最新鱼类细胞工程基础
2-2 动物细胞工程(第一课时)-2023-2024学年高二生物精品课件(人教版2019选择性必修
渗透压：需要考虑的一个重要环境参数
气体环境 O2: 细胞代谢所必需的 （95%空气和 CO2：维持培养液的pH 5% CO2 ）
微生物培养中的作用不同（为自养型 微生物提供碳源）
CO2 培养箱
2 动物细胞培养的过程
动物组织块 用机械法或用胰蛋白酶、胶原蛋白酶处理
（将细胞所需的营养物质按种类和所需量严格配置而成的培养基）
液体培养基 （培养液）
1 动物细胞培养的条件
无菌、无毒的环境 ①对培养液和所有培养用具进行灭菌处理
无菌 ②在无菌环境下进行操作 无毒 定期更换培养液，以便清除代谢物
超净工作台
1 动物细胞培养的条件
适宜的温度、pH和渗透压
温度：哺乳动物多以（36.5±0.5）℃
①使细胞与培养液充分接触，一方面保证细胞所需的 O2和营养物质的供应，另一方面保证细胞内代谢废物 的及时排出；
②使得在细胞水平操作的其它技术得以实现。
2 动物细胞培养的过程
【思考3】用胰蛋白酶分散细胞，由此可说明细胞间的物 质主要是什么成分？ 主要是蛋白质(胶原蛋白等)。
【思考4】胰蛋白酶能将细胞消化掉吗？那将动物组织 分散成单个细胞时要注意什么问题呢？
能，应注意时间的控制。因为胰蛋白酶不仅能分解细胞 间的蛋白质，长时间还会分解膜蛋白，对细胞造成损伤。
【思考5】能够用胃蛋白酶代替胰蛋白酶吗？为什么？ 不能，因为动物细胞培养适宜的PH为7.2—7.4，此环 境下胃蛋白酶（2.0）没有活性，而胰蛋白酶(7.2-8.4) 的活性较高。
2 动物细胞培养的过程
动物细胞工程
（第一课时）
➢ 动物细胞培养 ➢ 动物细胞融合 ➢ 动物细胞核移植
海洋生物技术—海洋动物细胞培养定稿
培养方法和环境要求 （一）培养的方法 动物细胞的体外培养有两种类型： 1.贴壁依赖性细胞，大多数动物细胞，包括非淋巴组织的细胞和许多异倍体体系的细 胞部属于这一类型。这一类需采用贴壁培养。
贴壁培养是指大多数动物细胞在离体培养条件下都需要附着在带有适量正电荷的固 体或半固体的表面上才能正常生长，并最终在附着表面扩展成单层。
原代培养
50代细胞
传代培养
动物细胞培养的应用
1）生产有价值的蛋白质生物制品；如病毒 疫苗、干扰素、单克隆抗体等。
2）为治疗和预防疾病提供理论依据 （如为皮肤大面积烧伤的病人培养可供移 植皮肤）
3）用于检测有毒物质
2. 鱼类细胞培养的方法与技术
2.1鱼类细胞培养基的选择 主要是合成培养基，常用的有以下几种：Eagles MEM、Leibowitz L-15、M199和M1640。 Eagles MEM适用于多种细胞的生长培养，如 CCO、AS、CHSE-214、RTG-2等，还可以通过 在其中添加或减少某些成分用于特殊研究的细胞 培养，是一些海水鱼类细胞系培养常用的培养基； M199所含的营养成分丰富而且全面，可以在细胞 培养中用作维持液，可以使一些细胞的存活时间 达到33天，是一些淡水鱼类细胞系常用的培养基；
细胞工程的核心技术：细胞培养与繁殖 目的：获得新性状、新个体、新物质
2 细胞工程的研究范畴
•动物细胞与组织培养 •植物细胞与组织培养 •细胞融合 •细胞核移植 •染色体工程 •胚胎工程 •干细胞与组织工程 •转基因生物与生物反应器
3 动物细胞工程
常用的技术手段： 包括动物细胞培养、动物细胞融合、单
克隆抗体、胚胎移植、核移植等 。 动物细胞培养是其他细胞工程技术的基
础。
动植物、微生物细胞的培养特征
人教版教学课件人教新课标版(选修3)细胞工程—第二节动物细胞工程1
植物组织培养和动物细胞培养的比较
比较项目 植物组织培养 动物细胞培养
