最新鱼类细胞工程基础
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实验室条件：干燥、紫外灯 仪器设备： • 高压灭菌锅: 用于高压灭菌 • 干燥箱: 用于干燥 • 超净工作台: 用于无菌操作 • 玻璃三蒸水器: 用于制三蒸馏水 • 恒温生化培养箱: 用于恒温培养细胞 • 倒置生物显微镜: 用于观察细胞生长 • 液氮罐：用于细胞长期保存
16
考核方法
实验报告（论文格式） 一. 目的与意义 二. 材料与方法 三. 实验结果 四. 讨论（问题\经验\体会）
22
17. 加0.5mL 新鲜固定液，轻轻混匀细胞，然后加 4mL新鲜固定液，轻轻混匀
18. 孵育 5分钟 19. 1000 rpm离心，5分钟 20. 弃去 4.8mL 上清，仅留 0.2 mL 21. 加1-1.5mL新鲜固定液，轻轻混匀细胞沉淀
二、清洁玻片
1. 6-8个干净的玻片，浸泡在95% 乙醇里 2. 烘干 3. 浸泡在冰水里至少30 min
10
鱼类细胞培养的基本条件
2. pH 过酸或过碱可导致细胞死亡。这主要与蛋 白质的变性和细胞膜的结构受损有关。 用 NaHCO3 和 Hepes 调节培养液的pH 至7.4左右。
11Baidu Nhomakorabea
鱼类细胞培养的基本条件
3. 渗透压 细胞膜调节渗透压的能力是有限的。 需 用平衡盐溶液配制各种试剂。
常用的平衡盐溶液： PBS ：磷酸盐缓冲溶液 （phosphate buffered solution） D--Hanks
6. 气体交换 CO2培养箱, 调节CO2的比例为5%。
7. 去离子水/三次蒸馏水
14
鱼类细胞培养的基本条件
8. 无菌条件
体外细胞培养仅仅是对所
需的细胞进行培养，但环
境中（如空气）有各种其
他微生物，必须对所需细
胞进行无杂菌的隔离培养。
无菌条件是细胞离体培养
最基本的条件。
超净工作台
15
实验室仪器设备
24
10. 将玻片浸入装有Giemsa溶液的染色缸中（现 稀释的1：25）
11. 孵育 15 min 12. 用双蒸水冲洗玻片2-3次，除去残液 13. 空气干燥 14. 显微镜下观察计数
25
实验六 细胞冻存
• 细胞冻存是细胞保存的主要方法之一。 • 利用冻存技术将细胞置于 -196℃液氮中低温保存，
不能高压灭菌 ？ 3. 生长培养基的pH值应为多少？呈什么颜
色？为什么？ 4. 为什么要培养基中需加入L- 谷氨酰胺？ 5. 为什么复苏细胞时，要迅速解冻？
19
实验五 染色体制备
• 每一物种的细胞一般都具有一定数目、形 状和大小的染色体。
• 在秋水仙素的作用下可使分裂细胞阻断在 中期，此时染色体形态最典型，然后通过 低渗、固定、染色等步骤，便可在显微镜 下呈现出其形态。
• 采用“慢冻快融”的方法能较好地保证细胞存活。 标准冷冻速度开始为 -1 - -2℃/min， 当温度低于 - 25℃时可加速，到 - 80℃之后可直接投入液氮 内（-196℃）。
27
操作步骤
要求：多查阅参考文献，实验中胆大心细。
17
修读要求
1．无菌操作，严格规范操作； 2．实验是连续性的，需要每天来观察
和处理细胞； 3. 每天来做实验的时间与老师和研究
生协商，各组时间要相对集中和固定。
18
实验一&二 思考题
1. 培养基过滤后需要加哪些物质？为什么？ 2. 为什么胰蛋白酶和培养基要过滤灭菌，
20
操作步骤
一、准备细胞
1. 接种细胞：T 75cm2 瓶子 1个 2. 培养24 h 3. 换10mL新鲜medium和0.1mL秋水仙素
（1μg/L） 4. 培养13-15h 5. 消化细胞，1000rpm离心，5分钟，收集沉淀
细胞 6. 加2 mL PBS混匀细胞 7. 将细胞悬液移到T 75cm2的培养瓶内
2012鱼类细胞工程基础
课程安排
2
本实验课的目的
➢ 培养实验的思维，提高实验技能，锻 炼动手能力。
➢ 掌握无菌操作，养成规范的实验室工 作习惯。
➢ 为将来适应多种领域的工作打基础。
9
鱼类细胞培养的基本条件
1. 温度 温度过低时细胞生长缓慢甚至不生长。利 用冷冻保藏细胞可保持细胞的原有分裂分 化能力。温度过高导致细胞死亡。这主要 是由酶和蛋白质所需要的最适温度决定的。 适宜的温度：25℃(温带鱼)、30℃(热带 鱼)、15℃(寒带鱼)、37 ℃(水生哺乳动 物)。
21
8. 慢慢加10mL双蒸水（4℃） 9. 室温孵育10min 10. 慢慢加10mL现配的GAA固定液（冰醋酸：
