1293462556几丁质酶

几丁质酶(chitinase)是以几丁质(chitin)为作用底物的水解酶。几丁质又称甲壳素或甲壳质,存在于节肢动物、线虫和软体动物的体壁、真菌细胞壁(除卵菌)和一些藻类等生物的细胞壁中。在昆虫中,几丁质是围食膜及体壁的主要组成成分之一,通过几丁质酶对其有规律地降解以保证昆虫正常生长发育。如果编码该酶的基因在不适当的时候表达或该表达时未表达,都会对昆虫造成伤害。由于植物中不含几丁质,因此在植物害虫防治中,昆虫几丁质是几丁质酶的一个极具吸引力的作用靶标。

一、昆虫几丁质酶生物化学与生理作用

昆虫几丁质酶存在于中肠、蜕皮腺及某些昆虫的毒腺中,是一种糖蛋白,可以水解昆虫体壁和中肠中的几丁质,酶切位点通常随机发生在链中间的任何一个部位,其最终产物是可溶低分子量的GlcNAC寡聚物。昆虫蜕皮时约有90%的几丁质被降解,几丁质酶和几丁质之间的作用是一种动态过程,包括经过几丁质结合区(CBD)的吸附过程、水解过程、解吸附作用及活性催化区在作用底物表面的配置过程。昆虫几丁质酶除能降解几丁质外,还担负许多重要生理功能,如昆虫肠道组织中的几丁质酶具有分解肠内和围食膜的几丁质和消化作用。昆虫几丁质酶分泌到肠道中,以无活性酶原形式存在,在需要时被胰蛋白酶激活而降解围食膜。蜕皮腺中的几丁质酶可以调节昆虫在生长发育中周期性蜕皮并合成新表皮。毒腺中的几丁质酶有助于毒腺物质在取食对象的组织中扩散渗透。

二、昆虫几丁质酶分子特征

1993年,编码昆虫几丁质酶的cDNA序列首次从烟草天蛾Manduca sexta中克隆出来。目前已克隆得到烟草天蛾、家蚕Bombyx mori和美国白蛾Hyphantria cunea等十几种昆虫的几丁质酶cDNA序列。这些克隆的基因主要集中在鳞翅目昆虫中,双翅目、鞘翅目和膜翅目仅有少数几丁质酶基因被克隆的报道。昆虫几丁质酶分子量在40~85kDa之间,比植物几丁质酶(25~40kDa)和细菌几丁质酶(20~60kDa)大。酶活性范围为pH4~8,等电点在5~7之间,大都属于18家族几丁质酶。昆虫几丁质酶为多结构域蛋白,一般都包含信号肽区、一个或多个N-端催化区、富含丝氨酸和苏氨酸(S/T)的糖基化位点区(linker区)、一个或多个fibronectin-like区和C-端富含半胱氨酸(Cys)的几丁质结合区(CBD)。但不同昆虫的几丁质酶,其多区结构有所不同,如一种寄生蜂Chelonus sp.的几丁质酶大小为52kDa,有一个富含丝氨酸和苏氨酸的区域,但缺少C-端富含半胱氨酸的区域。这些结构域构成上的变化以及氨基酸序列的不同导致了昆虫几丁质酶在最适pH、催化活性、对几丁质的亲合力及稳定性方面的差异。昆虫几丁质酶的多个结构区独自发挥功能,互不影响,其中N-端催化区序列具有保守性,决定酶的催化活性。连接N-端催化区和几丁质结合区的linker区,是经过O-位高度糖基化修饰,而催化区只是适度的N-位糖基化修饰,linker区使几丁质酶易于分泌到细胞外,并且在有蛋白水解酶存在的情况下,保持几丁质酶的稳定性。几丁质结合区(CBD)基本功能是使几丁质酶结合不溶性的底物并提高降解效率。具有多个CDB区时,能增强昆虫几丁质酶对大分子不溶底物的结合能力及作用活性,提高催化区在水解不溶性底物时的催化效率,linker区也可能影响碳水化合物结合区的功能。昆虫几丁质酶的CBD约为65个氨基酸,且不同的昆虫几丁质酶CBD序列有高度的相似性,其中6个Cys最为保守,存在于所有昆虫几丁质酶的CBD中。研究表明, 几丁质酶的活性仅与活性催化区有关,而昆虫几丁质酶与体壁和中肠几丁质的相互作用依赖于几丁质结合区和活性催化区同等、共同的作用。昆虫几丁质酶中有几个重要的氨基酸残基保守位点:W145,D144,E146和D142。W145维持几丁质酶催化区域结构,对酶的催化活性产生重要影响。如以甘氨酸替代则活性完全丧失,但是W145对几丁质酶与几丁质之间的结合并不是必需的。E146在水解中起酸碱催化剂的作用,D144维持一种电离平衡,D142影响几丁质酶最适pH值,该位点的突变可使几丁质酶最适PH由碱性变为酸性。三、昆虫几丁质酶基因的体内表达

