洗脱甲醇－－水;样品用最少体积的甲醇－－水尽可能甲醇少一些溶解;过滤后;湿法上样一定要滤喔要是把Sephadex LH20 堵啦;就得将Sephadex LH20 的柱头部分弃去;很心痛呀..如果样品极性小;这选用正相溶剂洗脱氯仿－－甲醇;样品用最少体积的氯仿－－甲醇溶解;过滤后;湿法上样..5 Sephadex LH-20的步骤..1 选择条件：梯度洗脱在Sephadex使用中并不象在正相柱层析中那么重要..首先你的样品须要能溶解在尽量少量的洗脱剂中..极性在的用甲醇水系统;极性小者一般用不含水的系统..我们实验室常用正己烷二氯甲烷甲醇系统;用了很多年;效果较好..2 饱和层析柱：用洗脱剂将凝胶摇匀;直立柱身;让其自然沉降;此时要防止气泡留在其中..至少半小时打开开关;流出几个柱体种的洗脱剂;目的是使其膨胀在正确比例的洗脱剂中..3 样品处理：用尽量少的洗脱剂溶解样品;常压过滤..4 湿法上柱..这也是要有技巧的步骤..5 洗脱：控制流速;一般1drop/s以下;可参见厂家的一些参数;必要时更改极性很多时一个极性就可以将样品洗脱完毕..再生以备下次使用..6 分离的技巧;最后说说我的使用心得1 流速不可太快;切切不可新急;所谓欲速则不达..2柱子尽可能长; Sephadex LH20 柱长的增加将极大地改善分离;所不要吝惜填料;宁可将填料全装在一根大柱子中;不要将填料装成几根小柱..所谓集中优势兵力;打击敌人..3 馏分一定要接的细;可1／10;或1／20 个保留体积接成一馏分..4 洗脱体积一般为2-3个保留体积;对特殊保留强的化合物;可洗脱5个保留体积..5鞣质成分死吸附严重;如不在乎填料者;可用Sephadex LH20 分鞣质6Sephadex LH20 对黄酮类成分的分离效果极佳;方法很成型;有大量文献参考..7填料反复使用;每次用完;一般可用甲醇将柱子洗干净;然后用下一次分离的起步溶剂将甲醇替换出来;待用..Sephadex LH-20是由葡聚糖G-25羟丙基化加工而成;属于分子筛凝胶;尤其适用于天然产物在有机溶剂中的纯化..例如：类固醇、萜类、脂类以及小分子多肽等;Pharmadex LH-20同时适用于分子类别非常相似的物质的分离和工业规模的制备;既可用于初步纯化步骤;也可用于最终精制步骤;如非对映同分异构体的分离..1.装柱装填的重要原则之一就是需要形成一个稳定均一的柱床..胶颗粒越均一粒径分布越窄;越容易获得稳定均一的柱床..但是对于Sephadex LH-20而言;25～100μm的粒径范围相对于许多用于制备色谱的填料而言;不能说分布均一;也就是说其粒径分布较宽..然而当胶溶胀后就相对容易得到均一的柱床..这对于长柱最高至250cm而言也是同样的..在装柱前;层析柱和储槽都必须进行彻底的清洗..Sephadex LH-20在使用之前必须进行溶胀..在溶胀的过程中;要尽量避免过分搅拌;否则会破坏球形胶粒;且要避免使用磁力搅拌器..在室温下;将凝胶溶胀于层析溶剂中至少三小时;溶胀后胶体积的大小决定于所使用的溶剂系统;请参考后页之干胶溶胀表计算特定柱体积所需要干胶的量..使溶胀胶体积沉淀之后占总体积的75%;上层溶剂占25%;这时;悬浮液从一个容器倒入另一容器时胶粒可移动..将溶胀后的凝胶根据装柱要求均匀倒入柱内;在保证胶粒不变形的前提下;应在尽可能高的压力下装柱;反压不要超过1.5ba..2.平衡上样前;用洗脱液平衡层析柱至少两个柱体积直到基线变得平稳为止;如改变溶剂应该注意凝胶在新溶剂中的溶胀性质;并根据性质确定柱高调节器的位置;如使用相同的溶剂;在以后的层析中柱平衡可以省略..3.洗脱液为确保延长层析柱的使用寿命;所有的缓冲液都应该离心或经过0.45um的膜过滤以除去杂质..4.样品样品体积应该占柱总体积的1-2%;同样在使用之前样品应该离心或经过0.45um的膜过滤..5.洗脱洗脱流速应根据情况而定;最大线性流速约12cm/min反压1.5ba;建议流速为1-10cm/h..总体来说;较低的流速;具有较高的分辩率..。
