组织切片及定向包埋技术

组织切片及定向包埋技术

谭夕东215123

摘要:本文对淡水鱼类各组织的常规石蜡切片中常迂到的技术障碍进行了探讨性的研究。经过多次反复试验总结出了多种有效方法,使各类组织切片都能得到满意的效果,同时减少了试剂的致毒作用和环境污染。在此工作基础上提出了光镜—电镜的定向包埋技术,使光镜的局限性扩展到超微结构使微观与超微结构能有统一的认识。

关键词:淡水鱼类;脆化;松脆;稚鱼;卵黄囊

随着淡水渔业的发展,人们对鱼类的研究也从宏观渐至微观。但对于有些组织如成熟卵及卵黄囊很大的稚鱼等,经过苯、醇类作用后脆化不能切制成完整的片子。但是在石蜡切片的制作过程中,我们历来都是用苯类(尤其是二甲苯)作为透明剂和石蜡的有机溶剂。组织块经酒精脱水后,必须再用二甲苯作为中间媒介剂将酒精取代出来,然后才能进行透蜡。否则,虽然水分除尽,但组织内部积蓄酒精,石蜡仍难透入。同样,切片染色前和染色后,也需要用二甲苯脱腊和透明。因此在整个制片过程中,不但要多次用二甲苯和酒精,而且组织块在其中浸渍时间难以掌握,久浸会使组织松脆,影响切片质量;时间不足又影响透蜡效果,我们采取了预先处理、补救方法及改变化学试剂等方法使较难切制的组织都能得到满意的片子。另一方面,由于光镜的局限性及切片厚度的影响,在选择样本内容易使切片组织丧失。直接制成电镜样本,有时由于切片大小,修块不准等多种原因,影响观察,而采用将样本首先精确定位的包埋技术,然后转制成电镜样本来进一步观察使微观与超微观结构能有统一的认识。

1材料与方法

1·1材料

标本采自黑龙江水产研究所实验埸。分别取鲟鱼、鳟鱼、大白鱼的肝、鳃、卵等。用Bouin氏液、Carnoy 氏液和10%甲醛固定液固定,常规石蜡包埋。切片厚度8µm, H-E染色,光学显微镜镜检,拍照。

1·2方法

1·2·1补救方法 主要对于一些已经包埋好的但切片效果不好的组织块。火棉胶(Ceuoidin)是三硝基纤维素的商品名,是由浓硝酸和浓硫酸作用于脱脂棉而成,易溶于酒精及乙醚的等量混和液体中,也可溶于丙酮及丁香油等。利用其特点,采用了火棉胶补救法,在切制片中用毛笔在组织块表面上涂一薄层10%火棉胶使整片组织粘连一起,这样可以切制成完整的组织片子,稍停数秒钟待火棉胶干燥再切下一张,然后将胶面向上贴在载玻片上,染色时在脱腊前先将胶膜脱去,然后再进行常规的染色至封片。

1·2·2预先处理法 Blendrum氏技术对于已固定的小组织块的制片是一种非常有效的方法。组织从固定剂中取出,水洗后浸于4%碳酸水溶液内1~3d。如组织太硬不论是切制迂到困难还是做先期的防护处理均可将蜡块浸泡在Mouirex内过夜次晨用常规方法切片,虽然蜡块切面有肥皂样硬度但对切片和染色皆十分优良。

1·2·3改良化学试剂 由于苯类使组织松脆影响切片质量,而且对人体有害。参考有关资料我们用兼具脱水作用的透明剂松油醇(Terpineol)代替无水酒精与二甲苯制作石蜡切片,并以攸伯拉(Euparal)封片获得相当满意的结果,具体方法如下:松油醇,又名萜品醇,松节油透醇和松脂醇,分子式为C10H18O,是有三种异构体的混合物。折光率为1·483~1·486。它是一种无色粘稠液体,具有丁香味和甜味或樟脑味,能与醇和醚相混溶,难溶于水,也可溶解石蜡。攸伯拉为无水封片剂之一,国外已普遍用于切片封苫。其优点是:

(1)标本可以直接从95%酒精取出封片,不必经过无水酒精。

(2) 24h即可干燥。

(3)折光率为1·483,较中性树胶(1·578)为低。比较接近动植物细胞的折光系数

(1·4左右)因此,许多未染色或染色很浅在中性树胶中看不清的细微构造,用攸伯拉

封片就能显示出来。

1·2·4将已固定的样本转制成电镜样本 将样本放入10%甲醛固定液中,然后用锋利刀片取出样本放入磷酸缓冲液(pH=7·4)中冲洗,按电镜生物样本常规制备法进行锇酸的二次固定,磷酸缓冲液冲洗及各级丙酮脱水,最后用环氧树脂#618进行包埋和聚合。在包埋块保留最大切面条件下做粗略的修整,将样本用玻璃刀切制成1µm厚的半薄切片,进行光镜观察。根据观察结果选择适宜的包埋块依反光定位修块法做精确的修整和进行超薄切片。

反光定位修块法:先用修块夹将包埋块固定住放于立体显微镜下,然后调节光源,使包埋块样品的切面与水平面间形成30度左右,使切面出现反光观察其结构,用双面锋利刀片精确定位修块,此定位修块也可在超薄切片机上进行。

