小鼠胚胎成纤维细胞MEF培养相关知识总结
小鼠胚胎成纤维细胞的分离_扩增和抑制
2002年8月第12卷 第4期中国实验动物学杂志CHINESE J OUR NAL OF LABOR ATORY ANIMAL SCIEN CE Augus t ,2002Vol .12 No .4研究报告小鼠胚胎成纤维细胞的分离、扩增和抑制刘民 李柏青(蚌埠医学院,蚌埠市 233003) 【摘要】 目的 建立有效的胚胎成纤维细胞饲养层体系,用于分离和克隆胚胎干细胞研究。
方法 取胎鼠组织制备小鼠原代成纤维细胞,观察不同分离和培养条件对细胞增殖的影响,以及丝裂霉素C 对细胞增殖的抑制作用;细胞增殖的数量用MTT 法测定。
结果 分离小鼠胚胎原代成纤维细胞的最适胎龄是12.5～14.5d ;20℃～25℃时,用0.25%胰蛋白酶消化组织的最佳时间为3min ;可在培养3～6d 后进行传代。
细胞冻存于-80℃3～4个月,复苏后能正常传代。
丝裂霉素C 抑制胚胎成纤维细胞增殖的合适浓度为每毫升20μg 105细胞,作用2～4h ,可维持小鼠原代胚胎成纤维细胞9d 内不增殖也不死亡。
结论 在合适条件下,小鼠原代胚胎成纤维细胞能顺利分离和培养,并能多次传代和冻存;经丝裂霉素C 处理后增殖受抑制,可作为饲养层细胞用于胚胎干细胞的研究。
【关键词】 小鼠;胚胎;成纤维细胞;胚胎干细胞【中图分类号】Q952 【文献标识码】A 【文章编号】1002-1485(2002)04-0215-05Study on the Proliferation and Inhibition of Mouse Embryonic FibroblastsLIU Min ,LI Baiqing(Bengbu M edical College ,Bengbu 233003,China )【Abstract 】 Objective To establish mouse fibroblast cells as feeder cells in order to isolate and clone mouse embryonic stem cells in vitro .Methods The mouse primary embryonic fibroblasts were isolated from mouse fetus of different gestational ag -es ,under different separation and culture conditions .The proliferation of fibroblasts and in hibition of mytomycin C were observed by measuring cell numbers using MTT assay .Results The optimal gestational age for isolation of mouse embryonic fibroblasts was from on 12.5to 14.5day .At the temperature of 20to 25℃,the optimal ti me for digestion of fetus tissue to obtain fibroblasts was 3min with digestion solution containing 0.25%of trypsin .The optimal concentration of mytomycin c to inhibit proliferation of fi -broblasts was 20μg 105cells for 2to 4hours ,at that condition of treatment of mytomycin C the fibroblasts were alive for 9days without proliferation .Conclusion In this study the mouse embryonic fibroblasts were successfully established for growth of mouse embryonic stem cells .【Key words 】 Mice ;Embryo ;Fibroblasts ;Embryo stem cells[作者简介]刘民,男(1963-),高级实验师。
小鼠胚胎成纤维细胞的分离与培养
小鼠胚胎成纤维细胞的分离与培养张 怡1 赵连三1△ 汪成孝2 雷秉钧11.四川大学华西医院传染科(成都610041);2.四川大学华西基础医学与法医学院免疫学教研室 【摘要】 目的 探讨影响小鼠胚胎成纤维细胞(M EF)分离和培养的一些因素,以建立稳定的M EF培养体系。
方法 取BA L B/c小鼠胚胎分离成纤维细胞,利用体外培养体系,对M EF的生长形态、生长曲线及细胞周期进行观察,并对不同胚胎日龄以及不同胰酶作用时间对M EF分离及培养的影响进行研究。
结果 13.5d胎龄鼠胚的M EF 分离效果优于10.5d、18.5d胎龄鼠胚;M EF在体外为贴壁生长型细胞,第三代细胞增殖旺盛;在室温条件下,0. 25%胰酶消化M EF时间以3～5min为宜。
结论 M EF在第3代增殖旺盛,最适宜作胚胎干细胞的饲养层。
