克隆表达与引物设计
外源基因原核系统克隆表达的基本流程
外源基因原核系统克隆表达的基本流程
外源基因原核系统克隆表达的基本流程如下：
1. 设计引物：根据外源基因的序列，设计引物，其中至少包括一个启动子和一个终止子。
2. 基因克隆：使用PCR或其他克隆技术，将外源基因与载体DNA连接起来，形成重组质粒。
3. 转化：将重组质粒转化到适当的宿主细胞中，如大肠杆菌。
4. 筛选：通过选择性培养基或其他筛选方法，筛选出带有重组质粒的转化菌落。
5. 培养：将筛选出的转化菌落进行扩增培养，在适当的培养条件下培养细菌。
6. 表达：在培养过程中，外源基因会被宿主细胞转录和翻译，产生目标蛋白质。
7. 提取：收集细菌培养物，利用细胞破裂或其他细胞提取方法，提取目标蛋白质。
8. 纯化：通过各种纯化技术，如柱层析、电泳等，纯化目标蛋白质。
9. 鉴定：利用各种方法，如SDS-PAGE、Western blot等，对
目标蛋白质进行鉴定和定量分析。
10. 应用：利用纯化的目标蛋白质进行后续的研究或应用，如
功能鉴定、结构分析、抗原制备等。
这是一个基本的流程，根据不同的实验目的和具体情况，可能还会涉及到一些其他的步骤和操作。
克隆载体构建实验报告(3篇)
第1篇一、实验目的1. 学习克隆载体的构建方法，掌握分子克隆的基本原理和操作步骤。
2. 掌握利用限制性内切酶和DNA连接酶进行DNA片段的插入和连接。
3. 熟悉重组质粒的鉴定和扩增方法。
二、实验原理克隆载体是分子生物学研究中常用的工具，它可以将目的基因插入其中，并在宿主细胞中进行扩增。
克隆载体的构建主要包括以下步骤：1. 设计引物：根据目的基因序列设计特异性引物，用于PCR扩增目的基因片段。
2. PCR扩增：利用引物扩增目的基因片段。
3. 载体线性化：利用限制性内切酶将载体线性化，使其具有末端粘性。
4. DNA片段连接：将目的基因片段与载体进行连接。
5. 转化宿主细胞：将连接后的重组质粒转化至宿主细胞。
6. 鉴定和扩增：通过PCR、酶切等方法对转化后的细胞进行鉴定和扩增。
三、实验材料1. 试剂：PCR引物、限制性内切酶、DNA连接酶、DNA分子量标准、Taq酶、pUC19载体、感受态细胞等。
2. 仪器：PCR仪、电泳仪、凝胶成像系统、移液器、DNA纯化柱等。
四、实验步骤1. 设计引物：根据目的基因序列设计特异性引物，引物长度一般为20-30个碱基，其中包含酶切位点。
2. PCR扩增：利用引物扩增目的基因片段，PCR反应体系如下：- 10×PCR缓冲液5μl- dNTPs（每种2.5μmol/L）4μl- 引物（上下游引物各1μmol/L）2μl- DNA模板1μl- Taq酶0.5μl- ddH2O补充至50μl3. 载体线性化：利用限制性内切酶将载体线性化，反应体系如下：- 载体DNA 5μl- 10×酶切缓冲液5μl- 限制性内切酶1μl- ddH2O补充至20μl4. DNA片段连接：将PCR产物与载体进行连接，反应体系如下：- 线性化载体DNA 5μl- PCR产物5μl- 10×连接缓冲液5μl- DNA连接酶1μl- ddH2O补充至20μl5. 转化宿主细胞：将连接后的重组质粒转化至感受态细胞，具体操作方法如下：- 将感受态细胞铺板于含有适当抗生素的培养基上，37℃培养过夜。
基因克隆具体实验报告
一、实验目的1. 学习基因克隆的基本原理和方法。
2. 掌握PCR扩增、酶切、连接等基因克隆实验技术。
3. 验证目的基因的克隆是否成功。
二、实验原理基因克隆是指将目的基因片段从基因组中分离出来，并插入到载体中，使其在宿主细胞中复制、表达的过程。
实验过程中，主要涉及PCR扩增、酶切、连接、转化、筛选等步骤。
三、实验材料1. 模板DNA：含有目的基因的基因组DNA。
2. 引物：根据目的基因序列设计的上下游引物。
3. Taq DNA聚合酶：用于PCR扩增。
4. 酶切体系：限制性内切酶、缓冲液、连接酶等。
5. 连接载体：线性化载体。
6. 转化宿主菌：大肠杆菌DH5α。
7. 筛选培养基：含抗生素的LB培养基。
8. PCR扩增试剂：10×PCR缓冲液、dNTPs、MgCl2等。
四、实验方法1. PCR扩增（1）设计引物：根据目的基因序列设计上下游引物，长度约为20-30bp，分别位于目的基因的上下游。
（2）PCR反应体系：取模板DNA 1μl，上下游引物各1μl，10×PCR缓冲液5μl，dNTPs 4μl，MgCl2 2μl，Taq DNA聚合酶0.5μl，加ddH2O至50μl。
（3）PCR反应程序：95℃预变性5min，95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，共35个循环，最后延伸10min。
2. 酶切连接（1）酶切：取PCR产物5μl，加限制性内切酶（如EcoRI）1μl，10×酶切缓冲液2μl，ddH2O 2μl，混匀后置于37℃水浴酶切2h。
（2）连接：取线性化载体5μl，酶切产物5μl，10×连接缓冲液2μl，T4 DNA 连接酶1μl，混匀后置于16℃连接过夜。
3. 转化（1）制备感受态细胞：将大肠杆菌DH5α在LB培养基中培养至对数生长期，按照1:100的比例加入CaCl2，混匀后冰浴30min。