原理 培养基性质
培养基特有成分
细胞的全能性 固体培养基 植物激素
细胞增殖 液体培养基 动物血清
培养结果
培养目的
植物体
快速繁殖、培育 无病毒植株等
细胞株、细胞系
大量获得细胞 或细胞产物
动物细胞培养应用
生产有价值的蛋白质制品（病毒疫苗、干扰素、
动物细胞工程
动物细胞与组织培养 细胞核移植与动物体细胞克隆
细胞融合和单克隆抗体制备
漯河高中丁鹏举 dpj7210@
动物细胞培养
定义：是指在体外模拟动物体内环境，将动物细
胞或组织在无菌、温度适宜和营养充足的条件下 培养，使其继续生长、增殖并维持原有结构和功 能的技术。
4.如何界定原代培养和传代培养；细胞株和细胞 系？
随细胞增多，细胞会出现接触性抑制
细胞株 细胞系遗传物质改变
细胞 悬浮 液
10代 细胞
50代 细胞
传代培养
无限传 代
原代培养
多数组织细胞粘附在培养 瓶表面生长和分裂。
动物细胞培养条件：
1、无菌、无毒的环境： （添加一定量的抗生素；定期更换培养液，以便清除代 谢产物。） 2、营养物质： （葡萄糖、氨基酸、核酸、无机盐、维生素、动物血清等。） 3、温度和pH： 37摄氏度左右, 7.2-7.4 4、气体环境： O2和CO2（95%空气和5% CO2 ）
A.动物细胞融合
C.胚胎移植
B.单克隆抗体
D.动物细胞培养
3、用于动物细胞培养的组织和细胞大都取自胚 胎或出生不久的幼龄动物的器官或组织，其主 要原因是这样的组织细胞 （ D ） A.容易产生各种变异 B.具有更强的全能性 C.取材十分方便 D.分裂增殖的能力强
动物细胞工程知识整理
＿＿＿培养 ② 单个细胞 细胞悬液 培养 接触抑制 动物细胞 ① 细胞培养 供体 体细胞 ＿＿＿＿＿＿ 卵巢卵 母细胞 减 Ⅱ中 期 去核 无核卵母细胞 注 入 ＿＿＿＿＿＿ 发 育 胚 胎 胚胎移植 代孕母体 生出与供体遗传 物质相同的个体动物细胞工程要点梳理一、动物细胞培养1．概念：从动物机体中取出相关的组织，将它分散成＿＿＿＿＿＿＿，然后放在适宜的培养基中，让这些细胞生长和＿＿＿＿＿。
2．过程：注：①②代表的是＿＿＿＿＿＿或胶原蛋白酶。
10～50代的细胞群叫细胞株。
50代以后的细胞群叫＿＿＿＿＿。
3．条件：（1）无菌、无毒的环境：培养液应进行＿＿＿＿＿处理。
（2）营养（合成培养基成分）：糖类、氨基酸、促生长因子、无机盐、微量元素，通常需加入＿＿＿、血浆等。
（3）温度：适宜温度36.5±0.5 ℃；pH ＿＿＿＿。
（4）气体环境：空气95%，＿＿＿5%。
4．应用：如病毒疫苗、干扰素、＿＿＿＿＿。
二、动物体细胞核移植技术和克隆动物1．动物体细胞核移植：将一个动物细胞的＿＿＿＿＿移入一个去核的卵母细胞中，使其重组并发育成一个新的胚胎，这个胚胎最终发育为动物个体。
2．种类：（1）体细胞核移植：难。
（2）＿＿＿＿＿移植：易。
3．过程：4．应用：（1）加速家畜＿＿＿＿改良进程，促进＿＿＿＿＿繁育。
（2）保护濒危物种。
（3）生产＿＿＿＿＿＿。
（4）作为异种移植的＿＿＿＿。
（5）用于组织器官的移植。
5．问题：克隆动物存在＿＿＿＿＿、生理缺陷、＿＿＿＿＿等。
三、动物细胞融合不同＿＿＿＿＿的两个细胞灭活的病毒PEG杂交细胞选择B淋巴细胞抗原刺激骨髓瘤细胞克隆检测＿＿＿＿＿浆细胞杂交瘤细胞单克隆抗体B－B细胞瘤－瘤细胞杂交瘤细胞体外培养1．概念：＿＿＿＿＿＿动物细胞结合形成一个细胞的过程，又叫细胞杂交。
2．结果：形成＿＿＿＿细胞。
3．过程：4．意义：克服了＿＿＿＿杂交的不亲和性。
四、单克隆抗体1．抗体的产生：＿＿＿＿＿＿产生的抗体具有特异性。
动物细胞工程基础实验
25
配制液体培养基