【关键词】 小鼠胚胎成纤维细胞 胚胎干细胞 饲养层【中图分类号】 R329.2Isolation and Culture of Mouse Embryonic Fibroblast Z ha ng Yi*,Zhao Lia nsa n,Wa ng Che ng x ia o,Le i Bing jun.*T he I nf ectious D iseas es D ep ar tment,W est China H osp ital,Sichuan University,Cheng du610041,China 【Abstract】 Obj ective T o establish a stable cult ur e system o f mouse embry onic fibr obla st(M EF).Methods We isolated M EF fr o m t he embry os of BAL B/c mouse and investig ated t he mo rpholog y,g r ow th cur ve and cell cycle of M EF in v itr o.T he effects of the gestational ag e(days)o f mo use embr yo s and the time o f dig estio n o n the isolation and culture o f M EF w ere assessed.Results T he mo use em br yo of13.5d is better than that of10.5d and18.5d o n the iso lat ion o f M EF.M EF in vitro is a kind of a dher ent cell w ith g oo d a bility fo r pr olifer ation in passag e3.In ro om t emper atur e,the digestive time o f0.25%t ry psin should be3-5min.Conclusion M EFs(P3) ar e quite suited to be a feeder lay er o f embry onic stem cells.【Key words】 M ouse em br yo nic fibro blast Embr yo nic stem cells F eeder layer 胚胎干细胞(em bry onic stem cells,ES细胞)是指来源于着床前囊胚内细胞团或早期胎儿原始生殖细胞的一类未分化的全能性细胞,具有无限增殖和全能分化的潜力[1,2]。
文献阅读——从小鼠胚胎和成年纤维细胞培养多功能干细胞的诱导由因子决定
文献阅读——从小鼠胚胎和成年纤维细胞培养多功能干细胞的诱导由因子决定原作者：Kazutoshi Takahashi（高桥俊）Shinya Yamanaka （山中伸弥）发表于：Cell Volume 126, Issue 4, 25 August 2006, Pages 663–676一研究介绍：分化的细胞可以通过核转移到卵母细胞，或者通过胚胎干细胞被重新编程到胚胎形态。
原作者证明了从小鼠胚胎或成纤维细胞培养诱导多功能干细胞是通过引入4个因子，即Oct3/4, Sox2, c-Myc,和Klf4决定。
指定的iPS（诱导的多功能干细胞）细胞，能显示出ES细胞的形态和生长特性，以及表达ES细胞标记基因。
皮下移植iPS细胞到裸鼠会造成含有多种来自三个胚层组织的肿瘤。
这些数据表明，多功能干细胞可以直接从通过加入几个决定因子到成纤维细胞培养物中获得。
胚胎干细胞具有无限增值的能力，并且同时保持着多功能性以及分化成三个胚层的能力，所以它可以用来治疗某些疾病。
为了规避伦理问题，因此从患者自身的细胞中提取多功能干细胞。
未受精的卵子和胚胎干细胞中具有赋予体细胞全能性的因子。
研究调查了几个转录因子，得出通过组合选定的因素能够产生多功能干细胞。
二论文选题与分析：研究人员把Oct3/4,Sox2、c-Myc和Klf4这四种转录因子基因克隆入病毒载体，然后引入小鼠成纤维细胞，发现可诱导其发生转化，产生的iPS细胞在形态、基因和蛋白表达、表观遗传修饰状态、细胞倍增能力、类胚体和畸形瘤生成能力、分化能力等方面都与胚胎干细胞相似。
这证明了细胞的分化不是单向的。
也许最终能够实现直接从病人体细胞中获得多能性细胞的建立。
为减少器官移植的免疫排斥反应的解决提供了可能途径。
其研究过程中开发的检测筛选干细胞的系统也为实验研究提供了新的检测方法三研究思路与技巧：原作者设计了几个实验，并且得到了如下现象与结果：（1）、选定了24个候选基因，通过对G418的抗性检测。
dna重组实验报告
dna重组实验报告《DNA重组实验报告》摘要：本实验旨在通过DNA重组技术，将外源基因插入到目标细胞的染色体中，以实现对目标细胞的基因改造。
实验结果表明，成功实现了DNA重组，外源基因被有效地插入到目标细胞的染色体中，并且对目标细胞的基因表达产生了显著影响。
这一实验结果为基因工程技术的应用提供了重要的理论和实践基础。
引言：DNA重组技术是现代生物技术领域中的重要技术之一，它通过将外源基因插入到目标细胞的染色体中，实现对目标细胞的基因改造。
DNA重组技术的应用范围非常广泛，包括基因治疗、转基因作物的培育、生物制药等多个领域。
本实验旨在通过DNA重组技术，对目标细胞进行基因改造，并观察外源基因插入对目标细胞的基因表达产生的影响。
材料与方法：实验所用细胞系为小鼠胚胎成纤维细胞（MEF），外源基因为绿色荧光蛋白（GFP）基因。
首先，将外源基因GFP与质粒载体进行连接，构建成重组质粒。
然后，将重组质粒导入到MEF细胞中，利用转染技术实现外源基因的插入。
最后，通过PCR、蛋白质印迹等技术手段对目标细胞的基因表达进行检测和分析。
结果与讨论：实验结果表明，成功实现了DNA重组，外源基因GFP被有效地插入到MEF细胞的染色体中。
通过PCR检测和蛋白质印迹分析，发现外源基因的插入对目标细胞的基因表达产生了显著影响，MEF细胞表现出了明显的绿色荧光。
这一实验结果表明，DNA重组技术可以有效地实现对目标细胞的基因改造，为基因工程技术的应用提供了重要的理论和实践基础。
结论：本实验成功实现了DNA重组，外源基因被有效地插入到目标细胞的染色体中，并对目标细胞的基因表达产生了显著影响。
这一实验结果为基因工程技术的应用提供了重要的理论和实践基础，为相关领域的研究和应用提供了重要的参考和借鉴。
分离和培养MEF细胞
分离和培养MEF细胞主要实验步骤：（冰上操作）1）处死：首先，将怀孕13.5-14.5天的小鼠拿到一个饭盒中，采用脱颈椎的方法将小鼠处死，将小鼠浸泡在酒精中2-3min。