（2）热激转化：将连接产物加入感受态细胞中，混匀后置于42℃水浴45s，迅速转移至冰浴中。
最新为什么要先构建克隆载体再用表达载体备课讲稿
最新为什么要先构建克隆载体再⽤表达载体备课讲稿为什么要先构建克隆载体再⽤表达载体构建克隆载体是⼤量扩增DNA⽚段，⽤以测序、酶切和改造等对DNA实施的后续操作，构建表达载体是⼤量得到翻译产物——蛋⽩质。
为什么要先构建克隆载体，再⽤表达载体，我猜是因为：①得到⼤量的DNA，虽然PCR也可以，但PCR扩增有出错率、但你每做⼀次常规的PCR，⽽且每次都要重新提DNA和RNA才⾏，⽽且，PCR反应的试剂盒⼜不便宜，⽤PCR来制备⼤量DNA有点得不偿失。
尽管构建克隆载体也存在操作复杂（相对于PCR），成功率不是极⾼，⽽且还要筛选，但⼀旦你重组成功并转⼊了⼤肠杆菌，你就可以保存了，你想什么时候⽤，摇个菌，就可以制备到⼤量的DNA。
②测序需要。
你想转表达，你⾸先得确定你扩增的⽬的⽚段是不是你要的，不要以为你设计了个特异性引物，然后跟你mark 的长度就可以确定了，这也只是推测，在科学上不严谨。
扩增出的基因⽚段保险起见或者经费允许，要拿去测序，⽽⼀般送测的序列都是构建到载体上的序列，克隆载体上⼀般也都带有测序引物，已确定这就是你要的那条序列。
你要写论⽂必须要给⼈真凭实据。
先构建克隆载体再构建表达载体并不是⼀个必须的选择，如果你的扩增PCR⽬的条带很亮，⽽且单⼀性很好，我建议你可以直接克隆进⼊表达载体。
很多⼈选择先构建克隆载体，是因为在扩增基因时⽬的条带模糊，特异性不好，这样将基因连接到克隆载体上就可以便于挑去单克隆进⾏测序，增加测序的准确度，从⽽确认⾃⼰克隆基因序列的正确性。
单纯的PCR产物往往是⼀些各种PCR⽚段的混合物，直接送过去测序，往往导致测序信号峰很杂，有时候并不能测出想要的信号序列。
同时保存的PCR⽚段⽐较容易降解，⽽构建好克隆载体后形成的质粒是很容易扩增和保存的。
先构建克隆载体，⼀是为了便于测序，确认克隆序列正确，⼆是为了便于基因PCR⽚段的保存。
怎么构建克隆载体和表达载体？⾸先根据你的实验需要选择相应的载体。
(整理)克隆载体与表达载体
一部分：概念解析二部分：问题解答克隆载体：大多是高拷贝的载体，一般是原核细菌，将需要克隆的基因与克隆载体的质粒相连接，再导入原核细菌内，质粒会在原核细菌内大量复制，形成大量的基因克隆，被克隆的基因不一定会表达，但一定被大量复制。
克隆载体只是为了保存基因片段，这样细胞内不会有很多表达的蛋白质而影响别的工作。
克隆载体(Cloning vector )：携带插入外源片段的质粒或噬菌体，从而产生更多物质或蛋白质产物。
(这是为“携带”感兴趣的外源DNA、实现外源DNA的无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA分子。
) 其中，为使插入的外源DNA序列可转录、进而翻译成多肽链而设计的克隆载体又称表达载体。
是否含有表达系统元件，即启动子--核糖体结合位点--克隆位点--转录终止信号，这是用来区别克隆载体和表达载体的标志。
表达载体：有的是高拷贝的，有的是低拷贝的，各有各的用处，是一些用于工程生产的细菌，被导入的目标基因会在此类细菌中得到表达，生产出我们需要的产物，导入的基因是由克隆载体产出的。
表达载体具有较高的蛋白质表达效率，一般因为具有强的启动子。
表达载体（Expression vectors）就是在克隆载体基本骨架的基础上增加表达元件（如启动子、RBS、终止子等），是目的基因能够表达的载体。
如表达载体pKK223-3是一个具有典型表达结构的大肠杆菌表达载体。
其基本骨架为来自pBR322和pUC的质粒复制起点和氨苄青霉素抗性基因。
在表达元件中，有一个杂合tac强启动子和终止子，在启动子下游有RBS位点（如果利用这个位点，要求与ATG之间间隔5-13bp），其后的多克隆位点可装载要表达的目标基因。
（RBS位点：1974年Shine和Dalgarno首先发现，原核生物，在mRNA上有核糖体的结合位点，它们是起始密码子AUG和一段位于AUG上游3～10 bp处的由3—9bp组成的序列。
这段序列富含嘌呤核苷酸，刚好与16S rRNA 3，末端的富含嘧啶的序列互补，是核糖体RNA的识别与结合位点。
克隆载体表达载体构建详细版
克隆载体表达载体构建详细版一、稀释引物1、4℃，15min、13000转离心（先等离心机降温）2、根据OD值加DD水。
3、静置30min（冰上）4、准备1.5毫升EP管，并加90ulDD水。
5、向EP管中加10ul引物，震荡离心，-20℃保存。
二、跑MIX检测引物（20ul体系）、上引物0.8ul下引物0.8ulMix 10ulDNA（日本晴）1ulDD水7.4ul三跑高保真酶（50ul体系）DNAorCDNA 2ul上引物2ul下引物2ul5*buffer 10uldNTPs 5ulDD水28ulPfu（最后加）1ul四胶回收流程1、在紫外线下切胶，用牙签装入2ml的EP管中。
2、按量加XP2，放在55℃水浴锅中10min，每2min摇匀1次，涡旋，短离。
3、将液体冷却到室温，转移到平衡住中，离心10000转，1min30s，倒掉滤液。
4、加入xp2 300ul，离心10000r，1min30s，倒掉滤液。