1. 将培养基干粉（PRMI-1640）倒入1000 mL烧杯，加 800mL三蒸水，玻棒搅拌充分溶解；再加入加1.8g HEPES和2.2g碳酸氢钠，玻棒搅拌充分溶解，溶液呈 橙色（弱酸性，pH在7.0左右）；再倒入1000 mL容量 瓶，用三蒸水定容至刻度。
9. 接种细胞：吸取4 mL上述的细胞悬液，加入原细胞 培养瓶中，接种后2个培养瓶中的悬液各4 mL；
10. 静置培养：盖上瓶盖，拧紧，标记（包括细胞名称、 代数、传代日期），放入常规的生化培养箱静置培 养；
11. 观察细胞：每天观察细胞生长状况，并确定是否进 行第2代的传代。
36
EPC细胞（消化前）
2. PBS用于2胰蛋白酶溶液和3 EDTA溶液的配制，余下高 压灭菌备用；
3. 将PBS分装入试剂瓶中，瓶盖转松，牛皮纸包紧，橡皮 筋加固，装入提篮，121℃，20min灭菌；
4. 自然干燥冷却后，4℃保存备用。
23
配制胰蛋白酶（0.25%）
1. 称取0.625g胰蛋白酶于250 mL烧杯，加入1配制 的PBS 200 mL，玻棒搅拌充分溶解后，倒入250 mL容量瓶中，用PBS定容至刻度。
3. 胰蛋白酶（Trypsin）可将贴壁的细胞从培养瓶壁上消 化下来，通常使用浓度为0.25%或0.125%。
4. EDTA溶液 用于清洗细胞表面，螯合Ca2+等二价离 子，使细胞易于为胰蛋白酶消化。
20
鱼类细胞培养基础知识
鱼类细胞组培的一些方法：
▪
▪ （1）组织块固定法
▪
当组织量较少时可采用此法。它是将组织剪成约一立方毫米的小块, 按一
定比例将组织块贴在瓶壁上, 至少三十分钟以上, 然后轻轻加人营养液置温箱培养
。
▪ （2）机械分散法
▪
此法适用于细胞间连接较松散的组织, 如胚胎组织及幼鱼全鱼。将组织剪
▪ 加少许培养液,将培养瓶倒转置于培养箱中,在 37℃条件下培养,2h后补充培养液,并翻转培养基 继续培养。
鱼类细胞培养基础知识
六、实验步骤
▪ 3．观察 置于37℃培养的细胞．需逐日进 行观察．主要观察：
▪ (1)培养物是否被污染，如培养液变为黄色 且混浊，表示该瓶被污染。
▪ (2)细胞生长状况与培养液颜色的变化，如 培养液变为紫红色，一般细胞生长不好。 可能是瓶塞未盖紧或营养液pH过高。
。
鱼类细胞培养基础知识
鱼类细胞培养基础知识
六、实验步骤
▪ 待细胞已基本长成致密单层时，此时即可 进行传代培养了。
鱼类细胞培养基础知识
七、注意事项
▪ 细胞培养要求无菌操作。无菌是细胞培养 成功的首要条件。
▪ 重视进人无菌室操作前必须将培养瓶外表 消毒提防试剂瓶中的液体浸湿瓶盖, 这往往 是试验污染的重要因素之一。
鱼类细胞培养基础知识
八 鱼类细胞原代培养意义
▪ 在对细胞的营养需求有比较深人认识的基础上, ▪ 化学成分明确的无蛋白培养基已被用于中国仓鼠 ▪ 卵巢细胞汇和杂交瘤细胞的培养。虽然鱼类细胞 ▪ 培养中尚未成功应用无血清培养技术, 但在这方 ▪ 面的研究已有一定基础,相信在不久的将来鱼细胞 ▪ 培养技术会有所突破, 更广泛地应用于研究领域
动物细胞工程基础知识
（三）细胞分化的决定及影响因素 1．细胞分化的决定
第四节 细胞周期与调控 在多细胞生物体生长发育时，细胞的
分裂、增值、衰老、死亡、更新等过程均离 不开生物体对细胞周期的精确调控。细胞周 期的调控实质就是细胞遗传物质以及有关成 分的复制、分配，而这种复制分配在体内是 极其精确和有序的。这种精确性与有序性受 到细胞内某些机制的调控，如果调控失常， 即可导致细胞的非正常增殖或死亡。
细胞衰老死亡是生物体的必然归宿， 也是细胞的必然归宿。对多细胞机体，细胞 的衰亡，如肝细胞、肾细胞衰亡，并不直接 引起机体的衰亡，只表现为机体局部生理、 生化功能改变。
