噬菌体展示肽库英文说明书Ph.D.-12 Manual

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试剂盒组成：
（如无特殊说明，试剂盒中所有成分均需-20℃保存） ：
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1. 接种 ER2738 单菌落于 5-10 ml LB 培养基中，摇床培养至对数中期（OD600 ~0.5） 。 2. 细胞生长时，微波炉融化上层琼脂，分成 3 ml 等份于灭菌试管中，每个噬菌体稀释度一 管。保存于 45℃备用。 3. 37℃预温 LB/IPTG/Xgal 平板，每个噬菌体稀释度取一个平板备用。 4. 在 LB 中准备 10 倍系列稀释的噬菌体。 建议稀释范围：扩增的噬菌体培养物上清：108-1011；未扩增的淘选洗脱物：101-104。每 个稀释度换一新鲜吸头，建议使用带滤芯吸头以避免交叉污染。 5. 当菌体培养物达对数中期，分成 200 µl 等份于微量离心管中，每个噬菌体稀释度一管。 6. 每管加入 10 µl 不同稀释度的噬菌体，快速震荡混匀，室温温育 1-5 min。 7. 将感染细胞加入 45℃预温的上层琼脂培养管中，每次一管，快速混匀，立即倾注于 37 ℃预温的 LB/IPTG/Xgal 平板上。适当倾斜平板将上层琼脂均匀铺开。 8. 待平板冷却 5 min 后，倒置于 37℃培养过夜。 9. 检查平板，计数有~102 个噬菌斑的平板上的斑数。然后用此数目乘以稀释因子即得到每 10 µl 噬菌体的空斑形成单位（pfu）滴度。
避光贮存。
常规 M13 方法：
M13 不是一个裂解性噬菌体，噬菌斑的形成不是由于菌体裂解而是由于细胞生长力减弱所
致，因此其噬菌斑是浑浊的而不是清亮的。
菌株保存 1. 本试剂盒提供的宿主菌是一个强 F+菌株，生长迅速，特别适合于 M13 噬菌体的增殖。 尽管 ER2738 是一个 recA+菌株，但我们在使用 M13 或噬菌粒载体的过程中从未发现有 体内重组现象发生。其他 F+的商品菌株如：DH5αF’和 XL1-Blue 或许可以代替 ER2738 应用,但未曾用本系统检验过。 2. 由于 M13 是一个雄性特异性大肠杆菌噬菌体，建议用于 M13 增殖的所有菌液都是从 F 因子正向选择培养基上挑菌接种的，而不是直接从本试剂盒提供的甘油菌接种培养的。 ER2738 的 F 因子上含有一个小转座子，赋予该细胞四环素抗性，因此可以在含四环素 的平板上铺板筛选含 F 因子的细胞。 3. 从随产品提供的 ER2738 甘油菌划线接种 LB-Tet 平板，倒置平板 37℃培养过夜。用封 口膜封闭平板后 4℃避光保存，最长可达一个月。 4. 用于感染噬菌体的 ER2738 菌液既可以在 LB 也可以在 LB-Tet 培养基中生长。只要不对 培养物进行连续稀释，在非选择性培养基中 F 因子的丢失并不严重。 避免噬菌体污染 M13 噬菌体的衣壳蛋白 pIII 通过与受体菌的 F 性纤毛相结合而介导感染。与野生型噬菌体 相比，外源蛋白或多肽融合在 pIII 蛋白的 N 端展示明显降低了文库噬菌体的感染力。因此，
图 1 用噬菌体展示肽库进行淘选
图2 用Ph.D.-12肽库测定抗原决定簇。 用抗-内啡肽单克隆抗体对Ph.D.-12展示肽文库进行 液相淘选，然后用Protein A-琼脂糖（第1和第3轮淘选）或Protein G-琼脂糖(第2轮淘选)亲和 捕获抗体-噬菌体复合物。每轮淘选所选到的结合序列与-内啡肽的前12个氨基酸残基序列 比较列于上图内， 共有序列元件用方框示出。 结果清楚地显示该抗体的抗原决定簇序列落在 -内啡肽的前四个氨基酸残基（YGGF）处，在第三位有一定的可变性。第三轮筛有一个筛 选到的克隆无插入子。
