《细胞原代培养》PPT课件
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细胞培养基本技术ppt课件
切割：用平衡盐溶液将取出的组织块清洗三次，然后用眼科 手术剪刀仔细将组织反复剪碎，直到成1mm3左右的小块，再 用平衡盐溶液清洗，洗到组织块发白为止。静置数分钟，使 组织块自然沉淀到管底，弃去上清
消化、接种培养：加入0.25％胰蛋白酶消化液（5-10倍量）， 与组织块混匀。置37℃水浴，观察消化情况（每隔几分钟摇 动一下试管），静止，吸去上清，加入5～10ml细胞培养液， 用吸管吹打混匀，移入二个培养瓶中，置于二氧化碳培养箱 中培养
（2）例如：滋养层细胞分离与培养：
（A）真空负压抽吸的早期绒毛组织在无菌条件下置于 冰浴PBS（含1 mM葡萄糖）中取回。
（B）在无菌条件下立即用无Ca2+和Mg2+的PBS漂洗1520次以除去血块。
（C）用解剖刀片从基膜上轻轻刮下绒毛，用剪刀剪碎 至1-2毫米左右。
（D）加入5 ％胰蛋白酶330μl(1：25)至10ml细胞悬液 中，4℃消化45min。勿动，静置，然后去上清。
第三章 细胞培养基本技术
况海斌
南昌大学医学院生理学教研室 生殖内分泌研究室
内容：
原代细胞分离、培养（酶消化法和组织块培养 法）。 细胞生长状况的观察。 培养细胞一代生长过程。 传代。 冻存与复苏。 细胞培养注意事项（如细胞污染）。
细胞培养的一些专业术语介绍（如 细胞株、系，上皮细胞型、成纤维细胞型）
（E）重新加入消化液37℃消化10min。勿动，静置，然 后去一半上清。加等体积Ham’s F12:DMEM 1:1(FD)培 养液（内含10 ％胎牛血清、1 mM丙酮酸钠和2 mM谷氨 酰胺）终止消化，吹打细胞悬液。
（F）再加入终浓度为15 IU/ml的DNA酶Ⅰ37℃消化10 min。吹打细胞呈悬浮状，经80目和150目细胞筛过滤， 1,000×rpm离心10 min收集细胞。
消化、接种培养：加入0.25％胰蛋白酶消化液（5-10倍量）， 与组织块混匀。置37℃水浴，观察消化情况（每隔几分钟摇 动一下试管），静止，吸去上清，加入5～10ml细胞培养液， 用吸管吹打混匀，移入二个培养瓶中，置于二氧化碳培养箱 中培养
（2）例如：滋养层细胞分离与培养：
（A）真空负压抽吸的早期绒毛组织在无菌条件下置于 冰浴PBS（含1 mM葡萄糖）中取回。
（B）在无菌条件下立即用无Ca2+和Mg2+的PBS漂洗1520次以除去血块。
（C）用解剖刀片从基膜上轻轻刮下绒毛，用剪刀剪碎 至1-2毫米左右。
（D）加入5 ％胰蛋白酶330μl(1：25)至10ml细胞悬液 中，4℃消化45min。勿动，静置，然后去上清。
第三章 细胞培养基本技术
况海斌
南昌大学医学院生理学教研室 生殖内分泌研究室
内容：
原代细胞分离、培养（酶消化法和组织块培养 法）。 细胞生长状况的观察。 培养细胞一代生长过程。 传代。 冻存与复苏。 细胞培养注意事项（如细胞污染）。
细胞培养的一些专业术语介绍（如 细胞株、系，上皮细胞型、成纤维细胞型）
（E）重新加入消化液37℃消化10min。勿动，静置，然 后去一半上清。加等体积Ham’s F12:DMEM 1:1(FD)培 养液（内含10 ％胎牛血清、1 mM丙酮酸钠和2 mM谷氨 酰胺）终止消化，吹打细胞悬液。
（F）再加入终浓度为15 IU/ml的DNA酶Ⅰ37℃消化10 min。吹打细胞呈悬浮状，经80目和150目细胞筛过滤， 1,000×rpm离心10 min收集细胞。
高中生物精品资源动物细胞工程第二节 原代细胞培养课件高中生物竞赛
(2) 原代细胞培养的首次传代
原代培养后由于悬浮细胞增殖，数量增加甚至达 饱和密度；贴壁细胞的相互汇合，使整个瓶底逐渐被 细胞覆盖，细胞难以继续生长繁殖，需要进行分瓶培 养传代。
(3)传代细胞的传代培养
传代细胞，可根据不同细胞采取不同的方法进 行细胞传代。
贴壁生长的细胞用消化法传代，部分贴壁的细 胞用直接吹打传代。
人工纯化主要有以下5种方法
（1）细胞因子依赖纯化法：通过加入某些特殊的细 胞因子而纯化出只依赖于这种细胞因子生长的细胞 系。
（2）酶消化法：利用上皮细胞和成纤维细胞对胰蛋 白酶的耐受性不同，使两者分开，达到纯化的目的。 另外对贴壁细胞与半贴壁及粘附细胞间的分离纯化 也是十分有效的。
例1：上皮细胞与成纤维细胞的分离纯化 例2：骨髓基质肌样细胞的纯化
• 3）ACCUTASE™ 细胞消化液 包含有蛋白水解酶和胶原酶活性，是胰酶/EDTA消化液的完美替 换产品，用于从常规组织培养器皿和粘附培养器皿中消化细胞。
与传统的胰酶消化液相比，本品具有以下优势：
1）适用于绝大多数原代细胞和哺乳动物细胞系的消化，以及昆 虫细胞；
2）温和有效的消化干细胞（hESCs和mESCs），冻存后细胞具更 高复苏率；
2.