一、细胞分化的概念及其特点 （一）细胞分化的概念
细胞分化是指同一来源的细胞通过细胞 分裂在结构和功能上产生稳定性差异的过程。 细胞分化贯穿个体发生的全过程。
原始卵泡
卵丘
卵泡腔 颗粒C
成熟卵泡
卵母细胞
卵丘细胞
成熟培养２２小时后，带扩散的卵丘细胞的成熟卵母细胞
第一极体
第一极体
成熟培养２２小时，去颗粒细胞后，带第一极体的成熟卵母细胞
（三）成熟培养液中添加Ｈepes平衡盐的卵母细胞成熟情况
第三节 细胞分裂与增殖 细胞增殖(cell proliferation)是指ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ胞通
一、动物体细胞的形态 细胞的形态多种多样，由于其类型不
同、执行的功能不同及细胞生活的环境与细 胞相互关系的不同而在形态上有很大的差别， 但一般细胞有其固定的形态（图2-1）。
二、动物体细胞的结构 动物细胞可以在亚显微结构水平上被划
分为三大基本结构体系：①以脂质及蛋白质 成分为基础的生物膜结构系统；②以核酸 (DNA或RNA)与蛋白质为主要成分的遗传信 息表达系统；③由特异蛋白分子装配构成的 细胞骨架系统。（图2-2）。
浙江温州市2024届高考生物三模试卷含解析
浙江温州市2024届高考生物三模试卷注意事项1．考试结束后，请将本试卷和答题卡一并交回．2．答题前，请务必将自己的姓名、准考证号用0．5毫米黑色墨水的签字笔填写在试卷及答题卡的规定位置．3．请认真核对监考员在答题卡上所粘贴的条形码上的姓名、准考证号与本人是否相符．4．作答选择题，必须用2B铅笔将答题卡上对应选项的方框涂满、涂黑；如需改动，请用橡皮擦干净后，再选涂其他答案．作答非选择题，必须用05毫米黑色墨水的签字笔在答题卡上的指定位置作答，在其他位置作答一律无效．5．如需作图，须用2B铅笔绘、写清楚，线条、符号等须加黑、加粗．一、选择题(本大题共7小题,每小题6分,共42分。
)1．下列有关激素的叙述正确的是（）A．激素均通过改变靶细胞的生理过程发挥调节作用B．人体内具有调节作用的物质均属于激素C．人成年后生长激素不再分泌，身高不再增加D．不同浓度生长素对植物同一部位作用效果一定不同2．下列关于噬菌体侵染细菌实验、肺炎双球菌转化实验的叙述，正确的是（）A．噬菌体侵染细菌实验证明了DNA是主要的遗传物质B．噬菌体侵染细菌实验中，T2噬菌体的DNA是用32P直接标记的C．S型菌的DNA经RNA酶处理后，不能使活的R型菌转化成S型菌D．肺炎双球菌活体转化实验，可推测转化因子存在于S型菌中且有较高的热稳定性3．自2019年12月，武汉出现新型冠状病毒引起的肺炎疫情以来，我们政府与世卫组织通力合作，全力防控，目前疫情在我国基本得到遏制，下列有关此病毒的说法不正确的是（）A．新型冠状病毒主要成分是RNA和蛋白质B．新型冠状病毒的遗传物质是RNAC．该病毒侵入人体肺泡细胞后，会被效应T细胞识别，使该肺泡细胞裂解死亡D．组成该病毒的遗传物质的单体共有5种4．科研人员研究棉花细胞核中一个DNA 分子中a、b、c 三个连续基因，其分布状况如图所示，图中Ⅰ、Ⅱ为基因间的序列。
有关叙述正确的是（）A．a、b、c 所携带的遗传信息不可能同时得到执行B．图中碱基对替换发生在a 区段属于基因突变，发生在Ⅰ区段不属于基因突变C．该DNA 分子含n 个碱基，其转录的mRNA 分子的碱基数是n/2 个D．Ⅰ中插入一个抗虫基因以提高植物的抗虫性，这种变异属于染色体结构变异5．研究发现，与正常女性相比，Turner综合征患者(女性)易患血友病(伴Ⅹ染色体隐性遗传病)，据此可推测Turner 综合征患者体内可能（）A．多一条X染色体B．少一条X染色体C．血小板凝集成团D．红细胞凝集成团6．旱金莲由三对等位基因控制花的长度，这三对基因分别位于三对同源染色体上，作用相等且具叠加性。