培养基和溶液：
LB 培养基： 每升含：10 g Bacto-Tryptone，5 g yeast extract, 5 g NaCl。高压灭菌，室温贮存。 LB/IPTG/Xgal 平板： LB 培养基 + 15 g/L 琼脂粉。高压灭菌，冷却至低于 70℃时，加入 1 ml IPTG/Xgal*，混 匀倒平板。平板 4℃避光贮存。 顶层琼脂： 每升含：10 g Bacto-Tryptone，5 g yeast extract, 5 g NaCl, 1 g MgCl2·6H2O, 7 g 琼脂粉。 高压灭菌，分成 50 ml 等份。固体培养基室温贮存，用时微波炉融化。 四环素贮液：以 20 mg/ml 的浓度溶于乙醇中。-20℃避光贮存。用前摇匀。 LB-Tet 平板：LB 培养基 + 15 g/L 琼脂粉。高压灭菌，冷却至低于 70℃时，加入 1 ml 四环 素贮液，混匀倒平板。平板 4℃避光贮存，如果平板显棕色或黑色请勿用。 封阻缓冲液：0.1 M NaHCO3 (pH 8.6), 5 mg/ml BSA, 0.02% NaN3。过滤除菌，4℃贮存。 TBS: 50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 150 mM NaCl。高压灭菌，室温贮存。 PEG/NaCl: 20% (w/v) PEG-8000, 2.5 M NaCl。高压灭菌，室温贮存。 碘化物缓冲液： 10 mM Tris-HCl (pH 8.0), 1 mM EDTA, 4 M NaI。室温避光贮存。 链霉亲和素贮液： 将 1.5 mg 链霉亲和素冻干粉（本试剂盒提供）溶于 1 ml 10 mM 磷酸钠(pH7.2)、100 mM NaCl、0.02% NaN3 溶液中。4℃或-20℃贮存，避免反复冻融。 *IPTG/Xgal 配 方 ： 将 1.25 g IPTG (isopropyl β–D-thiogalactoside) 和 1 g Xgal(5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactoside)溶于 25 ml 二甲基甲酰胺中。溶液-20℃
概述： 噬菌体展示是一项选择技术， 它将外源多肽或蛋白与噬菌体的一种衣壳蛋白融合表达， 融合 蛋白将展示在病毒颗粒的表面，而编码这个融合子的 DNA 则位于该病毒粒子内。噬菌体展 示技术使大量随机多肽与其 DNA 编码序列之间建立了直接联系，使得各种靶分子（抗体、 酶、细胞表面受体等）的多肽配体通过一种被称为淘选（panning）的体外选择程序得以快 速鉴定。最简单的淘选程序，是将噬菌体展示肽库与包被有目的靶分子的平板（或磁珠）共 温育，先洗去未结合噬菌体，然后洗脱特异性结合的噬菌体（见图 1） 。被洗脱的噬菌体进 行扩增，然后再进行下一轮的结合/扩增循环，以富集那些可结合序列。经 3-4 轮淘选后， 通过 DNA 测序对每个可结合克隆进行定性。 展示在噬菌体表面的随机肽库可应用于许多方面(3)，包括绘制抗原表位图谱(4-6)、研究蛋 白质-蛋白质相互作用（7）和鉴定非肽配体的肽模拟型（8-11。 ）生物活性肽分子的鉴定可 以通过对固定在平板上的纯化受体进行淘选（12）也可以在完整细胞上进行淘选（13-15） 。 蛋白酶底物的鉴定可通过在随机肽区域的上游加一段亲和 tag，然后选用特异性的介质来区 分切割和未切割的噬菌体（16） 。另外，大的蛋白质分子[如：抗体（17） 、激素（18） 、蛋白 酶抑制剂（19） 、酶（20）和结合蛋白（21）]也可展示在噬菌体上，通过对随机突变文库的 筛选，分离出各种具有亲和力或特异性改变的变异株。 