甲醇＝1：3） 11. 室温放置10min 12. 移到一个离心管，1000 rpm离心，10min 13. 弃去上清，留约 2mL 14. 加3mL 新鲜固定液，轻轻混匀细胞 15. 1000rpm离心，5min 16. 弃去上清，留约 0.5mL
12
鱼类细胞培养的基本条件
4. 营养物 细胞培养基：培养基中含有细胞增殖和生
长所需要的各种物质。 常用培养基：MEM 、M199、L-15 等 动物细胞离体培养常常需要血清。血清提
供生长必需因子，如激素、微量元素、 矿物质和脂肪。 小牛血清；胎牛血清。
13
鱼类细胞培养的基本条件
5. 支持物 大多数动物细胞有贴壁生长的习 惯。 离体培养常用玻璃或塑料培养瓶 等作为支持物。
可以使细胞暂时脱离生长状态而将其细胞特性保存 起来，这样在需要的时候再复苏细胞用于实验。 • 适度地保存一定量的细胞，可以防止因正在培养的 细胞被污染或其他意外事件而使细胞丢种，起到了 细胞保种的作用。 • 可以利用细胞冻存的形式来购买、寄赠、交换和运 送某些细胞。
26
冻存原理
• 细胞冻存时向培养基中加入保护剂 --- 终浓度5% - 15% 的二甲基亚砜（DMSO），可使溶液冰点 降低，加之在缓慢冻结条件下， 细胞内水分透出， 减少了冰晶形成， 从而避免细胞损伤。
23
三、准备玻片和染色
1. 用滴管吸取来自于步骤1-21的细胞悬液0.2mL 2. 滴在湿玻片上 3. 火焰上拖动，固定2-3次 4. 放在预热的切片烘干机上，15 min （蒸发液体） 5. 把装有1N HCl的染色缸，浸入60℃水浴中加热， 6. 把玻片插入培育 10min 7. 倾去HCl溶液 8. 用双蒸水清洗玻片2次 9. 空气干燥
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考核方法
实验报告（论文格式） 一. 目的与意义 二. 材料与方法 三. 实验结果 四. 讨论（问题\经验\体会）
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17. 加0.5mL 新鲜固定液，轻轻混匀细胞，然后加 4mL新鲜固定液，轻轻混匀
18. 孵育 5分钟 19. 1000 rpm离心，5分钟 20. 弃去 4.8mL 上清，仅留 0.2 mL 21. 加1-1.5mL新鲜固定液，轻轻混匀细胞沉淀
二、清洁玻片
1. 6-8个干净的玻片，浸泡在95% 乙醇里 2. 烘干 3. 浸泡在冰水里至少30 min
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鱼类细胞培养的基本条件
2. pH 过酸或过碱可导致细胞死亡。这主要与蛋 白质的变性和细胞膜的结构受损有关。 用 NaHCO3 和 Hepes 调节培养液的pH 至7.4左右。
11Baidu Nhomakorabea
鱼类细胞培养的基本条件
3. 渗透压 细胞膜调节渗透压的能力是有限的。 需 用平衡盐溶液配制各种试剂。
常用的平衡盐溶液： PBS ：磷酸盐缓冲溶液 （phosphate buffered solution） D--Hanks
6. 气体交换 CO2培养箱, 调节CO2的比例为5%。
7. 去离子水/三次蒸馏水
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鱼类细胞培养的基本条件
8. 无菌条件
体外细胞培养仅仅是对所
需的细胞进行培养，但环
境中（如空气）有各种其
他微生物，必须对所需细
胞进行无杂菌的隔离培养。
无菌条件是细胞离体培养
最基本的条件。
超净工作台
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实验室仪器设备
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10. 将玻片浸入装有Giemsa溶液的染色缸中（现 稀释的1：25）
11. 孵育 15 min 12. 用双蒸水冲洗玻片2-3次，除去残液 13. 空气干燥 14. 显微镜下观察计数
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实验六 细胞冻存
• 细胞冻存是细胞保存的主要方法之一。 • 利用冻存技术将细胞置于 -196℃液氮中低温保存，
不能高压灭菌 ？ 3. 生长培养基的pH值应为多少？呈什么颜
色？为什么？ 4. 为什么要培养基中需加入L- 谷氨酰胺？ 5. 为什么复苏细胞时，要迅速解冻？
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实验五 染色体制备