SephadexG-100凝胶层析
SephadexG-1凝胶层析Tina 发表于 2006-2-21 12:27:00材料与仪器Sephadex G-100，0.5 mol/L pH8.0 Tris-HCl，浓缩液层析柱二、方法与步骤1）Sephadex G-100 凝胶预处理a)100ml烧杯，称取5克sephadex G-100,加入50ml去离子水，浸泡溶胀24小时。
b)倾去sephadex G-100溶胀后凝胶上层的水，加入凝胶等体积的1.0 mol/LNaOH液处理，用搅棒轻轻搅动，并浸泡1小时处理后倾去。
用去离子水洗涤。
洗涤过程中，用倾去法除去细颗粒。
其方法是用搅棒将凝胶搅匀（注意不要过分用力搅拌，以防止颗粒破碎），放置数分钟，将未沉淀的细颗粒随上层水倒掉。
浮选3-5次，直至上层没有细颗粒为止，再浸泡水洗至PH中性。
c)将Sephadex G-100凝胶水溶液盛放于抽滤瓶中，用洗耳球塞住杯口，减压抽气30分钟，除去凝胶溶液内的气泡，将脱气后的凝胶溶液轻轻倒入烧杯中，其中盛有1/2去离子水。
2) 装柱a)层析柱(1.0 50cm)用水清洗干净，柱的上、下端联接塑料管接上小乳胶管，装上螺旋夹。
将层析柱垂直装好。
校直过程用下端绑有钥匙的绳子挂于铁架的不同位置，从多角度校正使柱垂直。
打开柱上端口，从柱底下出口管朝柱内注入水，使柱底全部充满水而不留气泡，关闭柱出口。
最终柱内留存有2 cm的水。
从出口处接上一根直径2 mm细塑管，塑管另一端固定在柱的上端部位。
b)搅动凝胶溶液（切勿搅动太快，以免空气再逸入），使形成均一的薄胶浆，并立即沿玻棒倒入层析管内，让加入的凝胶在柱内自然沉降，待柱底面上积起约1-2 cm的凝胶床后，打开柱出口水流。
随着柱内水的流出，上面不断加入凝胶液，使形成的凝胶床面上有凝胶连续下降（如果凝胶床面上不再有凝胶颗粒下降，应该用搅棒均匀地将凝胶床搅起数厘米高，然后再加凝胶，不然就会形成界面，影响层析效果）。
c)凝胶沉积到柱内凝胶是否均匀，有否“纹路”或气泡。
凝胶过滤层析法调节脂质体内外水相pH的探讨
凝胶过滤层析法调节脂质体内外水相pH的探讨刘敏;陆伟跃;潘俊;谢操【期刊名称】《实验室研究与探索》【年(卷),期】2017(036)006【摘要】通过对脂质体内外水相pH梯度的制备方法的探讨,采用凝胶过滤层析技术将脂质体外水相的pH4.0柠檬酸缓冲液替换成pH7.2磷酸盐缓冲液,在脂质体内外水相形成pH梯度.在药脂比为1∶5、1∶10、1∶15和1∶20(质量比)时,阿霉素在pH梯度的驱动下从脂质体外水相穿越脂质双分子膜进入内水相,包封率分别达到96.7％、98.7％、96.8％和95.1％,其中药脂比1∶10时包封率达到最高.药脂比1∶10制备的阿霉素脂质体在37℃,12h内阿霉素泄漏均低于1.0％;48 h内药物泄露率低于5.0％.通过该实验,使学生们能够观测到如何采用凝胶过滤层析技术调节pH梯度,以及pH梯度在阿霉素脂质体主动载药过程中的重要性,为脂质体递释系统的课堂理论教学奠定了良好的实验基础.【总页数】3页(P18-20)【作者】刘敏;陆伟跃;潘俊;谢操【作者单位】复旦大学药学院,上海201203;复旦大学药学院,上海201203;复旦大学药学院,上海201203;复旦大学药学院,上海201203【正文语种】中文【中图分类】R94【相关文献】1.凝胶过滤层析实验中Sephadex的溶胀与回收保存 [J], 王璞;林红;朱滨2.配制盐酸普鲁卡因注射液时调节pH值法的探讨 [J], 胡克勤;聂浩鸿3.深埋隧道外水压力计算中几个问题的探讨——对"读《深埋隧道外水压力计算的解析-数值法》一文随笔"的答复 [J], 王建秀4.UV法或HPLC法结合金属离子沉淀法测定米索硝唑pH敏感脂质体中主成分含量的比较 [J], 魏巍;何美;王琛;李睿;李必波;罗治彬5.逆相蒸发法结合响应面优化抗耐药结核菌药物利奈唑胺脂质体处方工艺研究 [J], 佟雷; 刘金丽; 刘世娟; 于春艳因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