Ph.D.-12 噬菌体展示肽库试剂盒将随机十二肽融合到 M13 噬菌体次要衣壳蛋白(pIII)上，因 而是一个组合文库。所展示的十二肽表达在 pIII 的 N 末端，即：成熟蛋白的第一个氨基酸 就是随机十二肽的第一个氨基酸, 十二肽后面是一段短小的间隔多肽，由 Gly-Gly-Gly-Ser 组成，然后是野生型 pIII 蛋白。该文库含有~2.7×109 个电转化序列，用 10 µl 本品提供的噬 菌体进行扩增，每个序列一次可产生~55 个拷贝，对原始文库进行大量测序（见附录）表明 该文库序列具有广泛的多样性，无明显的残基位置偏嗜。建议不要扩增原始文库来进行另 外的淘选试验，因为一旦再扩增便会出现序列偏嗜现象。 NEB 应用本品分别鉴定出了与链霉亲和素和单克隆抗体相结合的共有结合肽序列 （见图 2） 。 大量实验证明， 任何情况下该文库的复杂度都足以产生多个可编码相同肽基序的 DNA 序列。
当有任何野生型噬菌体污染时， 每轮淘选试验之间的扩增步骤会强烈倾向于扩增野生型噬菌 体， 如果同时没有一个强有力的体外噬菌体结合选择程序来避免， 即使痕量水平的污染也会 在三轮淘选后使淘选出的噬菌体多数为野生型。
1. 在本手册所述的所有步骤中均使用带滤芯吸头，可以使污染外界环境中噬菌体的可能性 大大降低。 2. 由于文库噬菌体源于常规克隆载体 M13mp19，其含有 lacZα 基因，当铺在含 IPTG 和 Xgal 的平板上时，噬菌斑将呈蓝色。而外界污染的丝状噬菌体在同样的平板上将呈白色 噬菌斑，同时这些噬菌斑还会比文库噬菌体的噬菌斑更大更模糊。因此所有的滴度检测 步骤，建议一定要在 LB/IPTG/Xgal 培养基上铺板，如果有白色噬菌斑，则只挑取蓝色 噬菌斑进行测序。
应用噬菌体表面展示肽库快速筛选肽配体
目 录：
简介 ………………………………………………………………………………………………2 培养基和溶液 ……………………………………………………………………………………5 常规 M13 方法 …………………………………………………………………………………..6 淘选程序（固定靶分子）………………………………………………………………………..8 结合克隆的特征…………………………………………………………………………………..12 其他淘选方法 （液相结合法） ……………………………………………………………………..15 其他抗原表位作图方法 （Protein A/G 捕获法） …………………………………………………..16 附录：优化肽结合相互作用……………………………………………………………………..19 文库的氨基酸分布………………………………………………………………………………..21
Ph.D.-12TM Phage Display Peptide Library Kit
应用噬菌体表面展示肽库 快速筛选肽配体
使
用
手 册
含 tet 选择性 F 因子的新大肠杆菌宿主菌： 不再需要 minimal 平板
目录号：#E8110SC 贮存于：-20℃
பைடு நூலகம்
版本：2.7 1/9/02
Ph.D.-12TM Phage Display Peptide Library Kit
测定噬菌体滴度
只有当噬菌体的感染复度 MOI (multiplicity of infection)值远低于 1 时（即细胞过量时） ，噬菌 斑的数量才会随着加入噬菌体的量而呈线性增加。 正因如此， 建议检测噬菌体贮液的滴度时， 在感染前进行稀释，而不是在高 MOI 值的情况下稀释被感染的细胞。低 MOI 值有助于确保 每个噬菌斑仅含一个 DNA 序列。