5、加入spw700ul，离心10000r，1min，倒掉滤液（重复一次）6、空转2min，13000r，之后换1.5mlEP管。
7、套上保鲜膜放入37℃烘箱中，30min。
8、加入DD水10ul，静置2min，离心2min，13000r，重复3次，-20℃保存。
五、胶回收产物检测（10ul）体系上引物0.4ul下引物0.4ulMix 5ul回收产物1ulDD水 3.2ul六、构建blunt cloning 载体（克隆载体）（4ul 体系）胶回收产物 3.5ulBlunt cloning 0.5ul混匀后，PCR：25℃15min 盖子温度50℃之后转化1、提前5min从-70℃冰箱中拿出大肠杆菌感受态，冰上解冻5min。
2、将样品（4ul）加入感受态的大肠杆菌中，冰上30min，大约剩5min左右，打开水浴锅预热到42℃，并拿出SDC 培养基解冻（室温解冻）。
3、水浴锅42℃，60-90s迅速转移到冰浴2min，该过程中不要摇动离心管。
引物设计
无任何特异性
03
目的基因的获取-PCR引物设计
特异引物设计：
通用引物设计：
1、扩增的完整序列完全已知 1、扩增保守的同源基因
2、扩增序列长度要≥CDS
2、扩增序列长度一般<CDS
3、引物长度18-22，得分高
3、一般测序用
4、要blast
4、不用个人设计
5、测序时要提供引物，连到T载 5、测序不需要提供引物
03
PART THREE
引物设计原则和方法
03
目的基因的克隆
基因工程的主要目的是把经过遗传学和分子生物学前期 研究探明了结构与功能的靶基因（target gene）转导 宿主细胞中表达，以大量获取该基因的产物或改变宿主 性状。由此可见，如何分离得到靶基因是基因工程操作 的关键步骤之一，否则“巧妇难为无米之炊”。
序不好进行
3、 随机6或9个mers
4、要获得完整基因要做步移
PCR或反向PCR或测完整基因组
03
目的基因的获取-PCR引物设计
引物设计软件： 1、Oligo 6 2、Primer premier 5/6 3、Dnastar 4、Primer 3plus（在线）
03
目的基因的获取-PCR引物设计
引物二聚体
发夹结构
03
目的基因的获取-PCR引物设计
引物设计种类：
引物
克隆引物 表达引物
特异引物Specific
primers
只扩增某一类基因或生物
通用引物Universal 与基因两端基因匹配（载体）
Primers
兼并引物Degenerate 可以扩增某一类相似基因
Primers
随机引物
Random primers
分子克隆PCR引物设计
PCR引物设计的目的是为了找到一对合适的核苷酸片段，使其能有效地扩增模板DNA序列。
因此，引物的优劣直接关系到PCR的特异性与成功与否。
要设计引物首先要找到DNA序列的保守区。
同时应预测将要扩增的片段单链是否形成二级结构。
如这个区域单链能形成二级结构，就要避开它。
如这一段不能形成二级结构，那就可以在这一区域设计引物。
现在可以在这一保守区域里设计一对引物。
一般引物长度为15~30碱基，扩增片段长度为100~600碱基对。
让我们先看看P1引物。
一般引物序列中G+C含量一般为40%~60%。
而且四种碱基的分布最好随机。
不要有聚嘌呤或聚嘧啶存在。
否则P1引物设计的就不合理。
应重新寻找区域设计引物。
同时引物之间也不能有互补性，一般一对引物间不应多于4个连续碱基的互补。
引物确定以后，可以对引物进行必要的修饰，例如可以在引物的5′端加酶切位点序列；标记生物素、荧光素、地高辛等，这对扩增的特异性影响不大。
但3′端绝对不能进行任何修饰，因为引物的延伸是从3′端开始的。
这里还需提醒的是3′端不要终止于密码子的第3位，因为密码子第3位易发生简并，会影响扩增的特异性与效率。
综上所述我们可以归纳十条PCR引物的设计原则：①引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性。
②产物不能形成二级结构。
③引物长度一般在15~30碱基之间。
④G+C含量在40%~60%之间。
⑤碱基要随机分布。
⑥引物自身不能有连续4个碱基的互补。
⑦引物之间不能有连续4个碱基的互补。
⑧引物5′端可以修饰。
⑨引物3′端不可修饰。
⑩引物3′端要避开密码子的第3位。
PCR引物设计的目的是找到一对合适的核苷酸片段，使其能有效地扩增模板DNA序列。
如前述，引物的优劣直接关系到PCR的特异性与成功与否。
对引物的设计不可能有一种包罗万象的规则确保PCR的成功，但遵循某些原则，则有助于引物的设计。
1.引物的特异性引物与非特异扩增序列的同源性不要超过70%或有连续8个互补碱基同源。
分子克隆的实验报告(3篇)
第1篇一、实验目的本实验旨在学习分子克隆技术的基本原理和操作步骤，掌握目的基因的扩增、克隆及表达，为后续相关研究奠定基础。
二、实验原理分子克隆技术是指将目的DNA片段从供体细胞中分离出来，通过体外重组、转化和转导等方法，将其插入到克隆载体中，再将其引入宿主细胞进行复制和扩增。
本实验采用无缝克隆技术，通过T5核酸外切酶、DNA聚合酶和DNA连接酶三种酶的共同作用，实现单片段或多片段与载体连接。
