实验二蛋白质的两性反应与等电点测定24页PPT
实验二蛋白质的等电点测定和沉淀反应(精)
现象
解释
5．乙醇引起的变性与沉淀
管号 1 2
3
操作 振荡混匀 加数滴盐酸 振荡混匀 醋酸中和 加数滴盐酸 振荡混匀 碳酸钠中和 加数滴盐酸
现象
解释
思考题
1.鸡蛋清为何可做铅、汞中毒的解素剂？ 2.氯化汞为何能做为杀菌剂？ 3.什么是蛋白质的等电点？ 4.在等电点时，蛋白质溶液为什么容易发生
沉淀 ？
• 本实验通过观察不同pH溶液中的溶解度以测 定酪蛋白的等电点。用醋酸与醋酸钠（醋酸 钠混合在酪蛋白溶液中）配制各种不同pH值 的缓冲液。向诸缓冲溶液中加入酪蛋白后， 沉淀出现最多的缓冲液的pH值即为酪蛋白的 等电点。
• 在水溶液中的蛋白质分子由于表面生成 水化层和双电层而成为稳定的亲水胶体 颗粒，在一定的理化因素影响下，蛋白 质颗粒可因失去电荷和脱水而沉淀。
此时蛋白质分子内部结构发生重大改变， 蛋白质常变性而沉淀，不再溶于原来溶剂 中。加热引起的蛋白质沉淀与凝固，蛋白 质与重金属离子或某些有机酸的反应都属 于此类。
蛋白质变性后，有时由于维持溶液 稳定的条件仍然存在（如电荷），并不 析出。因此变性蛋白质并不一定都表现 为沉淀，而沉淀的蛋白质也未必都已变 性。
蛋白质的沉淀反应可分为 两类。
可逆的沉淀反应
此时蛋白质分子的结构尚未发生显著变 化，除去引起沉淀的因素后，蛋白质的沉 淀仍能溶解于原来的溶剂中，并保持其天 然性质而不变性。如大多数蛋白质的盐析 作用或在低温下用乙醇（或丙酮）短时间 作用于蛋白质。提纯蛋白质时，常利用此 类反应。
不可逆沉淀反应
实验二、蛋白质 等电点测定及沉淀反应
一、实验目的
1、了解蛋白质的两性解离性质 2、学习测定蛋白质等电点的一种方法 3、加深对蛋白质胶体溶液稳定因素的认识。 4、了解沉淀蛋白质的几种方法及其实用意义。 5、了解蛋白质变性与沉淀的关系。
蛋白质的两性反应和等电点测定
蛋白质的两性反应和等电点测定一、实验目的1.熟悉蛋白质的沉淀反应、颜色反应和两性反应及其机理。
2.掌握蛋白质等电点的测定方法及其原理。
3.掌握蛋白质电荷的测定方法及其机理。
二、实验原理(一)蛋白质的沉淀反应原理蛋白质的水溶液是一种比较稳定的亲水胶体，这是因为蛋白质颗粒表面带有很多极性基团，如—NH3+，—COO-，—SH，—CONH2等和水有高度亲和性，当蛋白质与水相遇时，就很容易被蛋白质吸住，在蛋白质颗粒外面形成一层水膜(又称水化层)。
水膜的存在使蛋白颗粒相互隔开，颗粒之间不会碰撞而聚成大颗粒。
因此蛋白质在溶液中比较稳定而不会沉淀。
蛋白质能形成较稳定的亲水胶体的另一个原因，是因为蛋白质颗粒在非等电状态时带有相同电荷，使蛋白质颗粒之间相互排斥，保持一定距离，不致相互凝集沉淀。
蛋白质由于带有电荷和水膜，因此在水溶液中形成稳定的胶体。
当某些物理化学因素破坏了蛋白质的水膜或中和了蛋白质的电荷，则蛋白质胶体溶液就不稳定而出现沉淀现象。
蛋白质可因加入下列试剂而产生沉淀：1.加盐类如硫酸铵、硫酸钠、氯化钠等可以破坏蛋白质胶体周围的水膜，同时又中和了蛋白质分子的电荷，因此使蛋白质产生沉淀，这种加盐使蛋白质沉淀析出的现象称盐析。
盐析法是分离制备蛋白质的常用方法，不同蛋白质盐析时所需的盐浓度不同，因此调节盐浓度，可使混合蛋白质溶液中的几种蛋白质分段析出，这种方法叫做分段盐析。
但中性盐并不破坏蛋白质的分子结构和性质，因此，若除去或降低盐的浓度，蛋白质就会重新溶解。
2.加有机溶剂如酒精、丙酮等可使蛋白质产生沉淀，这是由于这些有机溶剂和水有较强的作用，破坏了蛋白质分子周围的水膜，因此发生沉淀作用。
若及时将蛋白质沉淀与丙酮或乙醇分离，蛋白质沉淀则可重新溶解于水中。
3.重金属盐如氯化汞、硝酸银、醋酸铅及三氯化铁等。
这是因为蛋白质在碱性溶液中带负离子，可与这些重金属的正离子作用而生成不易溶解的盐而沉淀。
4.某些酸类如苦味酸、单宁酸、三氯乙酸等能和蛋白质化合成不溶解的蛋白质盐而沉淀。
蛋白质分析鉴定精品课件
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2. 分析多肽链的氨基酸组成。