• 每一物种的细胞一般都具有一定数目、形 状和大小的染色体。
• 在秋水仙素的作用下可使分裂细胞阻断在 中期，此时染色体形态最典型，然后通过 低渗、固定、染色等步骤，便可在显微镜 下呈现出其形态。
• 采用“慢冻快融”的方法能较好地保证细胞存活。 标准冷冻速度开始为 -1 - -2℃/min， 当温度低于 - 25℃时可加速，到 - 80℃之后可直接投入液氮 内（-196℃）。
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操作步骤
要求：多查阅参考文献，实验中胆大心细。
17
修读要求
1．无菌操作，严格规范操作； 2．实验是连续性的，需要每天来观察
和处理细胞； 3. 每天来做实验的时间与老师和研究
生协商，各组时间要相对集中和固定。
18
实验一&二 思考题
1. 培养基过滤后需要加哪些物质？为什么？ 2. 为什么胰蛋白酶和培养基要过滤灭菌，
20
操作步骤
一、准备细胞
1. 接种细胞：T 75cm2 瓶子 1个 2. 培养24 h 3. 换10mL新鲜medium和0.1mL秋水仙素
（1μg/L） 4. 培养13-15h 5. 消化细胞，1000rpm离心，5分钟，收集沉淀
细胞 6. 加2 mL PBS混匀细胞 7. 将细胞悬液移到T 75cm2的培养瓶内
2012鱼类细胞工程基础
课程安排
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本实验课的目的
➢ 培养实验的思维，提高实验技能，锻 炼动手能力。
➢ 掌握无菌操作，养成规范的实验室工 作习惯。
➢ 为将来适应多种领域的工作打基础。
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鱼类细胞培养的基本条件
1. 温度 温度过低时细胞生长缓慢甚至不生长。利 用冷冻保藏细胞可保持细胞的原有分裂分 化能力。温度过高导致细胞死亡。这主要 是由酶和蛋白质所需要的最适温度决定的。 适宜的温度：25℃(温带鱼)、30℃(热带 鱼)、15℃(寒带鱼)、37 ℃(水生哺乳动 物)。
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8. 慢慢加10mL双蒸水（4℃） 9. 室温孵育10min 10. 慢慢加10mL现配的GAA固定液（冰醋酸：
甲醇＝1：3） 11. 室温放置10min 12. 移到一个离心管，1000 rpm离心，10min 13. 弃去上清，留约 2mL 14. 加3mL 新鲜固定液，轻轻混匀细胞 15. 1000rpm离心，5min 16. 弃去上清，留约 0.5mL
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鱼类细胞培养的基本条件
4. 营养物 细胞培养基：培养基中含有细胞增殖和生
长所需要的各种物质。 常用培养基：MEM 、M199、L-15 等 动物细胞离体培养常常需要血清。血清提
供生长必需因子，如激素、微量元素、 矿物质和脂肪。 小牛血清；胎牛血清。
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鱼类细胞培养的基本条件
5. 支持物 大多数动物细胞有贴壁生长的习 惯。 离体培养常用玻璃或塑料培养瓶 等作为支持物。
可以使细胞暂时脱离生长状态而将其细胞特性保存 起来，这样在需要的时候再复苏细胞用于实验。 • 适度地保存一定量的细胞，可以防止因正在培养的 细胞被污染或其他意外事件而使细胞丢种，起到了 细胞保种的作用。 • 可以利用细胞冻存的形式来购买、寄赠、交换和运 送某些细胞。
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冻存原理
• 细胞冻存时向培养基中加入保护剂 --- 终浓度5% - 15% 的二甲基亚砜（DMSO），可使溶液冰点 降低，加之在缓慢冻结条件下， 细胞内水分透出， 减少了冰晶形成， 从而避免细胞损伤。
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三、准备玻片和染色
1. 用滴管吸取来自于步骤1-21的细胞悬液0.2mL 2. 滴在湿玻片上 3. 火焰上拖动，固定2-3次 4. 放在预热的切片烘干机上，15 min （蒸发液体） 5. 把装有1N HCl的染色缸，浸入60℃水浴中加热， 6. 把玻片插入培育 10min 7. 倾去HCl溶液 8. 用双蒸水清洗玻片2次 9. 空气干燥