三、实验材料1. 试剂：限制性内切酶、DNA连接酶、T5核酸外切酶、DNA聚合酶、dNTPs、Taq DNA聚合酶、PCR引物、载体DNA、目的基因DNA、质粒提取试剂盒、琼脂糖凝胶电泳试剂盒等。
2. 仪器：PCR仪、凝胶成像仪、电泳仪、紫外灯、超净工作台、离心机、恒温水浴锅、移液器等。
四、实验步骤1. 目的基因扩增（1）设计引物：根据目的基因的序列设计特异性引物，引物长度一般在18-25bp，5'端添加限制酶切位点。
（2）PCR反应：配制PCR反应体系，加入引物、模板DNA、dNTPs、Taq DNA聚合酶等，进行PCR反应。
2. 载体线性化（1）酶切：使用限制性内切酶对载体DNA进行酶切，获得线性化的载体。
（2）去磷酸化：对单酶切得到的线性化载体进行去磷酸化处理。
3. 目的基因与载体连接（1）同源臂连接：将目的基因PCR产物和线性化载体进行同源臂连接，确保目的基因正确插入载体。
（2）连接反应：配制连接反应体系，加入目的基因PCR产物、线性化载体、DNA连接酶等，进行连接反应。
4. 转化与筛选（1）转化：将连接产物转化至宿主细胞中。
（2）筛选：通过抗生素筛选、酶切鉴定和测序等方法筛选出含有目的基因的克隆。
5. 目的基因表达（1）重组质粒提取：从筛选出的阳性克隆中提取重组质粒。
（2）重组质粒转化：将重组质粒转化至表达宿主细胞中。
（3）表达产物检测：通过Western blot、ELISA等方法检测目的蛋白的表达水平。
基因克隆步骤完整版
基因克隆步骤完整版基因克隆是一项复杂的生物技术，可以用于生物研究、药物开发和农业改良等领域。
下面是基因克隆的完整步骤：1.设计克隆实验方案：首先，确定要克隆的基因序列。
这可以是来自同一物种的已知基因，或者是从其他物种中提取的基因。
然后，设计适当的引物（引物是专门设计用来扩增特定DNA序列的短片段）用于PCR扩增。
2.DNA提取：提取目标组织或细胞中的DNA。
常用的DNA提取方法包括酚/氯仿法、盐法和商业DNA提取试剂盒等。
3.PCR扩增：使用引物和DNA模板进行多轮PCR扩增，从而产生大量目标基因的复制。
4.凝胶电泳：将PCR产物进行凝胶电泳分析，以确认扩增是否成功，并确定目标基因的大小。
5.DNA纯化：将目标基因的PCR产物从凝胶中切割并纯化。
这通常通过使用商业DNA凝胶提取试剂盒来完成。
6.多重限制性内切酶切割和连接：根据克隆方案中的设计，使用适当的限制性内切酶切割DNA。
然后，将目标基因连接到一个载体DNA中，这个载体DNA称为克隆载体。
克隆载体通常是一个圆形的质粒DNA。
7.转化：将克隆载体插入到宿主细胞中。
这可以通过热激冷转化、电转化或化学转化等方法实现。
8.筛选转化子：使用适当的筛选方法筛选转化子。
这可以通过选择性培养基，例如含有抗生素的培养基，或者通过对转化子进行荧光筛选等方法。
9.扩增：从筛选出的阳性克隆中提取DNA，并使用PCR或其他方法进行扩增。
10.序列分析：对扩增的DNA进行序列分析，以确认克隆是否成功。
这可以通过将DNA提交给商业实验室进行测序，或者使用自动测序设备进行测序。
11.功能分析：对克隆所得基因进行功能分析。
可以通过转基因生物的研究，观察基因对生物表型的影响。
12.存储和应用：将克隆所得的基因保存在冷冻库中，以备后续研究或应用。
总结：基因克隆是一项复杂的过程，包括基因序列设计、DNA提取、PCR扩增、凝胶电泳、DNA纯化、限制性内切酶切割和连接、转化和筛选转化子、扩增、序列分析、功能分析和存储等步骤。
PCR技术克隆目的基因全过程
PCR技术克隆目的基因全过程PCR（聚合酶链式反应）是一种体外的DNA合成技术，可以通过放大目的基因序列来克隆和检测DNA。
以下是PCR技术克隆目的基因全过程的详细解释。
1.设计引物：引物是用于扩增目的基因的短DNA片段。
引物分为前向引物和反向引物，其序列分别与目的基因的5’和3’末端相互匹配。
引物的设计应该尽量避免互相形成二聚体或发生引物间杂交。
一般情况下，前向引物和反向引物的长度约为18-30个碱基。
2.DNA模板的准备：DNA模板是PCR反应中的起始材料，可以是从细胞中提取的基因组DNA、cDNA或合成的DNA片段等。
DNA模板需要经过特定的处理步骤，如酶切或热变性，以解开DNA双链结构，使得引物能够与目的基因序列起始材料结合。
3.PCR反应体系的制备：PCR反应体系通常包含DNA模板、引物、dNTPs（脱氧核苷酸三磷酸盐）、聚合酶、缓冲液和稀释的镁离子。
这些成分需要以特定的量和浓度配制在一起。
在反应体系中加入适量的聚合酶，可以保证PCR反应能够进行。
4.PCR扩增条件设定：PCR反应需要经历一系列的温度变化，这些温度的设定旨在创造一个适宜扩增引物的环境。
PCR反应通常包含三个主要的步骤：变性、退火和延伸。
变性步骤中，DNA模板的双链结构被加热到95°C，使其变性为两条单链DNA。
退火步骤中，反应体系温度降至碱基互补序列的温度，使引物能够与DNA模板结合。
延伸步骤中，反应体系温度升至适合聚合酶的工作温度，引物被复制形成两条新的双链DNA。
这三个步骤的温度和时间根据目的基因的特性和引物的设计来设定。
5.PCR扩增循环：PCR反应通常包含20-40个循环，每个循环包括变性、退火和延伸三个步骤。
每个循环都会使目的DNA序列扩增一倍。