动物细胞培养及海水鱼类细胞系的建立-080125(1)
实用文档
8
动 物
取材
细
胞
切割
原
代
消化
培
养
过
接种培养
程
图
实用文档
9
原代细胞的取材
一、取材的基本要求
（1）取材要注意新鲜和保鲜 新鲜组织易于培养成功，取材时应 尽量在4~6h内能制作成细胞，尽快入箱培养，若不能即时培养， 应将组织浸泡于培养液内，于4℃存放。若组织块较大，应在清 除表面血块、坏死组织、脂肪和结缔组织后，切碎于培养液内 4℃存放，但时间不能超过24h。对于已切碎的组织或血液、淋 巴组织应加入含10%二甲基亚砜 (DMSO) 的培养基，按细胞冻 存方式于液氮中冷冻保存。
洗手和着装 原则上和外科手术相同。并于开始操作前要用75％酒精消毒手和前臂。如果实验
过程中手触及可能污染的物品和出入培养室都要重新用消毒液洗手。进入原代培养 室需彻底洗手还要戴口罩、着消毒衣帽。
培养过程中的无菌操作 在无菌环境进行培养或做其它无菌工作时，首先要点燃酒精灯。以后一切操作，
鱼类性腺发育研究进展
鱼类性腺发育研究进展一、本文概述鱼类性腺发育研究是水产科学领域的重要研究方向，对于理解鱼类的繁殖机制、提高养殖产量以及保护渔业资源具有重要意义。
本文旨在综述近年来鱼类性腺发育研究的进展，包括性腺的组织结构、发育过程、调控机制以及环境因素对性腺发育的影响等方面的研究内容。
通过本文的阐述，旨在为相关领域的学者和从业者提供全面的研究参考，推动鱼类性腺发育研究的深入发展。
在本文中，我们首先对鱼类性腺的组织结构和发育过程进行概述，包括性腺的形态特征、细胞类型以及发育阶段等。
我们将探讨性腺发育的调控机制，包括内分泌激素、基因表达以及信号通路等方面的研究。
我们还将关注环境因素对鱼类性腺发育的影响，如温度、光照、水质等因素对性腺发育的调控作用。
我们将对鱼类性腺发育研究的未来趋势进行展望，以期为推动该领域的研究提供有益的思路和方向。
通过本文的综述，我们期望能够全面展示鱼类性腺发育研究的最新成果和进展，为相关领域的研究提供有益的参考和启示。
我们也希望本文能够激发更多学者和从业者对鱼类性腺发育研究的兴趣和热情，共同推动该领域的研究向更高水平发展。
二、鱼类性腺发育的生物学基础鱼类性腺发育的生物学基础涉及遗传、内分泌、环境等多个方面的因素。
在遗传层面，鱼类的性腺发育受到一系列基因的精细调控，这些基因在特定的时间和空间表达，共同影响性腺的分化、发育和成熟。
内分泌因素在鱼类性腺发育过程中起着至关重要的作用，特别是促性腺激素（GTH）和性类固醇激素（如睾酮和雌二醇）等，它们通过复杂的反馈机制调控性腺的发育和功能。
环境因素也对鱼类性腺发育产生显著影响。
水温、光照、水质、食物等环境因素的变化，都可能引起鱼类内分泌系统的改变，进而影响性腺发育。
例如，水温的升高可能促进鱼类性腺的发育和成熟，而水质污染则可能导致性腺发育异常或功能障碍。
在鱼类性腺发育过程中，性腺的组织结构和功能也发生了一系列变化。
这些变化包括生殖细胞的增殖、分化和成熟，以及性腺组织的形态学变化等。
《鱼类细胞工程基础》课件
除了水产养殖业，鱼类细胞工程还有望在环境保护、 生物制药等领域发挥重要作用。
加强国际合作与交流
推动国际间的合作与交流，共同推进鱼类细胞工程技 术的发展。
鱼类细胞工程对水产养殖业的影响
提高产量与品质
01
通过鱼类细胞工程技术，可以培育出高产、优质、抗逆性强的
新品种，提高水产养殖业的产量和品质。
新品种培育
生物制药
通过鱼类基因工程，培育抗病、抗逆 、高产、优质的新品种。
利用鱼类细胞生产药物或疫苗等生物 制品。
生物反应器