将多肽链用酸或酶完全水解，再用离子交换树脂 （或用高效液相色谱）将各种氨基酸分离开，测 定其含量并计算各种氨基酸组成的百分比。下图 表示蛋白质的水解产物通过Moor-Stein Dowex 50 离子交换柱层析的自动分析结果。
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双向电泳：
2-DE技术依然是大多数蛋白质组研究 中分离复杂蛋白质混合物的首选技 术。
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双向电泳分析中的样品制备
制备原则：
应使所有待分析的蛋白样品全部处于溶解状态 （包括多数疏水性蛋白），且制备方法应具有可 重现性。
防止样品在聚焦时发生蛋白的聚集和沉淀。
防止在样品制备过程中发生样品的抽提后化学修 饰（如酶性或化学性降解等）。
a 加入脱水剂除去水膜 b 使pH=pI c 加入电解质使质点表面失去同种电荷。
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五、蛋白质的变性作用
天然蛋白质受到理化因素的影响， 氢键、盐键等次级键维系的高级结构遭 到破坏，分子内部结构发生改变，致使 生物学 性质、理化性质改变的现象。
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物理因素： 加热、紫外线、X—射线、超声波
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双向电泳的分类
非变性2D-PAGE：两向均在非变性条件下 进行，这样分离的蛋白质点的等电点和表观 分子量同生理条件下获得的这些蛋白的值是 一样的
非变性/SDS-2D-PAGE：第一向采用非变性 IEF，之后在2%SDS溶液中平衡；第二向也 在SDS存在的条件下进行。适于分析非共价 键连接的蛋白－蛋白间的相互作用。
蛋白质的测定课件参考.ppt
4.NaOH 溶液
4.5.6 5.水洗漏 步操 斗数次 作要 6.夹好漏斗 迅速 夹，水封。
2.管下端 插入液面 下(瓶内先 装硼酸液 及混合指 示剂2滴)
7.水蒸气蒸馏至指示剂变绿色 开始计时，蒸馏10min，将管
8.吸收液用0.01000mol/L HCl标准溶液滴定至
总蛋白质含量 氨基酸组成 蛋白质的营养价值
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2
5、蛋白质的测定方法
利用蛋白质共性的方法
凯氏定氮法 杜马斯法
福林酚法
利用特定氨基酸残基法
染色法
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3
第二节 蛋白质的定性测定
一、蛋白质的一般显色反应
电泳或纸层析之后用一些染料与蛋白质结合并 变色。书中列举了 5 种染料。
二、复合蛋白质的显色反应
第一节 概述
1.蛋白质的元素组成（The elements of protein）
▪ C：50-55% N：15-18% O：20-23%
▪ H：6-8% S：0-4%
▪ 微量元素：P、Fe、Zn、Cu
2、基本结构单位：氨基酸
3、蛋白质的变性作用。
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1
4、蛋白质分析的重要性
▪ 生物活性测定 ▪ 功能性质调查 ▪ 营养标签
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操作方法
▪ 1、制作标准曲线 取10支干试管分成两组，按下表平行操作：
0ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
1
2
3
4
标准蛋白液/ml
0.2 0.4 0.6 0.8
蛋白浓度 /(mg/ml)
2.0 4.0 6.0 8.0
蒸馏水/ml
蛋白质的两性解离与等电点测定
7.4
—
—
1.6