PCR反应的循环数取决于目的基因的起始材料的丰度和所需扩增的DNA数量。
6.PCR产物检测：PCR扩增产物可以通过凝胶电泳等方法进行检测。
凝胶电泳可以将PCR扩增产物按照大小分离。
克隆基因提取实验报告(3篇)
第1篇一、实验目的本实验旨在学习并掌握克隆基因提取的基本原理和操作步骤，通过实验操作，提取目的基因，为后续的基因克隆、表达和功能研究奠定基础。
二、实验原理克隆基因提取主要利用DNA提取技术，通过破碎细胞、释放DNA、去除杂质等步骤，得到高纯度的DNA。
本实验采用碱裂解法提取目的基因，该方法具有操作简单、提取效率高、DNA纯度好等优点。
三、实验材料1. 实验试剂：NaCl溶液、Tris-HCl缓冲液、无水乙醇、异丙醇、二苯胺染液、DNA提取试剂盒等。
2. 实验仪器：高速离心机、电子天平、移液器、PCR仪、凝胶成像系统等。
3. 实验样品：目的基因载体（含目的基因）、细菌菌液等。
四、实验步骤1. 细菌培养：将目的基因载体转化至大肠杆菌，挑取单克隆菌落，接种于含有适量抗生素的LB液体培养基中，37℃、200 r/min培养过夜。
2. 酵母提取物制备：将过夜培养的菌液按1:100比例稀释，加入酵母提取物、葡萄糖等，37℃、200 r/min培养至对数生长期。
3. 细菌裂解：将培养好的菌液按照1:10比例加入裂解液，55℃水浴30 min，期间每隔5 min振荡1次，使菌体充分裂解。
4. DNA沉淀：将裂解液按照1:2比例加入等体积的异丙醇，混匀，4℃、12 000r/min离心10 min，弃上清液。
5. DNA洗涤：将沉淀用70%乙醇洗涤1次，4℃、7 500 r/min离心5 min，弃上清液。
6. DNA溶解：将沉淀用适量TE缓冲液溶解，-20℃保存。
7. DNA纯化：按照DNA提取试剂盒说明书进行操作，得到高纯度的目的基因。
8. 验证：将提取的目的基因进行PCR扩增，观察扩增结果，确认目的基因提取成功。
五、实验结果与分析1. PCR扩增结果：通过PCR扩增，成功获得目的基因，扩增产物大小与预期相符。
2. DNA纯度：利用NanoDrop2000检测提取的目的基因，A260/A280比值在1.8-2.0之间，表明DNA纯度较高。
基因克隆引物设计步骤
基因克隆引物设计步骤以基因克隆引物设计步骤为标题，我们将详细介绍基因克隆引物设计的过程。
基因克隆引物设计是分子生物学实验中常见的步骤，用于扩增目标DNA片段。
下面将按照以下步骤进行介绍。
1. 确定目标序列在进行基因克隆引物设计之前，首先需要明确要扩增的目标DNA 序列。
这可以通过测序、文献检索或数据库查询等方式获得。
目标序列的正确性和完整性对于引物设计的准确性至关重要。
2. 引物设计原则在进行引物设计时，需要遵循一些基本原则，以确保引物的特异性和扩增效率。
首先，引物长度一般在18-30个碱基对之间，过短的引物可能缺乏特异性，而过长的引物则可能导致扩增效率低下。
其次，引物的GC含量应在40-60%之间，以保证引物的稳定性和特异性。
此外，引物的3'末端应避免含有重复序列或自反序列，以防止引物的二聚体形成。
3. 引物序列选择基于目标序列，可以使用一系列的在线工具或软件来设计引物序列。
这些工具通常会根据引物设计原则自动生成候选引物。
在选择引物时，需要考虑引物之间的互补性和特异性，以及引物与非靶DNA 序列的匹配度。
此外，还需要考虑引物的Tm值和GC含量的均匀性，以确保引物的特异性和扩增效率。
4. 引物合成一旦确定了合适的引物序列，可以选择将引物进行合成。
引物合成可以通过商业实验室或自行合成。
在合成引物时，需要选择高质量的合成引物，以确保引物的纯度和完整性。
5. 引物验证在使用合成的引物进行扩增实验之前，需要进行引物的验证。
验证的方法可以包括聚合酶链式反应（PCR）扩增和测序。
通过PCR扩增，可以验证引物的特异性和扩增效率。
通过测序，可以验证扩增产物的正确性和一致性。
6. 引物调优如果在引物验证过程中发现扩增效果不理想，可以考虑进行引物调优。
引物调优可以通过引物浓度、PCR条件和模板DNA浓度等因素进行调整。
调优的目标是提高扩增效率和特异性。
7. 引物存储一旦引物经过验证并进行了调优，可以将其进行存储。
基因克隆引物设计步骤
基因克隆引物设计步骤1. 目标序列的获取：首先需要获得目标序列的基因组或cDNA序列，这可以通过基因数据库（如GenBank）查询获得。
确定目标序列后，需要分析它的特性，比如长度、GC含量以及可能存在的酶切位点等。
2.引物设计原则：引物设计需要满足一定的原则，以确保扩增效果和结果的可靠性。
主要的引物设计原则包括：-引物长度：一般推荐使用15~30个碱基对的短引物，较短的引物长度有助于提高扩增效率和特异性。
-GC含量：引物的GC含量应在40%~60%之间，过高或过低的GC含量会影响引物与靶序列的特异性和稳定性。
-特异性：引物序列应具有足够的特异性，避免与非目标序列发生扩增。
-酶切位点：应避免引物序列中存在酶切位点，以防止后续的限制性酶切或连接反应出现问题。
-互补性：引物之间不应存在太多的互补碱基，以免出现二聚体或交联等问题。
3. 引物设计工具：为了更好地设计引物，可以使用一些在线引物设计工具，例如Primer3、NCBI Primer-BLAST、OligoAnalyzer等。
