001凝胶过滤层析实验中Sephadex的溶胀与回收保存

凝胶过滤层析实验中Sephadex 的溶胀与回收保存

王　璞,林　红,朱　滨

(北京大学基础医学院生物化学与分子生物学系,北京　100083)

摘　要:Sephadex (交联葡聚糖凝胶)是多糖类物质,尽管其结构、性能较稳定,但在压力、强酸、氧化

剂存在情况下,也会发生部分糖苷键水解,或凝胶交联结构受损。在使用过程中,或使用后处理、保存过程中,可能会因上述原因或情况发生而影响凝胶层析的分离效果。该文根据作者自己的工作经验,着重介绍了回收后的交联葡聚糖的干燥保存法,以提高交联葡聚糖的稳定性和重复使用率。关键词:交联葡聚糖凝胶;溶胀;脱水;干燥中图分类号:Q5233 文献标识码:B 文章编号:100224956(2006)022*******

Methods About S welling,Recovery and Preservati on of Sephadex in

Gel Filtrati on Chr o mat ography

WANG Pu,L I N Hong,ZHU B in

(Depart m ent of B i oche m istry and Molecular B i ol ogy,School of BasicM edical Sciences,Peking Uni 2

versity,Beijing 10083,China )

Abstract:Sephadex is a gr oup of highly s pecialized gelfiltrati on and chr omat ographic media which composed of mac 2r oscop ic beads synthetically derived fr om the polysaccharide,dextran .A lthough their structures and characters are relatively stable,the hydr olysis of glucosidic bond or structures failure of gel cr oss 2linkage will happen when Sepha 2dex is exposed in great p ressure,str ong acid and oxidants in the p r ocess of use,recovery and p reservati on .The effects of gel filtrati on will be decreased just on these conditi ons .I n this paper,the authors intr oduced a kind of avail 2able Sephadex recovery and p reservati on method 22dehydrating/drying method that could greatly i m p r ove the stability and repeat utilizati on of Sephadex .

Key words:Sephadex;s welling;dehydrati on;drying

收稿日期:2005206202

作者简介:王　璞(1976—),北京市人,大专,实验技师1

凝胶过滤层析因其操作简便、操作条件温和,

不易引起生物样品变性失活,分离效果好而广泛应用于蛋白质、酶、核酸的分离纯化。具有分子筛效应的多孔性网状凝胶都可用作凝胶过滤层析的支持物。我们在本科生生化实验中选用了人工合成的SephadexG 250(交联葡聚糖凝胶)作为层析支持物来分离血红蛋白与DNP 2鱼精蛋白的混合物。交联葡聚糖是由多聚葡萄糖与环氧化氯丙烷通过交联反应制成的多孔网状凝胶,成品为细小的白色颗粒状粉末,由于含有大量羟基,使其具有很强的亲水性,能迅速在水或电解质溶液中溶胀,因此使用非常方便。但由于操作过程溶胀处理,层析时有一定压力洗脱,或偶有pH 变化,或接触氧化剂,使2OH 发生氧化,都会影响凝胶的结构、性能。针对

上述可能影响凝胶分离效果的几个环节,我们在实

际工作中,对凝胶的溶胀、回收和保存几个环节进行了部分改进,尤其是回收后的干燥保存法经济实用、应用效果好。

1　Sephadex G 250的溶胀

Sephadex 能耐受0.2mol/LNa OH 长时间处理和pH 中性下高压蒸煮。Sephadex 为干粉状,使用前

必须使其在水中充分溶胀,溶胀是否彻底会直接影

响蛋白质分离效果。

(1)室温溶胀法　取Sephadex G 250凝胶10g,置于烧杯中,加入新鲜的超纯水300m l,用玻璃搅棒轻轻搅匀,用封口膜密封,室温放置过夜,使其充分溶胀,第2天进行倾斜浮选,除去漂浮于水面的细小颗粒,备用。处理过程中应避免剧烈搅拌,以防止破坏凝胶结构。此法较温和,不易造成凝胶结构的改变,推荐使用。

(2)加热溶胀法　取Sephadex G 250凝胶10g,置于烧杯中,加入新鲜的超纯水300m l,于沸水浴

中国科技论文统计源期刊(中国科技核心期刊) 实　验　技　术　与　管　理EXPER I M ENT AL TECHNOLOGY AND MANAGE MENT Vol .23　No .2

FEB.