2）取胎鼠：将已处死的孕鼠拿到超净台上的大培养皿的盖子中，用一对剪刀和镊子剪开小鼠的腹部，取出胎鼠，边取边用剪刀将脐带剪开。
3）取胚胎：将取出的胎鼠转移至大培养皿中（装有预冷的1×PBS），用剪刀将外面包裹的两层膜剪开（外面一层膜稍厚，里面一层膜稍薄，两层膜中间是羊水），取出胚胎。
（冰上操作）4）去四肢和骨骼：将胚胎转移至新的装有预冷PBS的培养皿中，用一对镊子轻轻的将头、四肢及躯干骨骼剔除，仅留肉（主要是躯干上的嫩肉），特别注意去尽血（血长得快，会对MEF造成很大影响）。
（冰上操作）5）消化：将组织块移至新的装有预冷PBS的培养皿中，用小剪刀剪碎（小于1 mm 3的组织块，取5倍体积（可以多一点点）胶原酶IV（5mg/ml in surm-free DMEM，0.22um抽滤），反复吹散组织块，并用巴氏管将组织悬液转移至15 mL 离心管中，37℃水浴锅中消化30-60 min。
加入等体积的PBS终止。
6）过滤：将200目筛网置于一个新的培养皿中，将细胞悬液滴至筛网上过滤（如果比较粘稠滤不下去，可以再加一些PBS反复吹吸），过滤完后可用1mL培养基再冲洗一次。
7）离心：将滤液转移至一个新的15 mL离心管中，1000 rpm离心5 min。
8）多聚赖氨酸处理培养皿：1ug/ml多聚赖氨酸（用水配成2mg/ml贮存液，用时用PBS稀释成工作浓度）润洗培养瓶，吸走多余的多聚赖氨酸，再用PBS洗一遍培养瓶。
9）接种：弃上清，向沉淀中加1 mL培养基，用枪将其吹打成细胞悬液。
血球计数板计数，并按照一定密度接种于处理过的培养瓶。
T75培养瓶可接种1×106细胞。
用含有10% FBS, 1% P/S的DMEM培养。
10）换液：4小时后换新鲜培养基。
高中生物 高考全程复习课后基础巩固训练28 选修三 现代生物科技专题
姓名：班级： 正确率： % 时间控制：推荐20分钟2021届老高考全程复习课后基础巩固训练28 选修三 现代生物科技专题非选择题1.下图1是培养小鼠胚胎成纤维细胞(MEF 细胞)的示意图,图2是在用MEF 细胞制成的饲养层上培养胚胎干细胞(ES 细胞)的示意图。
请回答下列问题:(1)图1所示,制备细胞悬液时,常用 酶来消化剪碎的组织块。
配制培养液时,通常需要在合成培养基的基础上添加 等一些天然成分。
当MEF 细胞分裂生长到细胞表面相互接触时就停止分裂,这种现象称为细胞的 。
(2)ES 细胞是由 中分离出来的一类细胞,ES 细胞在功能上具有发育的 。
(3)MEF 细胞能够分泌某些蛋白质,其合成到分泌至细胞外的过程是:核糖体→ →囊泡→ →囊泡,再通过 方式分泌到细胞外。
在培养液中单独培养ES 细胞时,ES 细胞容易发生分化,结合图2可推知MEF 细胞的作用是 。
(4)在治疗性克隆过程中,细胞核取自患者细胞,这是为了避免向患者移入组织细胞后体内发生 反应。
2．下面是将四倍体兰花的叶片通过植物组织培养形成植株的示意图，请结合图解回答相关问题： 四倍体兰花叶片――→①愈伤组织――→②胚状体――→③植株(1)选取四倍体兰花叶片时，要选择________的叶片；剪下叶片后需要经过一系列的消毒过程，一般先用流水冲洗20 min 左右，在无菌操作台上用体积分数为________的酒精消毒30 s ，取出后在无菌水中清洗，再用________溶液处理30 min ，立即用无菌水冲洗2～3次。
(2)离体组织培养常用MS 培养基，其主要成分包括大量元素、微量元素、有机物(如甘氨酸、烟酸、肌醇、维生素以及________等)，在配制好的MS 培养基中，常常需要添加植物激素，其中，________和________是启动细胞分裂、脱分化和再分化的关键激素。
(3)①过程称为________；从①、②的结果看，它们的实质都是________________________________________________。
最新一般常用的喂养细胞小鼠胚胎纤维母细胞ppt课件
多能性 (Multipotent) --可分化成親緣關係較近的一群細胞。
單能性 (Unipotent) --只能分化成單一種細胞。
8
幹細胞定義
幹細胞定義為具有自我更生(selfrenewal)及多元性分化 (multilineage differentiation)能力 的細胞。
18
Oct4, Sox2, c-Myc, and Klf4 將 mouse fibroblasts 誘導為 pluripotent stem cells (萬能性幹細胞) → 誘導萬能性幹細胞 [ induced pluripotent stem (iPS) cells ]。
c-Myc
此基因的表現會使人類胚胎幹細胞分化，在誘
hES基因 庫
14個gபைடு நூலகம்nes
4個核心基因 實核心驗基二因
IMR90 fetal fibroblast
foreskin fibroblast
轉導
Geneticin selection
4個核心基因
49
IMR90 fetal fibroblast
從90萬個IMR90 cells中有198個 iPS colonies
23
實驗總流程
24
實基因驗篩一選
4個核心基因 核實心驗基二因
hES基因 庫
轉導
IMR90 fetal fibroblast
14個 genes
Geneticin selection
幹細胞形
體細
胞
iPS(IMR90)-1 to iPS(IMR90)-4
4個核心基 因
表面
態 轉導
lif
gp130在小鼠ES细胞增殖过程中的作用建系之初，人们注意到小鼠ES细胞只有与小鼠胚胎成纤维细胞(mouse embryonic fibroblast, MEF )共培养才可以维持其自我更新的特性；若失去MEF的支持则立即发生分化，说明MEF能促进ES细胞增殖并/或抑制其分化。
之后的研究表明：MEF通过分泌白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor, LIF)抑制ES细胞的分化［10,11］。