（2）向以上各试管中加酪蛋白醋酸钠溶液 1mL，加一管，摇匀一管，此时1、2、3、 4管的pH值依次为5.9、5.3、4.7、3.5，观 察其混浊度。
5、实验结果
静置10min后，再观察其混浊度，最混浊的 一管的pH即为酪蛋白的等电点。
实验三 蛋白质的两性解离 和等电点测定
一、实验目的
了解蛋白质的两性解离性质。 学习测定蛋白质等电点的一种方
法。
2、实验原理
蛋白质由许多氨基酸组成，虽然绝大多数氨基与羧基成肽 键结合，但是总有一定数量自由氨基与羧基，以及酚基、 巯基、胍基、咪唑基等酸碱基团，因此蛋白质和氨基酸一 样是两性电解质。
蛋白质溶液的p膨胀性及导电能力均最小，胶体溶液 呈最不稳定状态。
凡碱性氨基酸含量较多的蛋白质，等电点往往偏碱， 如组蛋白和精蛋白。反之，含酸性氨基酸较多的蛋 白质如酪蛋白、胃蛋白酶等，其等电点往往偏酸。
不同蛋白质各有其特异的等电点。在等电点时，蛋 白质的理化性质都有变化，可利用此种性质的变化 测定各种蛋白质等电点。最常用的方法是测其溶解 度最低时的溶液pH值。
本实验借观察在不同pH溶液中的溶解度 以测定酪蛋白的等电点。
用醋酸与醋酸钠（醋酸钠混合在酪蛋白 溶液中）配制成各种不同pH值的缓冲液，向 诸缓冲溶液中加入酪蛋白，沉淀出现最多的缓 冲液的pH值即为酪蛋白的等电点。
3、实验材料
水浴锅、温度计、200mL锥形瓶、100mL 容量瓶、乳钵（准备实验用具） 吸管、试管、试管架 0.4%酪蛋白醋酸钠溶液 1.0mol/L醋酸 0.1mol/L醋酸 0.01mol/L醋酸溶液
调节溶液的酸碱度达到一定的氢离子浓度时，蛋白质分子 所带的正电荷和负电荷相等，以兼性离子状态存在，在电 场内该蛋白质分子既不向阴极移动，也不向阳极移动，这 时溶液的pH值，称为该蛋白质的等电点（pI）。当溶液 pH低于蛋白质等电点时，即在H+较多的条件下，蛋白质 分子带正电荷成为阳离子；当溶液pH大于等电点时，即在 OH—较多的条件下，蛋白质分子带负电荷，成为阴离子。
蛋白质的理化性质课件参考.ppt
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4
练习
• 下列哪种蛋白质在pH5.0的溶液 中带负电荷？
• A．pI为5.5的蛋白质 B．pI为4.0的蛋白质 C．pI为7.0的蛋白质 D．pI为5.0的蛋白质
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5
体内大多数蛋白质的等电点在pH5.0 左右，
因而在生理条件下以阴离子形式存在 。
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6
3.电泳
定义： 带电粒子在电场中向电性相反的电极移动的现象。
若蛋白质变性程度较轻，去除变性因素，有些
可恢复其天然构象和生物活性,称为蛋白质的复性。
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核糖核酸酶的变性与复性示意图
8M尿素或 β-巯基乙醇
透析
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（五）、变性与复性
过核 程糖
核 酸 酶 的 变 性
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蛋白质沉淀
概念 蛋白质从溶液中析出的现象称为沉淀。
方法 盐析法、有机溶剂的沉淀、重金属盐沉淀、
蛋白质在带电场中泳动的速度和方向与其所 带电荷的性质、数量及分子的大小、形状有关。
带电荷多，分子小的泳动速度较快；反之则泳动 较慢，从而达到分离蛋白质的目的。
血清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳可将血清蛋白
分为清蛋白、α1球蛋白、α2球蛋白、β球蛋白
、γ球蛋白。
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7
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8