凝胶过滤层析实验中Sephadex的溶胀与回收保存
凝胶过滤层析实验中Sephadex的溶胀与回收保存
王璞;林红;朱滨
【期刊名称】《实验技术与管理》
【年(卷),期】2006(023)002
【摘要】Sephadex(交联葡聚糖凝胶)是多糖类物质,尽管其结构、性能较稳定,但在压力、强酸、氧化剂存在情况下,也会发生部分糖苷键水解,或凝胶交联结构受损.在使用过程中,或使用后处理、保存过程中,可能会因上述原因或情况发生而影响凝胶层析的分离效果.该文根据作者自己的工作经验,着重介绍了回收后的交联葡聚糖的干燥保存法,以提高交联葡聚糖的稳定性和重复使用率.
【总页数】2页(P24-25)
【作者】王璞;林红;朱滨
【作者单位】北京大学,基础医学院生物化学与分子生物学系,北京,100083;北京大学,基础医学院生物化学与分子生物学系,北京,100083;北京大学,基础医学院生物化学与分子生物学系,北京,100083
【正文语种】中文
【中图分类】Q5-33
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凝胶过滤层析实验中Sephadex 的溶胀与回收保存王 璞,林 红,朱 滨(北京大学基础医学院生物化学与分子生物学系,北京 100083)摘 要:Sephadex (交联葡聚糖凝胶)是多糖类物质,尽管其结构、性能较稳定,但在压力、强酸、氧化剂存在情况下,也会发生部分糖苷键水解,或凝胶交联结构受损。
在使用过程中,或使用后处理、保存过程中,可能会因上述原因或情况发生而影响凝胶层析的分离效果。
该文根据作者自己的工作经验,着重介绍了回收后的交联葡聚糖的干燥保存法,以提高交联葡聚糖的稳定性和重复使用率。
关键词:交联葡聚糖凝胶;溶胀;脱水;干燥中图分类号:Q5233 文献标识码:B 文章编号:100224956(2006)022*******Methods About S welling,Recovery and Preservati on of Sephadex inGel Filtrati on Chr o mat ographyWANG Pu,L I N Hong,ZHU B in(Depart m ent of B i oche m istry and Molecular B i ol ogy,School of BasicM edical Sciences,Peking Uni 2versity,Beijing 10083,China )Abstract:Sephadex is a gr oup of highly s pecialized gelfiltrati on and chr omat ographic media which composed of mac 2r oscop ic beads synthetically derived fr om the polysaccharide,dextran .A lthough their structures and characters are relatively stable,the hydr olysis of glucosidic bond or structures failure of gel cr oss 2linkage