LIF属于IL-6细胞因子家族，该家族细胞因子主要有IL-6、IL-11、LIF、CNTF、CT-1、OSM等。
该家族不同细胞因子具有相同或相似的生物学效应。
例如，OSM，CNTF，CT-1及LIF都能抑制ES细胞分化。
ES细胞不表达IL-6的受体，故IL-6不能抑制ES细胞分化，但当IL-6和其可溶性受体共同作用于ES细胞时即可以抑制ES细胞的分化［12］。
IL-6家族不同因子具有相同生物学效应的分子基础是它们共同的受体gp130［13］。
gp130是一种跨膜蛋白，属细胞因子受体超家族，本身无激酶活性，其介导的信号传递依赖于细胞内一种非受体型酪氨酸(Tyr)蛋白激酶JAK (Janus kinase)。
gp130与配基结合引起细胞内的不同JAK分子之间的靠近和相互磷酸化，活化的JAK继而使gp130特定位点的Tyr残基磷酸化。
继而，下游信号分子（如：STAT，SHP-2）则依赖SH2(Src homology 2)结构域与gp130上磷酸化的Tyr残基结合，而JAK则能够使与gp130 结合的该信号分子磷酸化而活化［14］。
STAT3 (signal transducer and activator of transcrip- tion) 即是JAK下游具有SH2结构的主要信号分子，当其与gp130上的磷酸化Try结合后，JAK可以将其磷酸化，继而进入核内调节相关基因的转录和表达。
IRM_2小鼠胚胎成纤维细胞的原代培养和生物学特性
5 % CO 2、 饱和湿度培养箱培养, 第 2 天全量换液 , 待 细胞生长至融合即可传代。 1 . 2 . 2 MEF的传代纯化和冻存 底 80 % ~ 90 % 时消化传代 , 加入 0 . 25 % 的胰蛋白酶 37 ! 消化 2 m in , 成纤维细胞缩成球形, 而上皮细胞 仍维持原状, 从而将成纤 维细胞与上皮 细胞分离。 传代过程中尽量保持细胞处于高密度生长 , 即传代 比例不超过 1 胞培养。 1 . 2 . 3 M EF 生长曲线 测定
3
3 。 MEF 继续培养和冻存同常规细
M EF 以 2 ∀ 10 /孔 的细胞密 度接种于 24 孔细胞培 养板, 置 37! 、 5 % CO2 培养箱中培养, 每隔 3 d 换液 1 次。每天同一时间点取 3孔用台盼蓝染色计数活
苏州大学学报 ( 医学版 ) 2010 ; 30 ( 1)
3
处于 活 跃 的 增 殖 期 ( S 期 ) ( 分 别 为 25 . 8 % 和 21. 2 % ) , 处于 G 2 /M 期的细胞比例 分别为 27 . 1 %
分离 I RM 2 小鼠 M EFs, 并进行原代培养和传代培 养。观察 M EF s 生长 形态 , 测定第 3 代和第 5 代细胞 生长曲
线、 细胞周期和增殖指数。 结果
胞 , 6 代前 M EF s生长良好。第 3 代和第 5 代 M EF s在培养至第 3 天开始进入对数生长期 , 到第 6 天时细胞数达到高 峰。 M EFs 增殖 活跃 , 第 3 代 和第 5 代细 胞增 殖指 数分 别为 53% 和 46% 。 结 论 M EF s , 为进一步利用 M EF s 研究小鼠的辐射抗性机制奠定了基础。 关键词 : 小鼠胚胎成纤维细胞 ; I RM 2 小鼠 ; 原代培养 中图分类号 : R329. 2+ 4 文献标识 码 : A 文章编号 : 1673- 0399( 2010) 01- 0001- 03
小鼠胚胎成纤维细胞的原代培养
小鼠胚胎成纤维细胞的原代培养一、实验材料1．主要仪器设备倒置显微镜、培养箱、离心机、25ml玻璃培养瓶、吸管；10ml尖底离心管、Ф80mm玻璃培养皿、青霉素小瓶、小鼠用解剖器械（包括眼科剪和眼科镊）2．试剂RPMI 1640培养液、平衡缓冲生理盐水(PBS, pH7.2-7.4)、0.25%胰蛋白酶3．实验动物孕14～15天(E14～16)昆白母鼠，领自福建医科大学实验动物中心。
二、实验步骤1. 获取小鼠胚胎(1) 取孕14～15天的母鼠，断颈处死，置于蜡盘上(2) 75％酒精消毒后，用剪刀和镊子剪开下腹皮肤，用两把弯头止血钳夹住切口处的皮肤向头尾两侧牵拉即剥皮，用眼科弯镊和眼科弯剪打开腹腔，暴露出子宫。
(3) 用眼科弯镊夹住一侧子宫，分离子宫系膜，眼科弯剪剪断子宫角和子宫颈，将整个子宫分离下来（注意勿使子宫滑落到腹腔外，避免污染）。
将子宫置于无菌滤纸上去除血迹。
(4) 在超净台内将子宫移入预先盛有PBS的培养皿中，洗涤数次。
(5) 将子宫移入另一盛有PBS的培养皿中，用眼科弯剪沿子宫系膜打开子宫，取出带有胎膜的胎鼠，并用两把眼科镊子剔除胎膜，取出胎鼠（一般有12只）。
(6) 将胎鼠移入另一盛有PBS的培养皿中，用眼科剪和眼科镊去除胎鼠的头、四肢和内脏，得鼠胚躯干。
(7) 将鼠胚躯干移至另一盛有PBS的培养皿中，用PBS洗涤两次至无肉眼可见的血色。
2. 小鼠胚胎成纤维细胞的原代培养（组织块半消化法）(1) 将干净的鼠胚躯干移至青霉素小瓶内（每6个鼠胚躯干装1瓶），用眼科直剪剪成约1 mm3以下的碎块。
(2) 用5ml的刻度吸管每瓶加入约3ml的PBS，混匀后连同鼠胚碎块一起移至一尖底离心管中。
(3) 室温下静置5min，用刻度吸管吸去上清液，留下鼠胚组织碎块。
(4) 向装有鼠胚碎块的离心管内加入1ml 0.25%胰蛋白酶消化液，轻轻吹吸30秒（可见组织块变得较为粘稠）。
(5) 加入1 ml 1640培养液终止消化，室温下静置5min，吸去上清液，留下鼠胚组织碎块沉淀。
小鼠胚胎干细胞mES小鼠iPS培养Protocol
4.将冻存管内细胞悬液转移至含2 ml MEF完全培养液的15 ml离心管内，以1000 rpm，离心5 min，离心后将上清液吸除，另加入新鲜的MEF完全培养液1 ml，重悬后按照一个T25培养瓶铺1106的MEF细胞，平均加入到T25培养瓶中，轻轻摇匀后置于37℃细胞培养箱。24 h以后可以传入小鼠胚胎干细胞或小鼠iPS细胞。
冻存液配方：
小鼠胚胎干细胞完全培养液或小鼠iPS完全培养液60，ES级FBS30，DMSO 10