消 化 培 养 法
3.悬浮细胞培养法 对于悬浮生长的细胞，如白血病细胞、淋巴细胞、
骨髓细胞、胸水和腹水中的癌细胞和免疫细胞无需消 化，可采用低速离心分离，直接培养，或经淋巴细胞 分层液分离后接种培养。
三 原代细胞和传代的培养和维持
1.原代细胞的维持
贴壁细胞长成网状或基本单层时，未达到饱和密度，需采 取换液方式来更新营养成分以满足细胞继续生长繁殖的需要。 换入等量完全培养基或换成含2%小牛血清的维持液。悬浮 细胞培养基中不仅会发生转化而且会发生分裂繁殖，此时培 养基中的营养成分并不能维持细胞的营养需求，需进行换液。 通常采用半量换液的方法。
细胞培养1ppt课件
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培养细胞生长的条件
1 细胞的营养需要 2 细胞的生存环境 温度: 37 ℃
O2
CO2: 5%
CO2 +H2O ← →H2CO3 ← →H+ + HCO3-
pH: 7.2-7.4
渗透压
3 无污染 4 无毒
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实验准备
实验用品：
超净工作台，压力蒸汽消毒器，电热干燥箱，滤器， 酸缸
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滤器
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CO2培养箱
CO2培养箱设定的条件为37 ℃ ，5％CO2 。 使用CO2培养箱培养细胞时应注意的问题：
①用螺旋口瓶培养细胞时，需将瓶盖 微松，以保证通气。
②保持培养箱内空气干净。定期消毒
（90 ℃ ，14 h)。
③箱内火菌蒸馏水3000毫升蒸馏水槽中 以保持箱内湿度，避兔培养液蒸发。
天然培养基：
天然培养基有血清、血浆、和组织提取液（如鸡胚和牛胚浸液）。
优点：营养成分丰富，培养效果好
缺点：来源受限。
成分复杂，影响对某些实验产物的提取和实验结果的分析。
易发生支原体污染
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合成培养基
合成培养基是根据细胞生存所需物质的种类和数
量，用人工方法模拟合成的。目前已设计出许多种培
器官培养：使用器官原基或器官的一部分或整 个器宫
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3
原代培养细胞的生命归宿
原代培养期 传代期 衰退期
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4
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5
有限细胞系，无限细胞系 细胞系 cell line 细胞株 cell strain
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3.过滤
• 用400目不锈钢筛网过滤 • 收集滤液于离心管 4.离心 • 平衡、离心5min，1000～1500 rpm • 去上清，加PBS，混匀，离心（同上） • 重复上一步 5.接种 • 去上清，加3～5ml培养基，混匀，接种于培养瓶 • 加培养基3～5mm深，盖紧盖，观察细胞密度 6.培养
针头）
有机试剂过滤除菌，常用0.22µm • 超净工作台
紫外灯照射30min以上 • 培养室
紫外灯照射2～3h/天
操作步骤
1.取材 • 75％酒精浸泡乳鼠2min，取肝脏于平皿中 • PBS溶液洗涤3次 • 去除液体后，剪碎成1～2mm3小块 2.消化 • 加5～8倍组织量的胰蛋白酶溶液 • 转移到离心管内，加盖 • 37℃水浴15min，每5min摇晃1次 • 终止消化：加1ml含血清的培养基DMEM
• 超净工作台 紫外消毒，鼓风，保持干净、整洁
• 高压锅 用电，带压力表，自动恒压，掌握时间
橡胶、塑料、药品——15’，金属——20’ • 培养瓶
玻璃瓶和塑料瓶，洗涤要干净，临时消毒
• 培养基 a.天然培养基：血清、胚胎浸出液、水解乳蛋白等 b.合成培养基：DMEM、RPMI1640、199培养基等 c.无血清培养基：Ham F12和DMEM混合的基础培 养基、自行设计与配制的培养基（加其他成分）