这些工具能够根据目标序列的特性和用户需求自动设计引物，并提供引物的理化参数评估。
4.引物序列检验：设计好引物后，需要将引物序列与目标序列进行比对，确保引物与目标序列的匹配性。
可以使用BLAST等在线工具进行比对，并评估匹配的特异性和引物与目标序列的相似度。
5.引物合成和验证：设计好的引物需要经过实验室内的合成，并进行验证。
常见的验证方法包括聚合酶链式反应（PCR）扩增，并通过凝胶电泳分析扩增产物的大小和纯度。
6.引物应用：合成和验证通过的引物可以应用于后续的基因克隆实验，如荧光定量PCR、逆转录PCR、基因突变、基因组DNA扩增等。
需要注意的是，不同实验需求下的引物设计具有不同的特点。
在设计引物时，需要考虑到实验的具体要求，如定量PCR和逆转录PCR要求引物的特异性和降低产生副产物的概率；基因克隆可能需要设计限制性酶切位点和连接序列；基因敲除需要设计引物覆盖目标序列的两侧等。
分子克隆与表达实验
分子克隆与表达实验流程1.选取菌株从保存的海冰细菌中随机选取某几株，挑取其单菌落于发酵培养基（2216）活化培养，1d后将活化的菌株5ml接入70ml发酵培养基中，12℃，100rpm摇床培养，大约4~5d后对菌株在4℃下，12000rpm进行离心，收集菌体，于4℃保存。
2.提取菌株全基因组在超净工作台上取120μl离心后的菌株悬浮于400μl的1×TE缓冲液中，加入10%SDS 100μl和2mg/mL的溶菌酶20μl，混匀后置于37℃保温1h，加入5M 的NaCl 70μl充分混匀，置于65℃水浴10min，加入等体积的苯酚/氯仿/异戊醇（25:24:1）混匀，离心（12000rpm、8min），取上层水相于新离心管中并加入等体积的氯仿/异戊醇（24:1）充分抽提，取上层水相加入两倍体积的无水乙醇沉淀DNA，并用70%的乙醇淋洗两次，倾去乙醇，真空干燥后溶于25μl的1×TE缓冲液。
对全基因组进行电泳检验，其余的置-4℃冰箱保存备用。
3.根据目的蛋白设计引物本实验研究的是小分子蛋白：谷胱甘肽转移酶（GST）、硫氧还蛋白（Trx）和谷氧还蛋白（Grx）。
根据这三种蛋白的基因用Primer5设计引物。
引物名称与序列引物名称引物序列，方向5′——3′合成规格(OD)GST1(1) TTTATGGYGTMCCKCTTTCTC 2GST1(2) CA TGCTSCA TATTSATTAWCTG 2GST2(1) AGTSTCGCCGTTTAATCAACC 2GST2(2) YKCATY AAKYTGCTCRCCMSC 2GST3(1) TTTA TGGCGTACCTCTTTCTCC 2GST3(2) CGGTAA TACCTAACTGCTCAGC 2GST4(1) TCTGTTACCTCGCCTTAT 2GST4(2) AAAGCCA TTATCTTCTGC 2GST5(1) ACTTA TTTGGAGCA TTGAGCGG 2GST5(2) TCGGCGGTTCAAGAAAAG 2Trx1(1) AAGAATTCA TGAGCGAGAAAATAATCC 2Trx1(2) CGCAAGCTTTTAAAGA TTGTTTTCTA 2Trx2(1) AAGAATTCA TGAGCGAGAAAATAATC 2Trx2(2) CTCAAGCTTTTAGA TGTTGTTTTCTA 2Trx3(1) CGGAGAGCCA TA TGAGCGAGAA 2Trx3(2) TTGTTTAAATCTCGAGATTGTTTTCT 2Grx1(1) GTGTTATCTGGTGGTA TGG 2Grx1(2) TTGTGCTGCTGCGTTTTG 24.PCR扩增以菌株的全基因组为模板，对上述引物进行PCR，从中寻找含有目的基因的菌株，对含有目的基因的菌株进行验证并保种。
引物设计的原理和程序
引物设计的原理和程序引物设计是在分子生物学领域中非常重要的一项技术，用于在DNA或RNA序列中选择特定的区域进行放大、克隆或检测。
引物设计的目标是选择具有高度特异性和高效性的引物，以确保所需的目标序列可以准确地被扩增或检测到。
以下是引物设计的原理和程序的详细说明。
1.特异性：引物应该在目标区域具有高度特异性，即只与目标序列配对，并排除与非目标序列的配对。
这可以通过确保引物序列在目标区域的起始位置和长度与目标序列相匹配来实现。
2.合成效率：引物应该具有高合成效率，以确保引物在PCR或其他实验过程中可以被充分放大或扩增。
合成效率可以通过一些计算方法如GC 含量、引物长度和翻转重复等特征进行评估。
3.避免互补配对：引物设计时应避免两个引物之间或引物与DNA模板之间形成互补配对。
互补配对可能会导致引物之间的二聚体形成或降低引物与目标区域的结合能力。
引物设计通常分为两个主要步骤：目标序列选择和引物设计。
1.目标序列选择：选择目标序列是引物设计的第一步。
目标序列通常是想要扩增或检测的DNA或RNA片段。
这可以是已知序列的基因、intergenic区域、病毒或细菌的片段等。
目标序列的选择需要考虑研究的目的以及实验的具体要求。
2.引物设计：引物设计是根据目标序列选择适当的引物。
引物设计可以通过多种计算机程序或在线工具来实现。
