香豆素类化合物抗鲤春病毒血症病毒活性及作用机制研究

香豆素类化合物抗鲤春病毒血症病毒活性及作用机制研究

鲤科鱼类是我国传统的养殖品种,养殖产量大,是人们餐桌上的美味佳肴。然而随着养殖规模的扩大,各种类型的传染病不断地发生和流行,对水产业造成了

巨大的经济损失。

鲤春病毒血症病毒（Spring viremia of carp virus,SVCV）引起的鲤春病毒血症（Spring viremia of carp,SVC）是对鲤科鱼类危害最大的传染病之一。由于病毒宿主范围广,病原极易扩散流行,因此SVC被世界动物卫生组织（Office International des Epizooties,OIE）规定为必须申报的动物疫病之一,而我国在新颁布的动物疫病名录中将其列为一类动物疫病。

目前,尚无任何有效控制该病的药物、疫苗或其他方法,国际上通行的防控措施是对SVC进行严密监控,及早发现病鱼并进行隔离、扑杀,从而达到阻断该病暴发流行的趋势。本研究以全新合成的香豆素类化合物为研究对象,利用体外细胞分子水平筛选模型对化合物进行抗病毒活性评价,得到具有良好抗SVCV活性的

香豆素。

实验通过观察SVCV感染和药物处理后EPC（Epithelioma papulosum cyprini）细胞的形态学和各项生化指标的变化,以及使用多种细胞凋亡检测技术,对活性

香豆素的抗SVCV活性作了进一步深入的研究。与此同时,本研究探索了两种抗病毒香豆素对SVCV感染细胞过程的影响和对宿主抗病毒反应的作用,以期为开发

水产抗SVCV专用药物及SVC的防控提供理论基础。

本研究取得结果如下:1.香豆素类化合物离体抗SVCV活性研究以49种香豆素类化合物为研究对象,通过实时定量PCR（qRT-PCR）技术检测SVCV G蛋白表

达情况,体外筛选出的4种香豆素对SVCV增殖的抑制率超过90%,即7-[3-（苯并

咪唑）丙氧基]香豆素（B4）、7-[4-（4-甲基咪唑）丁氧基]香豆素（C2）、7-[4-（苯并咪唑）丁氧基]香豆素（C4）和7-[6-（2-甲基咪唑）己氧基]香豆素（D5）。药物构效关系说明:不同取代基的咪唑类香豆素的抗SVCV活性要优于其他种类的化合物,其中,苯并咪唑和甲基咪唑取代基对化合物抗病毒活性贡献最大。

细胞形态学和细胞活力检测显示上述4种香豆素显著地减弱了SVCV引起的细胞病变效应（cytopathic effect,CPE）,并可维持EPC细胞生长活力,有效保护细胞免受病毒损伤。而相比之下,香豆素C4、D5处理感染SVCV的细胞后在72 h以内产生的细胞活力保护效应优于另外两种抗病毒香豆素B4和C2,因此,被选为后续实验的研究对象。

药物浓度梯度实验进一步发现香豆素C4、D5对SVCV的N、P和M蛋白相对表达的最高抑制率同样超过90%,并在较短时间内快速进入细胞,一定时间内维

持较高的胞内药物浓度。2.香豆素C4、D5抗SVCV诱导的细胞凋亡研究通过细胞荧光染色、扫描电镜和透射电镜观察发现SVCV感染诱导EPC细胞出现典型的凋亡特征,包括细胞核皱缩、细胞形态断裂、凋亡小体产生以及细胞骨架崩解等,我们证实SVCV可诱导EPC细胞发生细胞凋亡现象,而香豆素C4、D5则有效抑制细胞凋亡的发生。

进一步的流式细胞术分析结果表明,SVCV感染EPC细胞48 h后,导致超过52%的EPC细胞发生细胞凋亡;随着病毒感染时间的增长,细胞凋亡率进一步增加,达到63.2%。而在加入香豆素C4、D5后,药物处理组的细胞凋亡率明显降低,正常细胞的比例超过80%,已接近对照组水平。