A：染色后显示的蛋白质区带 B：光密度扫描定量分析
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9
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10
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11
正常
肝硬化
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12
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二、蛋白质的胶体性 质
1.蛋白质有胶体性质
蛋白质是生物大分子，分子量在1万～10万 kD（千道尔顿）之间，分子直径在胶体颗粒 的范围（1—100nm）
生物化学实验课件
通过转氨基作用形成的氨基酸可通过展层层析检测。氨基酸的纸层析属 于分配层析，滤纸为支持介质，滤纸上所吸附的水为固定相，有机溶剂
为流动相。把混合氨基酸样品点于滤纸上，使流动相经样品点移动，混 合氨基酸在两相溶剂间进行分配，在固定相中分配比例较大的氨基酸， 随流动相移动的速度慢；在流动相中分配比例较大的氨基酸，随流动相 移动的速度快。由于各种氨基酸的分配系数不同，在一定时间内，逐渐 集中于滤纸上不同的部位，而彼此分离。层析完毕后显色，使氨基酸显 色形成斑点。
18
3.仪器、试剂和材料 4. 操作步骤
具体参见实验指导书
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5. 结果处理
根据所测样品提取液吸光值，在标准曲线上查得 相应的蛋白质含量（μg），按下式计算：
样品蛋白 (g质 /鲜 g含 )重 查 样 量得 品(的 鲜 g)测 蛋 重( 定 白 g )提 时 质取 取 含液 用 量((m 总 提 m )ll体 取 ) 积 液
6. 注意事项
比色应在出现蓝色后2min~1h内完成。
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7. 思考题
1）考马斯亮蓝G-250法测定蛋白质含量的 原理是什么？
2）如何正确使用分光光度计？
3）测定蛋白质含量还有哪些方法，测定原理 有哪些不同？
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酶的基本性质
1.目的 酶是生物催化剂，是具有催化功能的蛋白质，
生物体内的化学反应基本上都是在酶催化下 进行的。通过本实验了解酶催化的高效性、 特异性以及pH、温度、抑制剂和激活剂对 酶力的影响，对于进一步掌握代谢反应及其 调控机理具有十分重要的意义。
5
2.1氨基酸的两性解离和等电点
2.1.1 氨基酸的两性解离
H 3 N + C RC HO K 1H O ' 3 N + C R H C H-O K 2H ' 2 O N C RC H-O
蛋白质两性性质及等电点的测定
蛋白质两性性质及等电点的测定蛋白质是生物体中极其重要的有机化合物，是构成生物体的基本组成部分之一。
蛋白质具有很多种类和功能，不同的蛋白质在生物体内发挥着不同的作用。
蛋白质的性质也因其结构而异，其中包括两性性质和等电点。
本文将介绍蛋白质的两性性质及等电点的测定。
一、蛋白质的两性性质蛋白质是由多肽链组成的，其分子中含有氨基酸残基。
这些氨基酸残基中的羧基（-COOH）和氨基（-NH2）可以参与酸碱反应，所以蛋白质具有两性性质，能够在不同的pH值下呈现不同的电离状态。
1. 在低pH值下，蛋白质中的羧基处于质子化状态，成为正电荷，而氨基则不受质子化，保持中性。
因此，在低pH值时，蛋白质呈正电荷状态，称为阳离子。
2. 在高pH值下，蛋白质中的氨基受到氢离子的质子化，成为正电荷，而羧基则不受质子化，保持中性。
因此，在高pH值时，蛋白质呈负电荷状态，称为阴离子。
3. 在等电点附近，蛋白质的质子化和去质子化同时发生，羧基和氨基的质子化程度相等，呈中性状态。
此时，蛋白质没有净电荷，称为等电点。