a.引物长度选择：引物长度通常在18到30个碱基对之间，具体长度的选择取决于目标序列的特点和实验需求。
较长的引物可以提供更好的特异性，但可能会降低扩增效率。
b.GC含量计算：GC含量是引物设计中的一个重要参数，通常在40%到60%之间。
GC含量高的引物可以提供更好的热稳定性和特异性，但过高或过低的GC含量都可能影响引物的性能。
c.特异性评估：引物的特异性可以通过与非目标序列进行比对来评估。
在引物设计过程中，首先应排除与非目标序列存在高度相似度的区域，然后检查目标序列中引物能否与其他非目标序列配对。
基因克隆引物设计步骤
基因克隆引物设计步骤基因克隆是指将感兴趣的基因从一个生物体中转移到另一个生物体中的过程。
在基因克隆中，引物是必不可少的工具，它们作为DNA扩增的起始序列，帮助将目标基因扩增出来。
引物的设计是基因克隆的关键步骤之一，下面是基因克隆引物设计的详细步骤。
1.确定目标基因序列：首先要确定你想要克隆的基因序列。
可以根据已有的序列资料获得，也可以通过测序等技术获得此序列。
2.选择扩增方法：根据实验需求选择适合的扩增方法。
常见的扩增方法有PCR、RT-PCR、RACE等。
3.获取引物序列：根据目标基因序列，设计引物序列。
引物通常由两个部分组成：前向引物和反向引物。
前向引物与目标序列的上游区域互补，反向引物与目标序列的下游区域互补。
引物长度通常为18-22个碱基对。
4.引物设计原则：-引物长度：引物长度应在18-22个碱基对之间，过短则会导致特异性降低，过长则会导致引物的结构稳定性下降。
-GC含量：引物的GC含量应在40%-60%之间，过高或过低的GC含量会导致引物的熔解温度变化，降低引物与目标序列的互补性。
-特异性：引物应具有高度的特异性，避免与其他基因或非目标序列发生互补。
5.避免引物二聚体和髙聚物的形成：-引物二聚体：引物二聚体是指两个引物之间通过碱基配对形成的复合物。
二聚体的形成会导致PCR扩增效率降低甚至完全失败。
要避免引物二聚体的形成，可以使用引物设计软件进行计算和优化。
-引物髙聚物：引物髙聚物是指引物之间互相结合形成的长链。
髙聚物的形成会抑制PCR扩增的产物的生成，同样可使用引物设计软件进行计算和优化。
6.核酸序列分析软件的使用：核酸序列分析软件可以帮助你检查设计引物的性能，如特异性、互补性等。
常用的软件有Primer3、Oligo Analyzer等。
7.引物合成：找到合适的引物序列后，可以将其提交给寡核苷酸合成机构进行合成。
合成的引物会被送到实验室进行后续的基因克隆实验。
总结起来，基因克隆引物设计的关键是确定目标基因序列、选择合适的扩增方法、根据引物设计原则设计引物、避免引物二聚体和髙聚物的形成，并使用核酸序列分析软件进行验证。
分子克隆技术操作手册
分子克隆技术操作手册摘要：一、分子克隆技术简介二、分子克隆实验材料与设备三、分子克隆实验步骤1.设计引物2.合成目的基因3.构建表达载体4.转化受体细胞5.筛选转化子6.鉴定目的基因四、分子克隆实验注意事项五、实验结果分析与应用正文：一、分子克隆技术简介分子克隆技术是一种生物技术方法，通过复制特定DNA序列，将目的基因在受体细胞中稳定表达。
该技术在基因工程、生物科学等领域具有广泛应用，有助于研究基因功能、蛋白质表达及药物筛选等。
二、分子克隆实验材料与设备1.实验材料：DNA模板、引物、dNTPs、DNA聚合酶、缓冲液等。
2.实验设备：PCR仪、离心机、电泳仪、凝胶成像系统等。
三、分子克隆实验步骤1.设计引物根据目的基因序列，设计一对互补的引物。
引物应具备一定的特异性，避免非特异性扩增。
2.合成目的基因利用PCR技术，以DNA模板为基础，通过引物扩增目的基因。
反应条件需根据所使用DNA聚合酶的要求进行优化。
3.构建表达载体将目的基因与载体DNA连接，形成表达载体。
常用的载体有质粒、噬菌体等。
4.转化受体细胞将构建好的表达载体转化到受体细胞中，如大肠杆菌、酵母等。
转化方法有化学法、电转化法等。
5.筛选转化子转化后的受体细胞在含相应抗生素的培养基上生长，筛选出含有目的基因的转化子。
6.鉴定目的基因对筛选出的转化子进行进一步鉴定，如DNA测序、基因表达分析等。
四、分子克隆实验注意事项1.实验过程中要保持无菌操作，避免污染。
2.选择合适的引物长度和退火温度，以提高扩增特异性。
3.转化受体细胞时，注意操作力度，避免细胞损伤。
4.筛选转化子时，严格控制抗生素浓度，避免过度筛选。
五、实验结果分析与应用1.分析PCR产物，判断目的基因是否成功克隆。
2.鉴定目的基因的表达水平，评估实验效果。
3.将成功克隆的目的基因应用于基因敲除、基因表达等研究。
通过以上步骤，您可以顺利完成分子克隆实验。
实验过程中需严格操作，确保实验结果的准确性。
分子生物学 基因克隆及克隆基因的表达
Bam HⅠ GGATCC CCTAGG
Bg lⅡ AGATCT TCTAGA
互连后？
GCCTAG+
GATCC G
A
+GATCT
TCTAG
ALOGO
Ⅱ型限制性内切酶具有一些共性和特性：
5. 不同的酶可以识别同一个序列 同工异源酶（isoschizomer）或同裂酶 能识别同一序列（切割位点可同或不同）但来源不同的两种酶。
LOGO
聚合酶链式反应
Polymerase Chain Reaction, PCR