附：小鼠胚胎干细胞与MEF细胞分离的简易方法（差速贴壁法）：
1.培养中的小鼠胚胎干细胞，按传代的操作方法将细胞用胰酶消化并吹打成单细胞悬液后，加入适量的提前温育好的小鼠胚胎干细胞完全培养液重悬细胞，吹打混匀，细胞悬液分装到无MEF细胞的培养皿或培养瓶（一般地，一个T25培养瓶中培养的小鼠胚胎干细胞，在一个10cm培养皿中进行差速贴壁。不要事先铺明胶，如铺明胶则细胞贴壁速度过快无法有效分离小鼠胚胎干细胞与MEF细胞）中。
5.复苏或传代小鼠胚胎干细胞或小鼠iPS细胞前，将T25培养瓶中的MEF完全培养液吸除，加入2 ml小鼠胚胎干细胞、小鼠iPS细胞完全培养液轻轻冲洗一遍后吸除，加入新鲜的小鼠胚胎干细胞、小鼠iPS细胞完全培养液待用。
复苏：
1.将小鼠胚胎干细胞、小鼠iPS细胞冻存管从液氮中取出，置于37℃水浴中使之迅速融解，取出后拿到超净台内用75酒精擦拭冻存管旋口处及外壁，防止污染。
6.每天更换小鼠胚胎干细胞、小鼠iPS细胞完全培养液。
小鼠胚胎成纤维细胞MEF培养相关知识总结
小鼠胚胎成纤维细胞MEF培养相关知识总结2009-08-19 18:39:07 来源:未知【大中小】评论: 条摘要：小鼠胚胎成纤维细胞的富集1、给13-14天的孕鼠注射大约0.5ml阿佛小鼠胚胎成纤维细胞的富集1、给13-14天的孕鼠注射大约0.5ml阿佛丁。
当鼠麻醉后，实施断颈法处死小鼠。
2、用70％乙醇擦拭腹部，把皮肤向后拉，暴露出腹膜。
用消毒过的工具，剪开腹壁以暴露出子宫角。
将子宫角移到10cm的皿里。
用10ml不含钙镁离子的PBS洗三遍。
3、用剪刀剪开每一测的胚囊,并将胚胎移到培养皿中。
4、用两副钟表镊子将胎盘和膜与胚胎分离开，分离后切除内脏（所有深色的东西）。
将胚胎转移到(有盖)培养皿中，用10ml不含钙镁离子的PBS洗三遍。
5、用带有弯钩的眼科剪将组织剪碎，当你剪的很累以致于不能再剪的时候，加入2ml 胰蛋白酶/EDTA继续剪。
再加入另外5ml胰蛋白酶/EDTA，并在37℃孵育大约20分钟。
此时，返回至第一步，对下一只鼠进行操作。
6、执行1－4步，到将胚胎置于胰蛋白酶/EDTA中这一步。
7、吹打胰蛋白酶/EDTA中的胚胎，直到有很少的组织物残留。
将皿放回培养箱再孵育10分钟。
8、用20ml培养基以终止胰蛋白酶/EDTA的消化，将皿中的物质转移至50ml锥形管中。
9、混匀管内的物质，加入到含有20ml培养基的T75培养瓶中。
每个培养瓶中装大约3个胚胎。
10、将这些培养瓶放在培养箱中37℃培养过夜。
11、将胚胎置于PBS中，并重复第5步。
12、第二天更换培养基，以去除碎片和中毒的细胞及其分泌的物质。
13、当培养瓶中的细胞长到80-90%汇合时并仍处于指数生长期时，是冻存细胞的最佳时期。
一般说来，这发生在准备胚胎的第二天。
这可能或早或晚发生，所以请注意观察你的培养瓶。
注释：我们已用CF－1品系的鼠制备了成纤维细胞。
培养基成分：88％DMEM10％FBS1％NEAA1% 双抗对于新建立的细胞系，要对样本进行支原体检测。
小鼠胚胎成纤维细胞的分离和培养
小鼠胚胎成纤维细胞的分离和培养一、实验材料1.主要仪器设备(1)倒置显微镜（Olympus，Japan）(2)CO2培养箱（BB16HF，上海力申科学仪器有限公司）(3)100ml的玻璃培养瓶（江苏海门市大路塑料实验仪器厂）(4)6孔培养板（COSTAR，每孔直径为3.5cm）(5)Eppendroff管(6)1ml,2ml,5ml的玻璃滴管各30支；10ml尖底离心管和直径为8cm的平皿(7)离心机(8)5ml冻存管(9)两套小鼠用解剖器械（包括眼科剪和眼科镊）2.主要试剂配制(1)MEF(mouse embryo fibroblast，小鼠胚胎成纤维细胞)培养液——低糖DMEM母液1)用一个1000ml的大烧杯加入1000ml无菌无内毒素的超纯水（购自福州新北生化工业有限公司）；2)将一小袋低糖DMEM(GIBCO/BRL,Cat.No.31600-034)全部加入上述水中，同时轻轻搅拌，并冲洗包装袋的内面以洗下所有的粉未。
3)每升培养基中添加3.7gNaHCO3。
4)搅拌直至完全溶解。
5)用1NHCl或1NNaOH调培养基的pH至比最终的工作液的PH低0.2-0.3，调好PH后，将容器密封（在该实验中用1NHCl调PH至7.3）。
6)立即用0.22um的滤器过滤除菌，装入高压过的盐水瓶中, 4℃保存(1个月内用完)。
——MEF培养液取100ml上述配好的低糖DMEM液体，加入10000IU青霉素钠（6.25mg）和10mg链霉素，溶解后再次调节PH至7.3，经0.22um的滤器过滤至高压过的血清瓶中，再添加10ml分装好的新生牛血清（Newborn Calf Serum, GIBCO/BRL,需56℃，30min灭活过），4℃保存至使用。
(2)PBS在500ml超纯水中依次溶入NaCl 4.0gKCl 0.1gNa2HPO4.12HO2 1.445gKH2PO40.1g于121℃高压灭菌30min或经0.22um的滤器过滤除菌再分装入100ml洁净灭菌的盐水瓶中，再放入4℃冰箱中保存备用。
MEF培养
MEF培养方法材料：胰酶；无菌PBS；DMEO(高糖，冰箱储存)10%；FBS（胎牛血清,，-20℃储存）90%；L-谷氨酸盐（200mM；部分-20℃储存），溶解后仅能用10天；P100和P60组织培养皿；解剖器械：剪刀、手术钳、外科手术刀（高压灭菌）；75%乙醇；95%乙醇；种鼠原代MEF分离：颈部脱臼处死怀孕母鼠，喷洒75%乙醇消毒；用手术钳和剪刀解剖取出子宫，不要让其接触无灭菌的区域；剪去子宫颈和血管，将子宫放入无菌PBS培养皿，将每个胚胎分开；把一个胚胎放入无菌PBS培养皿；用手术钳把胚胎从子宫切口剥离出来，移去薄膜和脐带，用无菌PBS洗去胚胎上的血细胞；把胚胎移入无菌PBS的新培养皿，用外科手术刀移去肝脾和肠（红色造血组织），剪去头部。
（保留CNS或肝脏组织于1.5ml管内做DNA提取和基因型测定）把胚胎移入EP管，用眼科剪把胚胎剪碎。