另外,研究发现随着C4、D5浓度的增加,药物处理组的细胞凋亡率持续下降,药物浓度与细胞凋亡率之间呈负相关关系。Caspase酶活性检测结果反映出香豆

素C4、D5可有效控制SVCV诱导Caspase凋亡信号的启动,避免细胞凋亡的发生。

3.香豆素C4通过PKC-Nrf2/ARE通路抗SVCV研究通过测定香豆素C4对PKC-Nrf2/ARE通路活化的影响,探究该化合物的抗SVCV作用机制。实验结果显示,C4显著提高胞内SOD和CAT酶活性以及GSH含量,保护细胞免受SVCV造成的氧化损伤。

另外,香豆素C4在不同程度上提高了PKCαThr638和PKCβSer660两个位点的磷酸化水平,从而激活Nrf2 Ser40位点的磷酸化,导致Nrf2入核蛋白量接近对照组的4倍,最终启动Nrf2/ARE抗SVCV通路。RNA干扰结果显示Nrf2/ARE通路的下游靶基因HO-1能够影响干扰素基因表达;而C4不仅可以显著提高HO-1基因的表达,同样对干扰素基因表达有促进作用。

因此,香豆素C4的抗SVCV机制主要是利用PKCα/β两个亚基的磷酸化作用调控Nrf2/ARE通路促进HO-1表达,进而触发干扰素产生抗病毒反应。4.香豆素D5对SVCV G蛋白功能的作用研究通过研究香豆素D5对SVCV增殖的影响,发现该化合物在病毒感染前期干扰SVCV识别EPC细胞,抑制RNA由晚期内吞泡释放进入细胞质,最终发挥药物抗病毒作用。

超速离心实验结果显示:在D5与SVCV粒子混合4 h后,SVCV G蛋白的扩增效率下降约90%,病毒滴度由10^6.5±0.1减小到10^3.4±

0.2,这说明D5可能对SVCV G蛋白结构造成一定破坏,从而降低病毒前期感染力和增殖力。通过构建SVCV G蛋白真核表达质粒,经过细胞转染、荧光显微镜和流式细胞术检测发现D5有效地抑制pEGFP-SVCV G质粒在EPC细胞内的表达,这个结果从另一方面证明了D5可以特异性作用于SVCV G蛋白,对G蛋白表达、功能产生影响。

此外,香豆素D5显著地抑制Erk1/2的磷酸化作用,以激活Akt-mTor通路,减少EPC细胞内自噬小体的数量,降低SVCV诱导的细胞自噬水平,对SVCV在EPC 细胞内的复制和病毒粒子的释放产生抑制作用。5.香豆素C4、D5在体抗SVCV 活性研究通过注射方式研究香豆素C4、D5对斑马鱼死亡率和鱼体内病毒含量的影响,结果发现C4处理组斑马鱼的累积死亡率相对病毒组减少17.5%,D5处理组减少20%。

斑马鱼脾脏和肾脏内SVCV G蛋白表达结果显示第1天和第4天鱼体内G蛋白的表达低于病毒组,反应了香豆素C4/D5的抗病毒作用。与此同时,这两种香豆素提高了斑马鱼体内的抗氧化酶活性,维持抗氧化-氧化系统平衡,并在SVCV复制前期通过激活鱼体干扰素表达对病毒增殖产生一定的抑制作用,最终降低SVCV对斑马鱼感染力。

由此可见,香豆素C4和D5可以作为抗SVCV感染潜在的备选药物。综上所述,香豆素C4、D5分别通过宿主抗病毒反应和直接作用病毒结构蛋白对SVCV增殖产生强烈的抑制作用,能够在体外和体内显著地降低病毒量,有效地维持宿主细胞生长活力,减少感染病毒斑马鱼的死亡率。

因此,香豆素C4、D5对防控SVC具有广阔的应用前景。