2006

中煮沸1小时后取出,冷却后进行倾斜浮选,除去漂浮于水面的细小颗粒;再加入过量蒸馏水,用玻璃搅棒轻轻搅匀,使其自然沉降,再进行倾斜浮选,重复324次,备用。如时间紧迫可采用此法溶胀凝胶,但根据我们的体会,沸腾可能会造成凝结颗粒结构破坏,因此我们建议尽量避免使用该法。

不同类型及规格的Sephadex膨胀时间及膨胀体积不同,表1供参考。

表1　不同型号的Sehadex的膨胀时间和膨胀体积

Sephadex型号

溶胀所需最少时间/h

沸水浴室温

溶胀体积

m l/g干粉

G210132～3

G21513 2.5～3.5

G225264～6

G250269～11

G2*******～15

G210054815～20

G215057220～30

G2150(Supefine)57218～22

G220057230～40

2　Sephadex G250的回收与保存

交联葡聚糖是多糖类物质,适宜微生物生长。微生物分解的酶能水解多糖的糖苷键,或因流洗液、保存液不纯,混杂氧化剂或细菌,导致多糖羟基氧化,或糖苷键水解、断裂,从而改变凝胶的层析特性,影响层析分离效果。因此,我们的洗脱过程尽量使用超纯水,以避免细菌或氧化剂污染。对使用过的凝胶若较长时间不用,必须加入防腐剂,并置于4℃冷藏箱内保存;或脱水处理使其恢复干粉状保存备用。

(1)湿态保存法　将流洗过的葡聚糖凝胶放入烧杯或广口容器中,加入叠氮钠,终浓度为0.02%,封好口,置于4℃冷藏箱内保存可达数月。但此方法保存时间仍然有限,而且遇到长时间停电,保存温度发生变化,会影响防腐剂的抑菌效果,微生物的滋生会使凝胶层析特性发生变化,再使用时会影响分离效果。

(2)干燥保存法　将使用过的葡聚糖凝胶用蒸馏水反复流洗干净,倒入烧杯中,倾斜倒掉上层水相,加入95%乙醇至终浓度为50%,用玻棒搅匀,室温沉降脱水,去除上清。沉淀中再加入95%乙醇,连续进行3次脱水处理,3次酒精的终浓度依次递升为70%、90%、95%。这种渐进式的温和脱水可避免因骤然脱水发生的凝胶快速收缩、变形。最后加入无水乙醇进行脱水处理。处理过程中可观察到葡聚糖凝胶体积缩小,颜色变白,葡聚糖凝胶周围有细小气泡产生,说明葡聚糖凝胶正在脱水皱缩。脱水过程中可用玻棒将凝胶搅匀,或轻敲杯壁,使气泡释放到液体中。为确保脱水彻底,最后一步无水乙醇脱水可重复一次。脱水后,将乙醇倒掉(可回收下次再用),加入适量乙醚(没过凝胶即可),用玻棒搅匀,进行洗涤干燥,然后倒掉乙醚;此步可重复一次。乙醚具有强挥发性和易燃性,操作时应在通风柜中进行。处理后的凝胶放在通风柜中自然干燥,干燥后的凝胶即恢复成白色干粉状,可置于试剂瓶中保存数年。

虽然Sephadex G250价格较贵,但其可以反复使用,凝胶过滤的洗脱过程即是其再生过程,使用后的凝胶保存得当可增加其使用次数。

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[2]王新.实验中氮氧化物的采集[J].实验技术与管理,2002,19 (6):77279.

(上接第20页)

虑共模辐射。

3　加强防护

防护的强度,随产品的用途而定。对于无关紧要的电子产品,就不需要专门的防护。而对于军用的电子产品及用于电厂与电网控制的电子设备,就需要加以最高等级的防护,因为即使是在极端情况下,也要保证这些设备能正常工作。

4　结论

在设计印制电路板时,必须考虑电磁兼容问题,以确保设计功能的实现。在高频时,简单的电路模拟可能不再适用,而需要用传输线理论或微波理论来分析遇到的问题。

参考文献(References):

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