利用转基因鱼类生产药用蛋白或工业 用酶等。
04
鱼类细胞工程实验技 术
鱼类细胞分离与纯化技术
鱼类细胞分离
通过物理或化学方法将鱼类组织或器 官中的细胞分离出来，如机械分离、 酶解分离等。
鱼类细胞纯化
利用细胞的物理、化学或生物学特性 ，将分离出的细胞进行纯化，得到高 纯度的目标细胞。
鱼类细胞克隆技术
鱼类胚胎细胞克隆
通过核移植技术将鱼类胚胎细胞的细胞核移植到去核卵母细 胞中，培养成个体。
鱼类成体细胞克隆
利用鱼类成体细胞的细胞核，通过核移植技术实现个体的克 隆。
鱼类细胞转化与转基因技术
02
鱼类细胞工程是水产养殖领域的 重要分支，对于提高养殖效益、 保护水域生态具有重要意义。
鱼类细胞工程应用领域
01
02
03
鱼类品种改良
通过基因转移、细胞培养 等技术，培育抗病、抗逆 、生长快速的鱼类新品种 ，提高养殖效益。
鱼类疾病防治
利用细胞培养、免疫技术 等手段，研发高效、安全 的疫苗和药物，防治鱼类 疾病，保障水产品安全。
降低成本与风险
02
生物选修三专题2细胞工程2.2动物细胞工程
⽣物选修三专题2细胞⼯程2.2动物细胞⼯程专题2细胞⼯程 2.2动物细胞⼯程⼀、动物细胞⼯程：动物细胞培养、动物细胞核移植、动物细胞融合(⽣产单克隆抗体)★动物细胞培养技术是其他动物细胞⼯程技术的基础⼆、动物细胞培养：从动物机体中取出相关的组织，将它分散成单个细胞，然后，放在适宜的培养基中，让这些细胞⽣长和增殖。
（原理：细胞增殖）2、动物细胞培养的过程：注：①细胞株和细胞系的区别：细胞株遗传物质未改变，细胞系发⽣基因突变，遗传物质已改变，细胞系具有癌细胞的特点，失去接触抑制，获得不死性，容易传代培养。
原因：传代细胞传⾄10代~50代左右时，增殖分化缓慢以⾄于完全停⽌，这时可能细胞核型会发⽣变化。
故⽬前使⽤的或保存的正常细胞通常为10代以内。
②原代培养：从机体取出后⽴即培养的细胞为原代细胞（即动物组织消化后的初次培养）。
培养的第1代细胞与传10代以内的细胞称为原代培养。
③传代培养：将原代细胞从培养瓶中取出，配制成细胞悬浮液，分装到两个或两个以上的培养瓶中继续培养，称为传代培养。
④细胞贴壁：将细胞悬液放⼊培养瓶内，置于适宜环境中培养。
悬液中分散的细胞很快就能贴附在瓶壁内，称为细胞贴壁。
⑤接触抑制：当贴壁细胞分裂⽣长到表⾯相互接触时，细胞就会停⽌分裂增殖，这种现象称为细胞的接触抑制。
⑥细胞间的成分主要是蛋⽩质。
加⼊胰蛋⽩酶或胶原蛋⽩酶分散细胞⽽不加⼊胃蛋⽩酶。
原因：胃蛋⽩酶适宜的PH约为2，当PH>6时，胃蛋⽩酶就会失去活性，⽽胰蛋⽩酶作⽤的适宜环境PH为7.2----8.4，多数动物细胞培养的适宜PH为7.2----7.4，胃蛋⽩酶在此环境中没有活性。
胰蛋⽩酶在此环境中活性较⾼，因此胰蛋⽩酶适宜⽤于细胞培养时的消化。
3、动物细胞培养的条件①⽆菌、⽆毒的环境：添加⼀定量的抗⽣素，定期更换培养液②营养：葡萄糖、氨基酸、⽆机盐、微量元素、动物⾎清、⾎浆（补充合成培养基中缺乏的物质）等。
③温度和PH：36.5 ±0.5度；PH为7.2~7.4。
最新鱼类细胞工程基础汇总31页PPT
35、不要以为自己成功一次就可以了 ，也不 要以为 过去的 光荣可 以被永 远肯定 。
最新鱼类细胞工人看不 穿。(名 言网) 32、我不想听失意者的哭泣，抱怨者 的牢骚 ，这是 羊群中 的瘟疫 ，我不 能被它 传染。 我要尽 量避免 绝望， 辛勤耕 耘，忍 受苦楚 。我一 试再试 ，争取 每天的 成功， 避免以 失败收 常在别 人停滞 不前时 ，我继 续拼搏 。
Thank you