will happen when Sepha 2dex is exposed in great p ressure,str ong acid and oxidants in the p r ocess of use,recovery and p reservati on .The effects of gel filtrati on will be decreased just on these conditi ons .I n this paper,the authors intr oduced a kind of avail 2able Sephadex recovery and p reservati on method 22dehydrating/drying method that could greatly i m p r ove the stability and repeat utilizati on of Sephadex .Key words:Sephadex;s welling;dehydrati on;drying收稿日期:2005206202作者简介:王 璞(1976—),北京市人,大专,实验技师1 凝胶过滤层析因其操作简便、操作条件温和,不易引起生物样品变性失活,分离效果好而广泛应用于蛋白质、酶、核酸的分离纯化。
具有分子筛效应的多孔性网状凝胶都可用作凝胶过滤层析的支持物。
我们在本科生生化实验中选用了人工合成的SephadexG 250(交联葡聚糖凝胶)作为层析支持物来分离血红蛋白与DNP 2鱼精蛋白的混合物。
交联葡聚糖是由多聚葡萄糖与环氧化氯丙烷通过交联反应制成的多孔网状凝胶,成品为细小的白色颗粒状粉末,由于含有大量羟基,使其具有很强的亲水性,能迅速在水或电解质溶液中溶胀,因此使用非常方便。
但由于操作过程溶胀处理,层析时有一定压力洗脱,或偶有pH 变化,或接触氧化剂,使2OH 发生氧化,都会影响凝胶的结构、性能。
针对上述可能影响凝胶分离效果的几个环节,我们在实际工作中,对凝胶的溶胀、回收和保存几个环节进行了部分改进,尤其是回收后的干燥保存法经济实用、应用效果好。
1 Sephadex G 250的溶胀Sephadex 能耐受0.2mol/LNa OH 长时间处理和pH 中性下高压蒸煮。
Sephadex 为干粉状,使用前必须使其在水中充分溶胀,溶胀是否彻底会直接影响蛋白质分离效果。
(1)室温溶胀法 取Sephadex G 250凝胶10g,置于烧杯中,加入新鲜的超纯水300m l,用玻璃搅棒轻轻搅匀,用封口膜密封,室温放置过夜,使其充分溶胀,第2天进行倾斜浮选,除去漂浮于水面的细小颗粒,备用。
处理过程中应避免剧烈搅拌,以防止破坏凝胶结构。
此法较温和,不易造成凝胶结构的改变,推荐使用。
(2)加热溶胀法 取Sephadex G 250凝胶10g,置于烧杯中,加入新鲜的超纯水300m l,于沸水浴中国科技论文统计源期刊(中国科技核心期刊) 实 验 技 术 与 管 理EXPER I M ENT AL TECHNOLOGY AND MANAGE MENT Vol .23 No .2FEB.2006中煮沸1小时后取出,冷却后进行倾斜浮选,除去漂浮于水面的细小颗粒;再加入过量蒸馏水,用玻璃搅棒轻轻搅匀,使其自然沉降,再进行倾斜浮选,重复324次,备用。
如时间紧迫可采用此法溶胀凝胶,但根据我们的体会,沸腾可能会造成凝结颗粒结构破坏,因此我们建议尽量避免使用该法。
不同类型及规格的Sephadex膨胀时间及膨胀体积不同,表1供参考。