a.组织块法：直接将组织块接种于培养瓶， 24小时就有细胞向四周游出。 简便、易行，适合于来源有限、数量较少 的组织做原代细胞培养
b.消化法
• 用酶消化、分解妨碍细胞生长的间质（基 质、纤维等），形成单个细胞或细胞团
• 对上皮、肝、肾、胚胎等间质少、较软组 织选择胰蛋白酶
• 对骨、前列腺、癌组织等纤维多、较硬的 组织可用胶原酶
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• 超净工作台 紫外消毒，鼓风，保持干净、整洁 • 高压锅 用电，带压力表，自动恒压，掌握时间 橡胶、塑料、药品——15’，金属——20’ • 培养瓶 玻璃瓶和塑料瓶，洗涤要干净，临时消毒 • 培养基 a.天然培养基：血清、胚胎浸出液、水解乳蛋白等 b.合成培养基：DMEM、RPMI1640、199培养基等 c.无血清培养基：Ham F12和DMEM混合的基础培 养基、自行设计与配制的培养基长的间质（基 质、纤维等），形成单个细胞或细胞团 • 对上皮、肝、肾、胚胎等间质少、较软组 织选择胰蛋白酶 • 对骨、前列腺、癌组织等纤维多、较硬的 组织可用胶原酶
• 短时间内可获得大量活细胞
主要实验器材
• 培养箱 二氧化碳恒温箱，5％CO2，37℃，保持湿 度，消毒灭菌。 • 倒置显微镜 可观察活细胞，直接观察培养瓶或培养板， 带拍摄等功能。 • 离心机 普通离心机（500～4000rpm），高速离心 机（1000～15000），冷冻离心机等 （离心力转换成转速： g ＝1.118×r2×10－5）
• 用400目不锈钢筛网过滤 • 收集滤液于离心管 4.离心 • 平衡、离心5min，1000～1500 rpm • 去上清，加PBS，混匀，离心（同上） • 重复上一步 5.接种 • 去上清，加3～5ml培养基，混匀，接种于培养瓶 • 加培养基3～5mm深，盖紧盖，观察细胞密度 6.培养 放入培养箱，2天后观察，换液。
操作步骤
1.取材 • 75％酒精浸泡乳鼠2min，取肝脏于平皿中 • PBS溶液洗涤3次 • 去除液体后，剪碎成1～2mm3小块 2.消化 • 加5～8倍组织量的胰蛋白酶溶液 • 转移到离心管内，加盖 • 37℃水浴15min，每5min摇晃1次 • 终止消化：加1ml含血清的培养基DMEM
3.过滤
其它常用液
• 消化液 0.25％胰蛋白酶溶液、0.02%EDTA溶液、胶原酶。 • 消化酶抑制剂 0.1％～0.5％大豆胰酶抑制剂 • NaHCO3溶液 常用浓度7.4％、5.6％、3.7％ • HEPES溶液（羟乙基哌嗪乙硫磺酸） 终浓度10～50 mmol/L • 抗生素液 青霉素和链霉素二者的终浓度都达到100U/ml
• 胶塞和塑料用品清洗 清水浸泡后，2％NaOH溶液煮沸10min, 自来水冲洗、晾干，1％稀盐酸浸泡30min, 自来水冲洗，双蒸水冲3次，晾干、包装。 二、物品包装 同类物品包装一起，大小合适，包扎紧 凑，多层包装，写上标签
三、消毒
• 器具常用压力蒸汽灭菌 掌握时间：煮沸10～20min • 试剂消毒 无机试剂可用压力蒸汽灭菌（插5～7＃ 针头） 有机试剂过滤除菌，常用0.22µm • 超净工作台 紫外灯照射30min以上 • 培养室 紫外灯照射2～3h/天
主要实验准备工作
一、培养用具的清洗 • 浸泡 清水浸泡数小时，新玻璃器皿泡5％稀盐酸12h以 上（中和表面碱性物质） • 洗刷 洗洁精、软毛刷，轻刷、多次、彻底 • 浸酸（由重铬酸钾、浓硫酸和蒸馏水配制） 灌满，6h以上，最好过夜，去污好 • 冲洗 充分，灌满-倒出10次以上，最后蒸馏水冲 2～3次，烘干、包装。
细胞的原代培养
（研究生实验教学）
实验目的
• 熟悉细胞培养的基本条件和准备工作
• 熟悉并掌握原代培养中取材、消化、收集 细胞和接种等基本实验技术
• 了解细胞原代培养的原理及其方法
实验原理
• 原代培养（primary culture） 从供体取得组织细胞在体外首次培养。 细胞分化、药物测试、细胞株建立等 • 基本方法 组织块法和消化法 a.组织块法：直接将组织块接种于培养瓶， 24小时就有细胞向四周游出。 简便、易行，适合于来源有限、数量较少 的组织做原代细胞培养