每个胚胎加1-2ml胰酶，放入摇床37℃,15min。
之后用10ml移液管吸取上清液至15ml离心管中。
加5ml培养液，1000rpm，5min，吸去上清液，再加5ml培养液离心。
每10cm培养皿培养一个胚胎，加10ml培养液。
第二天换液。
做下个胚胎之前，用无菌水清洗手术器械，然后95%乙醇清洗，空气干燥。
传代：用PBS反复洗细胞两三次，加胰酶1~2ml，待细胞分离后加2倍的培养基中和离心，去上清，加培养基吹打，加入培养皿。
冻存：用PBS反复洗细胞两三次，加胰酶1~2ml，待细胞分离后加2倍的培养基中和离心，去上清，加1.8ml胎牛血清（FBS），再加0.2mlDMSO，混合吹打，吸取2ml分别加入2根冻存管中-80℃冻存，6~8h后移入液氮罐。
MEF培养
MEF培养方法材料：胰酶；无菌PBS；DMEO(高糖，冰箱储存)10%；FBS（胎牛血清,，-20℃储存）90%；L-谷氨酸盐（200mM；部分-20℃储存），溶解后仅能用10天；P100和P60组织培养皿；解剖器械：剪刀、手术钳、外科手术刀（高压灭菌）；75%乙醇；95%乙醇；种鼠原代MEF分离：颈部脱臼处死怀孕母鼠，喷洒75%乙醇消毒；用手术钳和剪刀解剖取出子宫，不要让其接触无灭菌的区域；剪去子宫颈和血管，将子宫放入无菌PBS培养皿，将每个胚胎分开；把一个胚胎放入无菌PBS培养皿；用手术钳把胚胎从子宫切口剥离出来，移去薄膜和脐带，用无菌PBS洗去胚胎上的血细胞；把胚胎移入无菌PBS的新培养皿，用外科手术刀移去肝脾和肠（红色造血组织），剪去头部。
（保留CNS或肝脏组织于1.5ml管内做DNA提取和基因型测定）把胚胎移入EP管，用眼科剪把胚胎剪碎。
每个胚胎加1-2ml胰酶，放入摇床37℃,15min。
之后用10ml移液管吸取上清液至15ml离心管中。
加5ml培养液，1000rpm，5min，吸去上清液，再加5ml培养液离心。
每10cm培养皿培养一个胚胎，加10ml培养液。
第二天换液。
做下个胚胎之前，用无菌水清洗手术器械，然后95%乙醇清洗，空气干燥。
传代：用PBS反复洗细胞两三次，加胰酶1~2ml，待细胞分离后加2倍的培养基中和离心，去上清，加培养基吹打，加入培养皿。
冻存：用PBS反复洗细胞两三次，加胰酶1~2ml，待细胞分离后加2倍的培养基中和离心，去上清，加1.8ml胎牛血清（FBS），再加0.2mlDMSO，混合吹打，吸取2ml分别加入2根冻存管中-80℃冻存，6~8h后移入液氮罐。
《2024年p400在小鼠植入前胚胎及胚胎成纤维细胞中的功能初探》范文
《p400在小鼠植入前胚胎及胚胎成纤维细胞中的功能初探》篇一一、引言近年来，细胞生物学与分子生物学领域的研究取得了长足的进步，尤其是在干细胞和胚胎发育过程中相关基因与蛋白质的功能研究方面。
P400作为一种新近发现的蛋白质，其在细胞内的作用机制和功能尚不完全明确。
为了更深入地了解P400的功能，本实验旨在初步探讨P400在小鼠植入前胚胎及胚胎成纤维细胞中的功能。
二、材料与方法1. 材料本实验所需的小鼠植入前胚胎及胚胎成纤维细胞均来自于特定的实验小鼠模型。
P400基因敲除小鼠作为对照。
此外，还需要细胞培养试剂、P400抗体等。
2. 方法（1）细胞培养：在体外培养小鼠植入前胚胎及胚胎成纤维细胞，以供后续实验使用。
（2）RNA干扰与过表达：通过RNA干扰技术，在胚胎及成纤维细胞中敲低P400的表达；同时，通过基因过表达技术，增加P400的表达水平。
（3）Western Blot检测：运用Western Blot技术检测各组细胞中P400的表达水平，分析P400的表达变化对细胞的影响。
（4）功能分析：通过观察各组细胞的生长、增殖、分化等指标，初步探讨P400在小鼠植入前胚胎及胚胎成纤维细胞中的功能。
三、实验结果1. P400在小鼠植入前胚胎及成纤维细胞中的表达情况通过Western Blot检测发现，P400在小鼠植入前胚胎及成纤维细胞中均有表达，且表达水平在不同类型的细胞中存在差异。
2. P400对小鼠植入前胚胎发育的影响在RNA干扰实验中，当P400的表达被敲低时，小鼠植入前胚胎的发育受到了一定程度的抑制，表现为胚胎发育速度减慢、发育异常等现象。
相反，在过表达P400的实验组中，胚胎发育速度加快，且发育质量得到改善。
这表明P400在促进小鼠植入前胚胎发育中具有重要作用。
3. P400对小鼠成纤维细胞的影响在成纤维细胞中，敲低P400的表达后，细胞的增殖速度减慢，分化能力减弱；而过表达P400的成纤维细胞则表现出更强的增殖能力和分化潜力。
《R6-feeder在胚胎干细胞建系中的应用》范文
《R6-feeder在胚胎干细胞建系中的应用》篇一一、引言胚胎干细胞（ESC）研究在再生医学、疾病模型和基础生物学领域具有重要意义。
为了成功建立和维护胚胎干细胞系，一个适宜的生长环境是必不可少的。
近年来，R6-feeder作为一种新兴的细胞培养支持物，在胚胎干细胞建系中得到了广泛的应用。
本文将探讨R6-feeder在胚胎干细胞建系中的应用及其优势。
二、R6-feeder简介R6-feeder是一种特殊的细胞培养支持物，主要由小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）经过特定处理后制成。
它为胚胎干细胞提供了一个类似胚胎发育初期的生长环境，有助于胚胎干细胞的增殖和分化。
三、R6-feeder在胚胎干细胞建系中的应用1. 提供生长因子：R6-feeder能分泌多种生长因子，如IGF-1、EGF等，这些生长因子有助于胚胎干细胞的增殖和分化。
2. 维持未分化状态：R6-feeder为胚胎干细胞提供了一个类似胚胎发育初期的环境，有助于维持胚胎干细胞的未分化状态。
3. 促进克隆形成：R6-feeder支持胚胎干细胞的克隆形成，使得胚胎干细胞在培养过程中更容易形成紧密的克隆。
4. 降低异种污染风险：相比其他细胞支持物，R6-feeder的来源较为明确，可降低异种污染的风险。
四、R6-feeder的优势1. 兼容性：R6-feeder与多种不同来源的胚胎干细胞具有良好的兼容性，适用于多种实验室的需求。