表1 不同型号的Sehadex的膨胀时间和膨胀体积Sephadex型号溶胀所需最少时间/h沸水浴室温溶胀体积m l/g干粉G210132～3G21513 2.5～3.5G225264～6G250269～11G2*******～15G210054815～20G215057220～30G2150(Supefine)57218～22G220057230～402 Sephadex G250的回收与保存交联葡聚糖是多糖类物质,适宜微生物生长。
微生物分解的酶能水解多糖的糖苷键,或因流洗液、保存液不纯,混杂氧化剂或细菌,导致多糖羟基氧化,或糖苷键水解、断裂,从而改变凝胶的层析特性,影响层析分离效果。
因此,我们的洗脱过程尽量使用超纯水,以避免细菌或氧化剂污染。
对使用过的凝胶若较长时间不用,必须加入防腐剂,并置于4℃冷藏箱内保存;或脱水处理使其恢复干粉状保存备用。
(1)湿态保存法 将流洗过的葡聚糖凝胶放入烧杯或广口容器中,加入叠氮钠,终浓度为0.02%,封好口,置于4℃冷藏箱内保存可达数月。
但此方法保存时间仍然有限,而且遇到长时间停电,保存温度发生变化,会影响防腐剂的抑菌效果,微生物的滋生会使凝胶层析特性发生变化,再使用时会影响分离效果。
(2)干燥保存法 将使用过的葡聚糖凝胶用蒸馏水反复流洗干净,倒入烧杯中,倾斜倒掉上层水相,加入95%乙醇至终浓度为50%,用玻棒搅匀,室温沉降脱水,去除上清。
沉淀中再加入95%乙醇,连续进行3次脱水处理,3次酒精的终浓度依次递升为70%、90%、95%。
这种渐进式的温和脱水可避免因骤然脱水发生的凝胶快速收缩、变形。
最后加入无水乙醇进行脱水处理。
处理过程中可观察到葡聚糖凝胶体积缩小,颜色变白,葡聚糖凝胶周围有细小气泡产生,说明葡聚糖凝胶正在脱水皱缩。
脱水过程中可用玻棒将凝胶搅匀,或轻敲杯壁,使气泡释放到液体中。
为确保脱水彻底,最后一步无水乙醇脱水可重复一次。
脱水后,将乙醇倒掉(可回收下次再用),加入适量乙醚(没过凝胶即可),用玻棒搅匀,进行洗涤干燥,然后倒掉乙醚;此步可重复一次。
乙醚具有强挥发性和易燃性,操作时应在通风柜中进行。
处理后的凝胶放在通风柜中自然干燥,干燥后的凝胶即恢复成白色干粉状,可置于试剂瓶中保存数年。
虽然Sephadex G250价格较贵,但其可以反复使用,凝胶过滤的洗脱过程即是其再生过程,使用后的凝胶保存得当可增加其使用次数。
参考文献(References):[1]F・奥斯伯.颜子颖,王海林译.精编分子生物学实验指南[M].北京:科学出版社,1998.[2]王新.实验中氮氧化物的采集[J].实验技术与管理,2002,19 (6):77279.(上接第20页)虑共模辐射。
3 加强防护防护的强度,随产品的用途而定。
对于无关紧要的电子产品,就不需要专门的防护。
而对于军用的电子产品及用于电厂与电网控制的电子设备,就需要加以最高等级的防护,因为即使是在极端情况下,也要保证这些设备能正常工作。
4 结论在设计印制电路板时,必须考虑电磁兼容问题,以确保设计功能的实现。
在高频时,简单的电路模拟可能不再适用,而需要用传输线理论或微波理论来分析遇到的问题。
参考文献(References):[1]吴正娴.微波原理[M].武汉:武汉大学出版社,1995.[2]Paul paris on of the contributi on common2mode and dif2ferential2mode currents inradiated e missi on[J].I EEE Trans onE MC,1989,31(5):1892193.[3]Gravelle LB,W ils on PF.E M I/E MC in p rinted circuit board2a litera2ture revie w[J].I EEE Trans on E MC,1992,34(5):1092116.[4]曾峰.印刷电路板(PCB)设计与制作[M].北京:电子工业出版社,2002.52王 璞,等:凝胶过滤层析实验中Sephadex的溶胀与回收保存。