由于蛋白质的两性性质，可以影响其溶解性、折叠构象和相互作用等特性，对其功能和生物学作用具有重要影响。
二、蛋白质等电点的测定等电点是蛋白质具有中性状态的pH值。
测定蛋白质的等电点可以帮助我们了解其溶解性、电动力学性质和酸碱加工过程中的变化。
常用的测定等电点的方法有以下几种：1. pH梯度电泳法：这是一种常用且广泛应用的测定等电点的方法。
在一个pH梯度上进行电泳，当蛋白质离子迁移速率和电场力相等时，达到等电点。
可以通过在梯度上观察蛋白质带的形成和移动情况来确定等电点。
2. 等电聚焦电泳法：这是一种利用电场作用下蛋白质在凝胶上垂直移动的方法，根据蛋白质在凝胶中的移动速率和电场力相等时的pH值来测定等电点。
3. 等电点电位计法：该方法利用等电点时蛋白质没有净电荷的特性，使用电位计测量蛋白质在不同pH值下的电位变化，找出没有净电荷时的pH值，即为等电点。
蛋白质两性性质及等电点的测定
注意事项
在测定等电点的实验中，要求各种试剂的浓
度和加入量相当准确。
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阳离子两性离子阴离子
pH<pIpH=pIpHpI 电场中：移向阴极不移动移向阳极调节溶液 的 pH 使蛋白质分子的酸性解离与碱性解离相等， 即所带正负电荷相等，净电荷为零，此时溶液的 pH 值称为蛋白质的等电点。在等电点时，蛋白质 溶解度最小，溶液的混浊度最大，配制不同 pH 的缓冲液，观察蛋白质在这些缓冲液中的溶解情
实验蛋白质的等电点测定和沉淀反应ppt课件
(2)向以上试管中各加酪蛋白的醋酸钠溶液1mL， 加一管，摇匀一管。此时1、2、3、4管的pH依次为 5.9、5.5、4.7、3.5。观察其混浊度。静置10分钟 后，再观察其混浊度。 最混浊(有颗粒沉淀)的一 管pH即为酪蛋白的等电点。
(二)蛋白质沉淀实验
1. 蛋白质的盐析
n 加5%卵清蛋白溶液5 mL于试管中，再加等量 饱和硫酸铵溶液，混匀后静置数分钟则析出球 蛋白的沉淀。
n 离心倾去上清液，向沉淀中加入少量的水，沉 淀是否溶解？为什么？
3．有机酸沉淀蛋白质
n 取1支试管，加入蛋白质溶液2 mL，再加1 mL5%三氯乙酸溶液，振荡试管，观察沉淀的 生成。
n 离心倾去上清液，向沉淀中加入少量水，观察
沉淀是否溶解。
4．有机溶剂沉淀蛋白质
n 取1支试管，加入2 mL蛋白质溶液，再加 入2 mL 95%乙醇。混匀，观察沉淀的生 成。
现象
解释
4．有机溶剂沉淀蛋白质
现象
解释
5．乙醇引起的变性与沉淀
管 号 操作
1
振荡混匀
加数滴盐酸
2
振荡混匀
醋酸中和
加数滴盐酸
3
振荡混匀
碳酸钠中和
加数滴盐酸
现象
解释
n 水浴锅 n 温度计 n 锥形瓶 n 100mL容量瓶 n 吸管 n 试管及试管架
3、试剂
n 0.4% 酪蛋白乙酸钠溶液： 取20mL牛奶，加入 10mL 1mol/L NaAC,用去离子水定容至100mL
n 1.00 mol/L 醋酸溶液 n 0.10 mol/L 醋酸溶液 n 0.01 mol/L 醋酸溶液
实验结果
(一)酪蛋白等电点的测定
管号 pH值 混浊度 1 2 3 4
蛋白质等电点的测定
3．剥胶
电泳结束后，取下凝胶管，用蒸馏水洗净两端电极液，在 凝胶条旳正极端作上标识。用灌满水旳注射器长针头插入凝胶 与玻管管壁之间，边压水边慢慢转动玻管，推针迈进，同步注 入水，靠水流压力和润滑力将玻璃管内壁与凝胶分开，凝胶条 即可流出。
4 .固定染色
取出凝胶条放在一块洁净旳玻板上，用尺量出固定前旳凝 胶条长度。放入带盖试管中加入固定液。固定20min2后，倒 掉固定液后用脱色液漂洗2次，再染色1h，用蒸馏水漂洗多次 后用脱色液脱色，直至蛋白质区带清楚，量出蛋白带距正极端 旳距离。
试管号
1 2 3 4
蒸馏水 （ml）
8.4
8.7
8.0
7.4
0.01M醋酸 （ml） 0.6
—
—
—
0.1M醋酸 （ml）
—
0.3
1.0
—
1M醋酸 （ml）
—
—
—
1.6