1·2·5将制成的样本石蜡包埋块转制电镜样本 将样本首先制成石腊切片。然后进行Slidder氏桔黄G复红亮绿染色观察。根据观察情况和定位的石蜡切片和形状,在石腊包埋块上选取所需的部分,用热刀片划痕标志所需部分并切取或用热的眼科空心钻钻取约3mm大小的组织。进行二甲苯脱腊,逐级丙酮脱水和缓冲液冲洗后,制成1mm小块制备超薄切片。

1·2·6石蜡切片转制电镜样本技术 首先将已制成片的样本片子经二甲苯除掉盖玻片和树脂,放在光镜下认定所需的部位在上面用解剖针滴加一滴包埋混合液,然后用园珠笔蕊的塑料管准确地套住所需的目标,放置室温下使切片充满包埋混合液,然后放在80℃的烤箱内聚合。取出后放入温水中浸泡片刻,用尖镊子取下塑料管,再用手术刀轻轻地将小包埋块从载玻片上剥下,将小包埋块切面向上,插入含包埋混合液的空白包埋块中,置80℃烤箱中聚合。

2结果与讨论

2·1松油醇代替二甲苯

用松油醇透明并以攸伯拉封片的标本,染色新鲜,轮廓分明,图象清晰,结构完整,尤其对于卵巢切片,优于二甲苯透明的标本。二甲苯透明的标本卵黄破碎现象比较明显,说明无水酒精与二甲苯处理时间较长,卵黄易脆化,而用松油醇透明的标本则没有这种现象。说明松油醇对克服多卵黄胚胎与组织的收缩和硬脆特别有效。从效果上看,用松油醇代替二甲苯作透明剂是可行的,它除可避免因二甲苯处理不当而引起的组织脆化以外,还可简化程序,组织块脱水至95%酒精后,即可移入松油醇透明,不必再用无水酒精脱水。二甲苯是有毒药品,极易挥发,它主要通过呼吸道侵入人体,损害淋巴细胞,使免疫机能受到抑制,降低机体的抵抗力。因此用松油醇代替二甲苯制作石蜡切片有一定的实用意义。松油醇是无毒药品,用松油醇代替二甲苯制作石蜡切片可以减少环境污染。但是用松油醇代替二甲苯作透明剂也有不足之处,如松油醇穿透力较低,因此透明和透蜡的时间应适当延长。松油醇溶解石蜡的速度较慢但提高温度可以加快溶解的速度。因此如果用松油醇代替二甲苯作为透明剂,切片脱蜡最好在恒温箱内进行,温度宜控制在40℃左右,以加快脱蜡速度,特别是在冬季室温较低的情况下更应如此,而用火棉胶法,太麻烦,染色前还要脱掉火棉胶,不易得到连续切片。以上几种方法对各种组织采用的渗透时间有所不同,这主要是实验经验。不足之处,还需不断探讨。

2·2用石蜡切片制成的超薄切片

采用由石蜡切片制成的超薄切片,由于未经锇酸固定,通过常规电子染色,其反差也远低于正常超薄切片,但是可将铜网放于常规锇酸液面上蒸熏片刻,然后再染色可取得良好的反差。另外采用这种转制技术在处理样品时易使部分超微结构遭到一定破坏,但作为一种手段还是有它的意义的。

高质量组织切片的制作要点与体会

在病理技术工作中,制片质量的好坏直接影响诊断的准确率。一张质量优良的切片必须具备完整、薄厚适当、染色清晰和反差强的特点。但在实际工作中,常规组织取材、固定、脱水、透明和浸蜡的成功与否,均会直接影响到切片的质量。为此,我们结合实际工作中遇到的一些问题及解决对策,谈谈制作高质量切片制作要点与体会。

标本固定要充分 组织固定的好坏是影响制片质量的关键因素。标本无论大小,离体后应立即固定,小标本取标本固定要充分

材后如不及时固定,组织会发生干缩变硬;大标本如固定不及时,在夏天超过4 h或冬天超过24 h,标本体积就要收缩变形,或者发生自溶,将直接影响病理诊断。固定容器视标本大小而定;固定液的量要充足。固定液一般选择配制简单、价格便宜、固定效果好、既适合普通HE染色又能满足免疫组化和特殊染色的10%甲醛溶液。如果所购的甲醛溶液浓度达不到40%,且偏酸,应在配制甲醛溶液时适当增加甲醛溶液原液的量,并加入磷酸盐缓冲体系调整pH值至7.0左右。如采用多聚甲醛更好。

取材时操作要规范 标本充分固定后即可取材,取材的合格与否将直接影响组织的脱水、透明、浸蜡、切片、取材时操作要规范

染色及诊断等一系列环节。有些病理医师取材不规范,随意取材,组织块过厚、过大,或骨性组织脱钙不充分就取材;或取材时刀剪太钝,取材者往往用刀夹、锯、压组织,导致组织受挤压严重而发生破损。大标本正确的取材应是多部位,上、下、左、右、中间及病变组织与正常组织的交界均应取材,所取组织块应该大小适中、薄厚一致、