犬细小病毒的分离与鉴定

犬细小病毒的分离与鉴定

摘要：采用细胞培养法对疑似犬细小病毒的粪便和内脏进行了分离和鉴定，并对分离到的病毒进行生物学特性鉴定和动物回归试验。结果共分离到3株CPV，分离株在猫肾细胞F81产生明显细胞病变，血凝效价达1∶27～1∶210，细胞病变能被犬细小病毒阳性血清所抑制，接种幼犬后，分离株3可以引起试验犬发病死亡。

关键词：犬细小病毒；分离；鉴定

犬细小病毒（Canine parvovirus，CPV）属于细小病毒科细小病毒属，为单股、负义、线形无囊膜的DNA病毒[1]。CPV可引起犬的出血性肠胃炎和心肌炎，并使白细胞大量减少，在幼犬中的发病率和死亡率都很高[2]。CPV对多种理化因素和常用消毒剂具有较强的抵抗力，在4～10 ℃存活6个月，37 ℃存活2周，56 ℃存活24 h，80 ℃存活15 min，在粪便中可存活数月至数年[3]；该病毒对乙醚，氯仿和醇类有抵抗力[4]。CPV一年四季均可发病，以冬、春多发[5]，饲养管理条件骤变、长途运输、寒冷、拥挤均可促使该病发生[6]。病犬是主要传染源，其呕吐物、唾液、粪便中均有大量病毒[7]。根据临床症状和血清学反应，可做出准确诊断[8-13]。本研究通过对山东毒株分离，并对其部分生物学特性进行研究，为该病的防治和后续研究提供一定的理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 主要试剂DMEM培养基为Gibco产品；小牛血清、谷氨酸胺、双抗、胰蛋白酶等购自大连宝生物TaKaRa有限公司；其他化学试剂均为分析纯试剂。

1.1.2 病料病料为2009～2011年聊城大学兽医院收集或其他养犬场送检的可疑CPV病料，包括20份粪便样品和10份脏器。

1.1.3 试验动物和细胞8只40～50日龄的山东细犬幼犬（抗CPV HI抗体效价小于1∶4），健康状况良好；猫肾传代细胞系（F81）和犬肾传代细胞系（MDCK）等由聊城大学农学院实验室保存。

1.2 方法

1.2.1 试剂的配制

1）1%猪红细胞悬液的制备。用20 mL注射器内吸入阿氏液3～5 mL，于健康猪前腔静脉采血10～15 mL，立即混匀，4 ℃保存备用。使用时用PBS洗涤保存的猪红细胞，1 000 r/min离心5 min，洗涤3次，取红细胞泥1 mL加稀释液100 mL，再加入小牛血清白蛋白0.1 g，即为1%猪红细胞悬液。

2）HA抗原配制。用移液器向V型血凝板每孔加稀释液25 μL，然后吸取25 μL经福尔马林灭活的CPV细胞培养物，在血凝板上倍比稀释，最后1孔不稀释，作为阴性对照；接着每孔加稀释液25 μL和1%猪红细胞悬液50 μL，于振荡器上振荡1 min混匀，于4 ℃冰箱静置1～2 h，待红细胞完全沉淀后判定。判定的方法是以50%红细胞凝集为终点，在对照孔红细胞完全不凝集，呈圆形小点

沉于孔底时，凝集终点的稀释倍数即为该抗原的HA效价，将此效价除以8，即是8单位血凝抗原的稀释倍数。

1.2.2 病料的处理

1）粪便样品的处理：将病犬粪便用DMEM培养液稀释（m∶m=1∶9），再加等量的氯仿混匀，4 000 r/min离心10 min，取上清，加入双抗200 μL，4 ℃过夜，再经0.22 μm微孔滤膜过滤除菌，-20 ℃保存备用。

2）脏器样品的处理。将脏器样品用灭菌后的研磨器进行研磨，并反复冻融3次，同时加入9倍体积的DMEM细胞培养液，5 000 r/min离心25 min，取上清液，经过滤除菌。将处理好的样品置-20 ℃保存，待分离鉴定。

1.2.3 血清样品HI抗体效价的测定取待检血清0.2 mL，加入猪红细胞悬液1滴，混匀于室温吸收1 h，离心取上清液待检。先用移液器向血凝板每孔加稀释液25 μL，然后吸取待检血清25 μL，在血凝板上倍比稀释，最后2孔不稀释作为对照，每孔加8单位HA抗原25 μL，最后1孔不加，作为血清对照。加完后振荡混匀，于4 ℃冰箱静置1～2 h判定。判定的方法是以完全不凝集为终点，在抗原对照孔完全凝集，血清对照孔完全不凝集的情况下，血清出现终点抑制的稀释倍数，即为该血清的HI效价。

1.2.4 病毒的分离采用同步接毒法，在F81细胞消化传代后，按培养液量体积的1/10接入处理过的样品，37 ℃静置培养3～5 d，每天观察有无细胞病变。如无细胞病变，则于培养的第4～5 d收取上清，继续按常规传代培养，至第5代仍无病变判为分离结果阴性；若出现细胞病变则分离结果为阳性，反复冻融3次，收毒，-20 ℃保存。

1.2.5 生物学特性鉴定

1）理化特性。按《动物病毒学》[3]规定进行，取分离病毒的F81细胞培养物，分别做以下处理：50 ℃水浴作用60 min；加20%乙醚振荡10 min，放4 ℃过夜，并无菌挥发除去全部乙醚；将病毒液调节pH为3时于4 ℃作用处理1 h，再用0.1 mol/L NaOH调至pH 7.2，进行耐酸性试验，然后分别用F81细胞测定其TCID50变化。

2）红细胞血凝试验。采用微量血凝（HA）试验，分别用0.5%的鸡、猪、大鼠、兔和人（O型）的红细胞悬液测定病毒培养液的HA效价。

3）细胞敏感谱。选用猫肾传代细胞系（F81）、犬肾传代细胞系（MDCK）作为接种对象，分别分离得到HA效价≥1∶128的细胞培养液。按常规方法进行同步接毒，37 ℃静置培养24 h后，换液，每天观察细胞病变（CPE），4～5 d 收获冻融，再以同样方法连传5代，以出现CPE作为感染指标。

1.2.6 动物回归试验

用所分离的CPV分离株1，2和3（HA效价均为1∶512～1∶2 048）对试验犬进行人工感染试验。接种途径为口服，剂量为5 mL，设空白对照组和试验组。将幼犬随机分为4组，每组2只。试验Ⅰ组幼犬接种分离株1；试验Ⅱ组幼犬接种分离株2；试验Ⅲ组幼犬接种分离株3；将第4组设为空白对照，接种生理盐水。对4组试验犬进行隔离饲养。接种后，每天观察试验犬的临床变化并进行体温的测量，每3 d进行一次白细胞计数，自接种后5 d开始收集粪便，并进行CPV的HA/HI检测。攻毒后观察15 d，如无眼观临床症状、白细胞总数正常，则视为试验犬健康。2 结果与分析

2.1 病毒分离结果

将处理后的病料接种F81细胞后，采用同步接毒进行病毒分离。在第一代细