6、最大的骄傲于最大的自卑都表示心灵的最软弱无力。——斯宾诺莎 7、自知之明是最难得的知识。——西班牙 8、勇气通往天堂，怯懦通往地狱。——塞内加 9、有时候读书是一种巧妙地避开思考的方法。——赫尔普斯 10、阅读一切好书如同和过去最杰出的人谈话。——笛卡儿
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课程安排
2
本实验课的目的
➢ 培养实验的思维，提高实验技能，锻 炼动手能力。
➢ 掌握无菌操作，养成规范的实验室工 作习惯。
➢ 为将来适应多种领域的工作打基础。
9
鱼类细胞培养的基本条件
1. 温度 温度过低时细胞生长缓慢甚至不生长。利 用冷冻保藏细胞可保持细胞的原有分裂分 化能力。温度过高导致细胞死亡。这主要 是由酶和蛋白质所需要的最适温度决定的。 适宜的温度：25℃(温带鱼)、30℃(热带 鱼)、15℃(寒带鱼)、37 ℃(水生哺乳动 物)。
6. 气体交换 CO2培养箱, 调节CO2的比例为5%。
7. 去离子水/三次蒸馏水
14
鱼类细胞培养的基本条件
8. 无菌条件
体外细胞培养仅仅是对所
需的细胞进行培养，但环
境中（如空气）有各种其
他微生物，必须对所需细
胞进行无杂菌的隔离培养。
无菌条件是细胞离体培养
最基本的条件。
超净工作台
15
实验室仪器设备
23
三、准备玻片和染色
1. 用滴管吸取来自于步骤1-21的细胞悬液0.2mL 2. 滴在湿玻片上 3. 火焰上拖动，固定2-3次 4. 放在预热的切片烘干机上，15 min （蒸发液体） 5. 把装有1N HCl的染色缸，浸入60℃水浴中加热， 6. 把玻片插入培育 10min 7. 倾去HCl溶液 8. 用双蒸水清洗玻片2次 9. 空气干燥
要求：多查阅参考文献，实验中胆大心细。
17
修读要求
1．无菌操作，严格规范操作； 2．实验是连续性的，需要每天来观察
和处理细胞； 3. 每天来做实验的时间与老师和研究
生协商，各组时间要相对集中和固定。
18
实验一&二 思考题
1. 培养基过滤后需要加哪些物质？为什么？ 2. 为什么胰蛋白酶和培养基要过滤灭菌，
12
鱼类细胞培养的基本条件
4. 营养物 细胞培养基：培养基中含有细胞增殖和生
长所需要的各种物质。 常用培养基：MEM 、M199、L-15 等 动物细胞离体培养常常需要血清。血清提
供生长必需因子，如激素、微量元素、 矿物质和脂肪。 小牛血清；胎牛血清。
13
鱼类细胞培养的基本条件
5. 支持物 大多数动物细胞有贴壁生长的习 惯。 离体培养常用玻璃或塑料培养瓶 等作为支持物。
20
操作步骤
一、准备细胞
1. 接种细胞：T 75cm2 瓶子 1个 2. 培养24 h 3. 换10mL新鲜medium和0.1mL秋水仙素
（1μg/L） 4. 培养13-15h 5. 消化细胞，1000rpm离心，5分钟，收集沉淀
细胞 6. 加2 mL PBS混匀细胞 7. 将细胞悬液移到T 75cm2的培养瓶内
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鱼类细胞培养的基本条件
2. pH 过酸或过碱可导致细胞死亡。这主要与蛋 白质的变性和细胞膜的结构受损有关。 用 NaHCO3 和 Hepes 调节培养液的pH 至7.4左右。
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鱼类细胞培养的基本条件
3. 渗透压 细胞膜调节渗透压的能力是有限的。 需 用平衡盐溶液配制各种试剂。
常用的平衡盐溶液： PBS ：磷酸盐缓冲溶液 （phosphate buffered solution） D--Hanks