(2) 向以上试管中各加酪蛋白旳醋酸钠溶液1毫 升，加一管，摇句一管。此时1、2、3、4管旳 pH值依次为5.9、5.3、4.7、3.5。观察其混浊 度。静置10分钟后，再观察其混浊度。最混浊 旳一管旳pH即为酪蛋白旳等电点。
10 min
（3）将配好旳凝胶溶液用细长头滴管加到预先准备好旳玻管 中，至离上端1 cm处，再用注射器缓缓加水3-5 mm高。
（4）待凝胶聚合
2. 电泳
将装有胶旳玻管固定到电泳槽上槽旳洞中（安装时要确 保凝胶管垂直且橡胶塞孔密封不漏）在上槽中装入0.1mol/L 氢氧化钠溶液，在下槽中加入0.1mol/L磷酸缓冲液。连接到 电泳仪，接通电源，调电压至160 V，聚焦过夜，至电流降 为200毫升锥形瓶、100毫升容
量瓶、吸管、试管、试管架、乳钵 试剂： (1)0.4％酪蛋白醋酸钠溶液 (2)1.00摩尔／升醋酸溶液 (3)0.10摩尔／升醋酸溶液 (4)0.01摩尔／升醋酸溶液
实验二蛋白质等电点及含量测定
n 牛乳中的酪蛋白的等电点是4.7-4.8。本实验采用蛋白质 在不同pH溶液中形成的混浊度来确定，即混浊度最大 时的pH值即为该种蛋白质的等电点值。
实验二蛋白质等电点及含量测定
【实验目的】
学习蛋白质的两性解离性质，掌握pH值法测定蛋 白质等电点的一般原理和操作方法。
学习和掌握双缩脲法测定蛋白质浓等电点的测定
【实验原理】——pH值沉淀法测定蛋白质等电点
n 蛋白质是两性电解质，在溶液中存在如下平衡：
4
【实验原理】——pH值沉淀法测定蛋白质等电点
下各管吸光度。 Ø 以每管蛋白质含量为横坐标，对应吸光度为纵坐标，
作吸光度-蛋白质含量标准曲线。（见电脑桌面Excel 表格“标准曲线绘制”）
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【操作步骤】——双缩脲法测定蛋白质含量
n 2.蛋白质样品测定 （每小组做1份）
1.另取2支试管，分别加1 mL未知浓度的酪蛋白蛋白质样 品液（注意样品浓度不要超过10 mg/mL），加1 mL蒸 馏水，加4 mL双缩脲试剂，混匀，室温放置30 min。
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【仪器试剂耗材】——双缩脲法测定蛋白质含量
实验仪器 ➢ 6支15mL玻璃试管、移液管、吸耳球、移液枪 （200uL）、枪头（200uL）、可见光分光光度计等。 （绘制标准曲线） ➢ 2支15mL玻璃试管、移液管、吸耳球、移液枪 （200uL）、枪头（200uL）、可见光分光光度计等。 （样品测定）
n 测定样品管吸光度时，其吸光值应界于标准曲线范围 内，如超出，应适当稀释样品后再测。
实验一 蛋白质的两性反应及等电点的测定[2]
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实验一蛋白质的两性反应及等电点的测定[2]一、实验目的2. 掌握测定蛋白质等电点的方法。
二、实验原理1. 蛋白质的两性反应蛋白质是一种复杂的高分子有机化合物，其分子中有许多含酸、含碱基的氨基酸残基。
因此，蛋白质具有两性反应。
当 pH 低于一个特定值时，氨基酸上的氨基质子化，成为带正电荷的离子型，蛋白质带正电；当 pH 高于另一个特定值时，氨基酸上的羧基失去质子，形成带负电荷的离子型，蛋白质带负电。
在这两个特定的 pH 值之间，蛋白质带有等量的正离子和负离子，呈等电点状态。
（1）等电聚焦法等电聚焦法是一种利用直流电场将蛋白质分离的方法。
在等电点时，蛋白质的总电荷为零，不受电场作用，停留在等电点位置，实现蛋白质的分离。
这种方法分辨率高、分离效率好，但设备复杂、操作难度大。
（2）等电点电泳法等电点电泳法是一种利用凝胶电泳原理测定蛋白质等电点的方法。
该方法在凝胶中涂上不同 pH 值的缓冲剂，形成不同 pH 值的电泳区，通过一定时间的电泳分离，观察蛋白质的运动位置，即可确定其等电点。
该方法比较简单、直观，分辨率较低。
三、实验步骤1. 预处理（1）将新鲜鸡蛋清取下，放在常温下静置 30 min，去除蛋清表面的泡沫和浮沫。
（2）采用冷环境离心机，将鸡蛋清离心 10 min，离心后取上清。