2. 高效性：R6-feeder支持下的胚胎干细胞建系过程更为高效，可缩短建系周期。
3. 稳定性：R6-feeder在多次传代后仍能保持其生物学特性，有利于胚胎干细胞的长期培养。
4. 安全性：R6-feeder来源明确，可降低异种污染和疾病传播的风险。
五、结论R6-feeder作为一种新兴的细胞培养支持物，在胚胎干细胞建系中发挥了重要作用。
它为胚胎干细胞提供了一个适宜的生长环境，有助于胚胎干细胞的增殖和分化。
同时，R6-feeder具有兼容性好、高效性、稳定性和安全性等优势，为胚胎干细胞的建系和维护提供了有力支持。
mef培养个人总结范文
mef培养个人总结范文MEF及饲养层的制备(实验记录)（8）加入2~4ml0.25%胰蛋白酶，培养箱中消化10—15min，消化结束后加入等体积（多加点也行，只要不是少加，保证彻底的终止消化反应）的MEFMedium终止消化反应，轻轻吹打，使细胞分散。
（做原代消化的时间稍长，胰酶用量也大，若是做传代，则只需加入500微升，最多1ml的胰酶，消化1~3min。
）（躯干组织不易消化，做原代和传代时，故都用0.25%胰蛋白酶；而脑组织较易消化（脑肿瘤组织），原代和传代都用0.05%胰蛋白酶。
）（消化可能不完全，也可室温静置5－10min，弃组织块，这样下面过滤就相对容易。
）（如果消化得到的细胞太少，可以离心弃上清，洗涤，PBS重新加胰酶消化）（胰蛋白酶，Trypin,最适条件pH8.0，37度，溶液中钙镁离子和血清会降低其活力，故消化用的胰蛋白酶中加入了EDTA。
消化结束时加入含血清的培养基即可终止反应）（9）将收集的细胞悬液离心，1500rpm，4min，弃上清，加入红细胞裂解液（3~5倍体积的细胞体积），轻轻吹打1min，离心除上清，若仍有红细胞残留，则须继续进行红细胞裂解步骤。
（10）离心，弃上清，重悬细胞，过滤（200目筛网）并收集滤液，离心除去上清。
（11）用MEFMedium洗涤沉淀，离心除上清，重悬细胞，铺板即可。
置于37度5%CO2饱和湿度培养箱中培养。
（一只老鼠会有多个胚胎，得到的单细胞，可铺到三个培养皿中或者更多的培养皿中进行培养）（12）第二天换液，随后每2天换液一次。
培养2～4d后，MEF接近汇合，即可按1:3比例传代培养。
'u3Z9u6w6Ew-q要点:无菌是操作关键,动物皮毛不能直接或间接接触到子宫,分离子宫时必须换用另一套无菌的眼科剪和眼科镊。
要点:仔细观察原代细胞有无被杂菌污染的迹象,并且检测支原体,确定无污染后传代扩增。
2V)G5o.f%D某Y7v,_2.MEF传代（本步骤已经进行实践）（1）消化：吸去培养皿中的MEFMedium，用PBS洗涤1次(加5ml)后，加入1ml0.25%Trypin/EDTA37度消化1min（时间可以浮动，视消化效果定，在显微镜下观察,当少量细胞漂浮,贴壁的细胞层出现裂隙时，即可终止反应）。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
小鼠胚胎成纤维细胞MEF培养相关知识总结2009-08-19 18:39:07 来源:未知【大中小】评论: 条摘要：小鼠胚胎成纤维细胞的富集1、给13-14天的孕鼠注射大约0.5ml阿佛小鼠胚胎成纤维细胞的富集1、给13-14天的孕鼠注射大约0.5ml阿佛丁。
当鼠麻醉后，实施断颈法处死小鼠。
2、用70％乙醇擦拭腹部，把皮肤向后拉，暴露出腹膜。
用消毒过的工具，剪开腹壁以暴露出子宫角。
将子宫角移到10cm的皿里。
用10ml不含钙镁离子的PBS洗三遍。
3、用剪刀剪开每一测的胚囊,并将胚胎移到培养皿中。
4、用两副钟表镊子将胎盘和膜与胚胎分离开，分离后切除内脏（所有深色的东西）。
将胚胎转移到(有盖)培养皿中，用10ml不含钙镁离子的PBS洗三遍。
5、用带有弯钩的眼科剪将组织剪碎，当你剪的很累以致于不能再剪的时候，加入2ml 胰蛋白酶/EDTA继续剪。
再加入另外5ml胰蛋白酶/EDTA，并在37℃孵育大约20分钟。
此时，返回至第一步，对下一只鼠进行操作。
6、执行1－4步，到将胚胎置于胰蛋白酶/EDTA中这一步。
7、吹打胰蛋白酶/EDTA中的胚胎，直到有很少的组织物残留。
将皿放回培养箱再孵育10分钟。
8、用20ml培养基以终止胰蛋白酶/EDTA的消化，将皿中的物质转移至50ml锥形管中。
9、混匀管内的物质，加入到含有20ml培养基的T75培养瓶中。
每个培养瓶中装大约3个胚胎。
10、将这些培养瓶放在培养箱中37℃培养过夜。
11、将胚胎置于PBS中，并重复第5步。
12、第二天更换培养基，以去除碎片和中毒的细胞及其分泌的物质。
13、当培养瓶中的细胞长到80-90%汇合时并仍处于指数生长期时，是冻存细胞的最佳时期。
一般说来，这发生在准备胚胎的第二天。
这可能或早或晚发生，所以请注意观察你的培养瓶。
注释：我们已用CF－1品系的鼠制备了成纤维细胞。
培养基成分：88％DMEM10％FBS1％NEAA1% 双抗对于新建立的细胞系，要对样本进行支原体检测。
小鼠胚胎成纤维细胞的消化/传代1、移去MEF培养基2、用5ml不含钙镁离子的PBS洗涤细胞（以去除胰蛋白酶的抑制物）。
3、每个培养瓶里加入1.5ml的胰蛋白酶/EDTA（0.05%的胰蛋白酶），消化5min。
4、为了使细胞分散开，轻轻吹打细胞。
5、每加入1ml的胰蛋白酶/EDTA，加入至少1ml的MEF培养基以终止胰蛋白酶的消化。
6、将细胞悬液加入到15ml的锥形管中，吹打几次，使细胞分散为单个的。
7、在新的T75培养瓶中加入10mlMEF培养基。
8、将细胞悬液分装到新的T75培养瓶中，放在37℃培养箱中进行培养。
注释：MEF培养基成分：89% DMEM (Gibco # 12100-046)10% FBS (Gibco # 16000-044)1% NEAA (Gibco # 11140-050)MEF每传一代就会生长得更慢些。
你第一次传代的比例可以是1:5，但是最后一次的传代（第4代或第5代）比例应该是1:2。