昆虫几丁质酶的表达受蜕皮激素的诱导,而保幼激素抑制其表达。研究表明,在没有几丁

质酶基因表达的虫期,蜕皮激素类似物(RH5992)能够诱导云杉卷叶蛾几丁质酶基因的表达,在诱导36h后表达量最大,且几丁质酶基因仅在体壁表达,这种现象可能是因为诱导表达是一种间接表达,需要某些只在体壁才具有的因子参与。在昆虫生长发育过程中,几丁质酶表达具有组织特异性。Northern杂交在云杉卷叶蛾体壁和脂肪体中检测到几丁质酶mRNA的表达;通过Western杂交在体壁和中肠中检测到了几丁质酶蛋白质。RT-PCR分析表明,棉铃虫Heliothisarmigera体壁、肠道、脂肪体中存在几丁质酶基因转录产物。表达水平随昆虫不同生长发育阶段而变化。蜕皮液中的几丁质酶仅仅是在幼虫-幼虫、幼虫-蛹和蛹-成虫期的蜕皮前短暂时间内表现活性,且在蜕皮前达到高峰。

四、影响昆虫几丁质酶活性因素

温度、pH、紫外线等因子均可影响昆虫几丁质酶的活性。昆虫几丁质酶pH范围较宽,以便其能在微酸(血淋巴)和微碱性环境(内脏)中起作用。大部分植物、细菌和动物来源的几丁质酶最适宜的几丁质酶pH约为6。昆虫几丁质酶在pH为4~8范围内具有活性,等电点为5~7。在30~60℃之间昆虫几丁质酶活性较高且持久,温度超过60℃活性迅速降低。果蝇Drosophila hydei几丁质酶最适宜的pH为5.5~6.2,最适宜温度为35℃;Locusta migratoria几丁质酶最适宜的pH为4~5,最适温度约为50℃。作用底物不同时,昆虫几丁质酶表达的适宜pH、温度也存在差异。家蚕54 kDa几丁质酶作用于短底物N-acetylchitopentaose(GlcNAc5)时,最适pH为6.0,最适温度为60℃;作用于长底物glycolchitin、pH为9.5~10.0时酶活性高,pH为4.0时活性低。另外,在最适PH值情况下,作用于GlcNAc5时,家蚕的65 kDa和88 kDa两种几丁质酶在60℃时都表现出了高活性。pH值对昆虫几丁质酶活性的影响,可能是因为昆虫几丁质酶在多区结构及氨基酸序列方面的不同造成的。某些二价阳离子也影响昆虫几丁质酶的活性。9 mMHgCl2抑制家蚕65 kDa和88 kDa几丁质酶活性分别达58%和72%,但9 mM CuSO4只能抑制65 kDa几丁质酶43%活性,而对88 kDa几丁质酶无抑制作用。2.3 mM EDTA 对65 kDa和88 kDa几丁质酶几乎都没有影响。除以上几种影响因素外,昆虫不同部位的几丁质酶其活性也不一样。如果蝇体壁、肠道和脂肪体中的几丁质酶都有活性,但在体壁中的具有最高的活性,脂肪体中的仅有微弱的活性。

五、昆虫几丁质酶在植物害虫防治上的应用前景

当前,几丁质酶在植物保护中的应用研究方兴未艾。对昆虫几丁质酶的利用,包括使昆虫体内的几丁质酶水平低于或高于正常水平两个方面,从而扰乱昆虫正常的生长发育节律,甚至使昆虫死亡。Blattner-R等合成了几丁质酶的抑制剂al-losamidin,用它对幕衣蛾Tineola biselliella幼虫进行实验,发现暴露于alosamidin的幕天蛾幼虫比对照具有更高的致死率。1.几丁质酶的增效作用从上世纪70年代开始,人们就

已知道细菌几丁质酶能增强昆虫病原微生物的效力。研究中发现,昆虫几丁质酶也能增强Bt转基因植物的抗虫效果。Ding等(1998)将烟草大蛾几丁质酶基因导入烟草中,用转基因烟草喂食烟草蚜虫和烟草天蛾幼虫,蚜虫幼虫生物量及成活率都显著下降,但对天蛾幼虫似乎没有明显影响。当用亚致死浓度的Bt制剂处理转基因烟草来喂食蚜虫和天蛾幼虫,烟草叶片的损失量明显少于单独使用Bt的非转基因烟草,两种昆虫的生长都受到显著抑制。Shapiro 等(1987)研究发现几丁质酶能显著增强杆状病毒LdMNPV对舞毒蛾Lymantria dispar的致死作用。在NPV制剂中添加1%的几了质酶,14d幼虫死亡率即达到50%,而单用NPV制剂21d 幼虫死亡率仅为50%。观察14d和21d的死亡情况,加入0.001%、0.01%、0.1%和1%几丁质酶的NPV比不加几丁质酶的LC50分别下降了1.3,2.0,3.2和5.4倍。有人用带有烟草天蛾几丁质酶基因的AcMNPV病毒去注射草地贪夜蛾幼虫,发现死亡率明显高于单独使用野生型AcMNPV处理的对照组。

2.转昆虫几丁质酶基因植物的培育目前,转几丁质酶

基因的研究主要集中在植物方面,其目的基因也主要来自于植物。研究表明,一些细菌和