体外高效特异性的扩增目的DNA片段
LOGO
LOGO
LOGO
LOGO
LOGO
PCR的基本原理
• PCR反应条件 • PCR过程 • PCR的特点
1
2
3
高温变性 低温退火 适温延伸
94
温
度 72
（℃）
55
22
DNA 2
3’
3’
5’
上游引物、5’ 引物、Sense primer
PCR反应扩增的就是一对引物之间的DNA片段，PCR反应 成功扩增的关键在于引物的正确设计。
引物设计的总原则——提高引物与模板结合的特异性。
LOGO
PCR引物设计的基本原则： 1.引物与模板的序列要紧密互补。 2.引物自身、引物之间不应存在互补序列。 3.引物不能在模板的非目的位点引发PCR。
LOGO
分子生物学关键的技术突破： DNA重组技术
1972年， 世界上第一个重组DNA分子诞生
1980年， 获诺贝尔化学奖
猿猴病毒DNA
噬菌体DNA
限制性内切酶
限制性内切酶
DNA连接酶 重组DNA分子
克隆载体与表达载体
xx载体：大多是高拷贝的载体，一般是原核细菌，将需要克隆的基因与克隆载体的质粒相连接，再导入原核细菌内，质粒会在原核细菌内大量复制，形成大量的基因克隆，被克隆的基因不一定会表达，但一定被大量复制。
克隆载体只是为了保存基因片段，这样细胞内不会有很多表达的蛋白质而影响别的工作。
克隆载体(Cloning vector )：携带插入外源片段的质粒或噬菌体，从而产生更多物质或蛋白质产物。
(这是为“携带”感兴趣的外源DNA、实现外源DNA的无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA分子。
)其中，为使插入的外源DNA序列可转录、进而翻译成多肽链而设计的克隆载体又称表达载体。
是否含有表达系统元件，即启动子--核糖体结合位点--克隆位点--转录终止信号，这是用来区别克隆载体和表达载体的标志。
表达载体：有的是高拷贝的，有的是低拷贝的，各有各的用处，是一些用于工程生产的细菌，被导入的目标基因会在此类细菌中得到表达，生产出我们需要的产物，导入的基因是由克隆载体产出的。
表达载体具有较高的蛋白质表达效率，一般因为具有强的启动子。
表达载体（Expression vectors）就是在克隆载体基本骨架的基础上增加表达元件（如启动子、RBS、终止子等），是目的基因能够表达的载体。
如表达载体pKK223-3是一个具有典型表达结构的大肠杆菌表达载体。
其基本骨架为来自pBR322和pUC的质粒复制起点和氨苄青霉素抗性基因。
在表达元件中，有一个杂合tac强启动子和终止子，在启动子下游有RBS位点（如果利用这个位点，要求与ATG之间间隔5-13bp），其后的多克隆位点可装载要表达的目标基因。
（RBS位点：1974年Shine和Dalgarno首先发现，原核生物，在mRNA上有核糖体的结合位点，它们是起始密码子AUG和一段位于AUG上游3～10 bp 处的由3—9bp组成的序列。
这段序列富含嘌呤核苷酸，刚好与16S rRNA 3，末端的富含嘧啶的序列互补，是核糖体RNA的识别与结合位点。
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克隆表达与引物设计
Clone,Expression,and Prime Design
克隆表达的路线
目的DNA片段和载体的制备
目的DNA片段和载体的连接
重组子筛选 什么是克隆？ 表达的目的 载体的选择 引物的设计是关键
连接产物的转化
目的蛋白的诱导表达 目的蛋白的纯化
目的基因的克隆及其原核表达 技 术 路 线
程序：
3’ Antisense primer
引物
←
5’
dNTP 上游引物 下游引物 模板 Taq 酶
95℃ 变性5min； 94℃ 变性30s，
52℃ 退火30s， 72℃延伸40s，
3）和条件
引物设计的原则
1. 引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性。
2. 产物不能形成二级结构；避开产物的二级结构区。自由能△G°≥58.6l kJ/mol。 3. 引物长度一般在15~30碱基之间。 4. G+C含量在40%~60%之间。 5. 碱基要随机分布。 6. 引物自身不能有连续4个碱基的互补；引物之间不能有连续4个碱基的互补。 7. 引物5′端可以修饰；引物3′端不可修饰。 8. 引物3′端要避开密码子的第3位。
3. 分析所要扩增的基因片段，对其保守性，抗原优势位点等进行分析。
4. 利用软件，参照引物设计的原则，进行引物的设计。
引物设计目的和PCR扩增
PCR引物设计的目的：
找到一对合适的核苷酸片段，使其能够有效的扩增模板DNA。
Sense primer
3’ 5’
→
ddH2O 10×buffer
17µL 2.5µL 1µL 1µL 1µL 2µL 0.5µL
HEV
RNA Extraction
RT-PCR
HE
PCR Vector TProductA Vector T A
pET HE
转化 DE 3
大肠杆菌
HE蛋白
ITPG诱导
实验目的与引物设计
1. 明确实验的目的，根据实验目的设计引物。 2. 选择表达载体，根据载体的酶切位点，在引物的5‘端加入酶切位点。