小鼠胚胎成纤维细胞的冻存重悬培养基：80% DMEM20% FBS1% NEAA冻存培养基：60％DMEM30％FBS20％DMSO1、用不含钙镁离子的PBS洗一次细胞。
2、加入胰蛋白酶/EDTA37℃消化大约5min。
3、将细胞吹打下来。
4、加入与胰蛋白酶/EDTA等体积的培养基以终止胰蛋白酶的消化。
5、吹散大块组织。
如果还有大块组织存在，可将悬液加入到50ml的管中使其沉淀。
6、取上清液，将其分装到锥形管中，1000rpm离心5min。
7、每个冻存瓶中加入0.5ml（冻存液的一半体积）的重悬培养基重悬细胞。
8、逐滴加入等体积的（0.5ml/瓶）冻存培养基，混匀。
现在DMSO的浓度是10％。
9、每个冻存瓶中加入1ml的细胞。
10、迅速将细胞转移到冻存的容器中，-70℃冻存过夜。
（细胞不能长时间放置在室温而含有DMSO的情况下）11、第二天将细胞放于液氮中长期保存。
注释：提前标注好冻存细胞的以下信息：细胞系名称传代的代数冻存细胞的数目日期Initials注明冻存/解冻形式小鼠胚胎成纤维细胞的解冻/复苏1、将冻存瓶从液氮中取出。
2、放在37℃水浴中快速解冻，being careful not to immerse the vial above the level of the cap.3、当仅还有一点冰晶残留时，用95％的乙醇消毒冻存瓶的外面，并将其置于hood中。
（为什么用95％的乙醇消毒？hood是什么？）4、轻轻地上下翻转细胞一次，将它们放入15ml锥形管中。
5、想管中逐滴加入10ml培养基。
这一步操作不能少于两分钟。
做快了对细胞将是一种打击，你将得到比其他方法具有更低生活能力的细胞。
6、1000rpm离心5min。
7、将细胞重悬于10ml培养基中，然后放入T75培养瓶中。
8、放入37℃培养箱。
9、注明冻存/解冻的形式，以更新数据。
网友观点是：1、关于如何确底胚胎期12.5d~13d的小鼠？希望大家能够介绍一下自己所采用的方法，集思广益。
我所采用的方法是选择同一天出生的三对小鼠，到成熟（8~10 w）后，分三周合笼，（每周合笼一对），然后待最早合笼的小鼠产崽后，再取另两个雌鼠的胚胎。
不知道这样行不行，也没注意别人是怎样做的。
另外问了几个外科的同学也没找到可以查出小鼠孕期的仪器。
2、关于提取MEF的比较好的protocol3、关于MEF转染时起耐受性如何？这个我以后主要做这些，可能会积累一定的经验，但现在肯定有各位朋友已经从事或正在从事着方面的工作，希望能够分享经验。
4、关于其分泌细胞因子能力？我从一些文献上发现，MEF除了作为胚胎干细胞的饲养层以外，也是研究天然免疫的重要材料，如日本东京大学的AKIRA的实验室，大板大学的takashi fujita实验室就发了相当多的文章。
从这些文献可以看出，MEF分泌细胞因子能力远远强于HEK293等工程细胞，相当于肝实质细胞，略低于几种免疫细胞。
但较免疫细胞，我认为有其不可替代的优势：（1）其并不是主要发挥免疫功能的细胞，只有在受到外界刺激时才会应答，分泌细胞因子，免疫细胞在不受刺激时也会为了维持稳态而不断产生细胞因子，即使有严格的control 组，但专门的免疫细胞即使是同一种细胞（DC，NK，T）但不同的细胞分泌细胞因子的能力也是参差不齐的。
会造成control 相对不一致。
（2）另一方面，由于这些免疫细胞大部分都是悬浮的，不太容易转染，结果阳性率也会较低。
（3）现在的分离MEF的方法很便宜，不复杂，而分离纯的免疫细胞（如NK，DC），需要MACS，FACS等，这对目前国内的实验室经费相对紧张的情况来说，不是很划算。
因此除非是需要研究某一种免疫细胞，如果是为了研究天然免疫或者adaptive immune过程中某中基因，或者蛋白，或者某一信号通路等的作用，MEF 细胞不失为一种选择。
网友观点：1、我每次取的是16~18天的胚鼠个人觉得无碍我倒更喜欢大一点的胚胎更好操作一点2、我取的是皮肤然后胰酶4度消化过夜第二天终止消化撕掉表皮留下真皮减碎用的100目滤网过滤这个胰酶消化的时间是个关键时间长了细胞容易死时间少了，表皮不容易揭下来我有此就是这样消化了15个小时结果接种下来的细胞不能贴壁全死了3、我用的培养液是DMEM+10%小牛血清培养液也是关键因为虽然都是成纤维细胞比较泼辣但总归是原代可能还是比较娇嫩我前几天就是这样后来发现是培养液出的问题测的PH值都8.3了细胞不死才怪毕竟细胞耐酸不耐碱4、原代培养的最大天敌还是污染网友观点：MEF对培养基和血清的要求不高，一般的都行我用过高糖DMEM和D/F-12，生长情况都行，而且看不出什么差别。
血清也是以前用几百块钱的国产标准胎牛血清也长得也不错，因为要养干细胞，所以现在换成进口Gibco胎牛的血清（两千多/500ml），感觉细胞的状态确实好了一些。
我的血清浓度一般是16.66666%。
网友观点：细胞没别的，就是很容易老化，一般我都是1:5~1:3传代，3代之后细胞就出现衰老了，我感觉年轻增殖能力强的MEF应该有着清晰的细胞轮廓，细胞立体效果不错，在相差显微镜下，细胞核清晰，细胞纤长，正在分裂或是刚刚分裂的细胞没有伸出伪足，但是同样有着更加明亮的轮廓，与细胞边缘相比，细胞呈深色（我觉得是透光效果不好）。
一般在4×下观察最能看出细胞的状态，此时能看到细胞呈梭形或是三角形。
细胞铺展很厉害，细胞的透光效果增加，说明开始衰老。
衰老的MEF最好不要做feeder,但是也不是完全不好。
但是要是做转染或是感染的话，出现衰老的MEF就不行了。
所以一般就是3代以内做。
我们用的就是WiCell的protocal养，和前面那位战友发的差不多。
只是我们用1mg/ml Collengase IV消化40min，用什么酶不重要，我觉得最重要的就是种盘后的换液。
原代2小时不管还有多少米贴都不要，传代复苏后一小时就换。
消化的时候也是要舍得，0.05%Trypsin-EDTA(GIBCO)，5min消化不下来的也统统不要。
因为健康的MEF就是易消化易贴壁。
老化以及混杂的其他细胞（神经、上皮）就没那么快了。
附带一句，易消化易贴壁是fibroblast的共性。