可以使细胞暂时脱离生长状态而将其细胞特性保存 起来，这样在需要的时候再复苏细胞用于实验。 • 适度地保存一定量的细胞，可以防止因正在培养的 细胞被污染或其他意外事件而使细胞丢种，起到了 细胞保种的作用。 • 可以利用细胞冻存的形式来购买、寄赠、交换和运 送某些细胞。
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冻存原理
• 细胞冻存时向培养基中加入保护剂 --- 终浓度5% - 15% 的二甲基亚砜（DMSO），可使溶液冰点 降低，加之在缓慢冻结条件下， 细胞内水分透出， 减少了冰晶形成， 从而避免细胞损伤。
不能高压灭菌 ？ 3. 生长培养基的pH值应为多少？呈什么颜
色？为什么？ 4. 为什么要培养基中需加入L- 谷氨酰胺？ 5. 为什么复苏细胞时，要迅速解冻？
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实验五 染色体制备
• 每一物种的细胞一般都具有一定数目、形 状和大小的染色体。
• 在秋水仙素的作用下可使分裂细胞阻断在 中期，此时染色体形态最典型，然后通过 低渗、固定、染色等步骤，便可在显微镜 下呈现出其形态。
实验室条件：干燥、紫外灯 仪器设备： • 高压灭菌锅: 用于高压灭菌 • 干燥箱: 用于干燥 • 超净工作台: 用于无菌操作 • 玻璃三蒸水器: 用于制三蒸馏水 • 恒温生化培养箱: 用于恒温培养细胞 • 倒置生物显微镜: 用于观察细胞生长 • 液氮罐：用于细胞长期保存
16Biblioteka 考核方法实验报告（论文格式） 一. 目的与意义 二. 材料与方法 三. 实验结果 四. 讨论（问题\经验\体会）
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8. 慢慢加10mL双蒸水（4℃） 9. 室温孵育10min 10. 慢慢加10mL现配的GAA固定液（冰醋酸：
甲醇＝1：3） 11. 室温放置10min 12. 移到一个离心管，1000 rpm离心，10min 13. 弃去上清，留约 2mL 14. 加3mL 新鲜固定液，轻轻混匀细胞 15. 1000rpm离心，5min 16. 弃去上清，留约 0.5mL
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10. 将玻片浸入装有Giemsa溶液的染色缸中（现 稀释的1：25）
11. 孵育 15 min 12. 用双蒸水冲洗玻片2-3次，除去残液 13. 空气干燥 14. 显微镜下观察计数
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实验六 细胞冻存
• 细胞冻存是细胞保存的主要方法之一。 • 利用冻存技术将细胞置于 -196℃液氮中低温保存，
• 采用“慢冻快融”的方法能较好地保证细胞存活。 标准冷冻速度开始为 -1 - -2℃/min， 当温度低于 - 25℃时可加速，到 - 80℃之后可直接投入液氮 内（-196℃）。
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操作步骤
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17. 加0.5mL 新鲜固定液，轻轻混匀细胞，然后加 4mL新鲜固定液，轻轻混匀
18. 孵育 5分钟 19. 1000 rpm离心，5分钟 20. 弃去 4.8mL 上清，仅留 0.2 mL 21. 加1-1.5mL新鲜固定液，轻轻混匀细胞沉淀
二、清洁玻片
1. 6-8个干净的玻片，浸泡在95% 乙醇里 2. 烘干 3. 浸泡在冰水里至少30 min