（1）将 1 mL 蛋清溶液分别加入 7 个不同 pH 值的缓冲溶液中，分别为 2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0。
（2）观察各实验管中的蛋清溶液的颜色变化。
（1）将 0.2 mL 蛋清溶液加入 4 mL 聚丙烯酰胺凝胶缓冲液中，混合均匀倒入凝胶板中。
（2）试管中加入 3 mL 结晶紫染色溶液（10^-3 M），将凝胶板浸泡在染色溶液中，染色 30 min 后，倒掉染色溶液，用蒸馏水清洗凝胶板几次，至染色液流出凝胶板没有颜色为止。
（3）取出凝胶板，用透明胶带覆盖红色刻度线，用间隔开的两条直线将凝胶板对折，压平，用剪刀从中央向两侧剪开，取下其中一块凝胶，放入测定盒中，插上电极进行电泳。
蛋白质等电点的测定
（3）将配好的凝胶溶液用细长头滴管加到预先准备好的玻管 中，至离上端1 cm处，再用注射器缓缓加水3-5 mm高。
（4）待凝胶聚合
2. 电泳
将装有胶的玻管固定到电泳槽上槽的洞中（安装时要保 证凝胶管垂直且橡胶塞孔密封不漏）在上槽中装入0.1mol/L 氢氧化钠溶液，在下槽中加入0.1mol/L磷酸缓冲液。连接到 电泳仪，接通电源，调电压至160 V，聚焦过夜，至电流降 为0，则可关闭电源。
试管号 蒸馏水 （ml） 8.4 8.7 8.0 7.4 0.01M醋酸 （ml） 0.6 — — — 0.1M醋酸 （ml） — 0.3 1.0 — 1M醋酸 （ml） — — — 1.6
1
2 3 4
(2) 向以上试管中各加酪蛋白的醋酸钠溶液 1毫 升，加一管，摇句一管。此时1、2、3、4管的 pH值依次为5.9、5.3、4.7、3.5。观察其混浊 度。静置10分钟后，再观察其混浊度。最混浊 的一管的pH即为酪蛋白的等电点。
01m磷酸或硫酸脱色液10蛋白质等电点标准11电泳仪12圆盘电泳槽聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳示意图a为正面b为剖面14四操作方法凝胶柱的制备1玻璃管的一端插在橡皮帽中10ml75凝胶的配制体积ml凝胶贮液25两性电解质载体05蒸馏水67510过硫酸铵00510temed01蛋白质混合样品01混匀后置真空干燥器中抽气10min153将配好的凝胶溶液用细长头滴管加到预先准备好的玻管中至离上端1cm处再用注射器缓缓加水35mm高
蛋白质等电点的测定
主要内容
(1)了解蛋白质的两性解离性质。 (2)学习测定蛋白质等电点的方法。
蛋白质的解离性质
• 蛋白质是两性电解质。在蛋白质溶液中 存在下列平衡：
蛋白质的等电点
• 蛋白质分子的解离状态和解离程度受溶液 的酸碱度影响。当溶液的 pH 达到一定数值 时，蛋白质颗粒上正负电荷的数目相等， 在电场中，蛋白质既不向阴极移动，也不 向阳极移动，此时溶液的 pH 值称为此种蛋 白质的等电点。不同蛋白质各有其特异的 等电点。在等电点时，蛋白质的理化性质 都有变化，可利用此种性质的变化测定各 种蛋白质的等电点。
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51、没有哪个社会可以制订一部永远 适用的 宪法， 甚至一 条永远 适用的 法律。 ——杰 斐逊 52、法律源于人的自卫本能。——英 格索尔
53、人们通常会发现，法律就是这样 一种的 网，触 犯法律 的人， 小的可 以穿网 而过， 大的可 以破网 而出， 只有中 等的才 会坠入 网中。 ——申 斯通 54、法律就是法律它是一座雄伟的大 夏，庇 护着我 们大家 ；它的 每一块 砖石都 垒在另 一块砖 石上。 ——高 尔斯华 绥 55、今天的法律未必明天仍是法律。 ——罗·伯顿
谢谢
11、越是没有本领的就越加自命不凡。——邓拓 12、越是无能的人，越喜欢挑剔别人的错儿。——爱尔兰 13、知人者智，自知者明。胜人者有力，自胜者强。——老子 14、意志坚强的人能把世界放在手中像泥块一样任意揉捏。——歌德 15、最具挑战性的挑战莫过于提升自我。——迈克尔·F·斯特利
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