Kras基因突变检测试剂盒说明书
Kras基因突变检测试剂盒说明书
人类K-ras基因突变检测试剂盒(PCR-熔解曲线法)说明书【产品名称】通用名:人类K-ras基因突变检测试剂盒(PCR-熔解曲线法)英文名:Diagnostic kit for Mutations of Human K-ras Gene(PCR-Melting Curve Analysis)【包装规格】20测试/盒【预期用途】K-ras基因位于12号染色体短臂上,是重要的癌基因之一,编码一种21kD 的kras蛋白,参与细胞内的信号传递,主要包括PI3K/PTEN/AKT 和RAF/MEK/ERK信号转导途径,这些转导途径是当前肿瘤靶向药物研究的热点,靶向药物通过抑制这些途径发生药理作用。
K-ras基因第12和13密码子发生突变,将导致kras蛋白变异并处于持续激活状态,使药物失效。
据中国2010版《肿瘤学临床实践指南》,在一项包含101例肺腺癌亚型细支气管肺泡癌患者的回顾性研究中,所有患者均接受厄洛替尼单药一线治疗。
K-ras突变者无一例缓解(0/18),而无K-ras突变者则有20例缓解(20/62,32%),差别有统计学意义(P <0.01)。
因此,指南建议,非小细胞肺癌和结直肠癌患者使用靶向药物前应进行K-ras基因突变状态的检测。
本试剂盒以人非小细胞肺癌、结直肠癌肿瘤组织切片提取的基因组DNA为检测样本,用于检测肿瘤组织K-ras基因第12,13密码子的12种体细胞突变(表1),提供突变状态的定性结果。
为临床肿瘤靶向药物的个体化用药提供辅助诊断依据,本品适用于进入个体化靶向治疗疗程前的患者使用。
表1 本品可检测的K-ras基因突变【检验原理】本试剂盒基于实时PCR平台,结合了特异引物、荧光探针和熔解曲线技术,定性检测DNA样品中K-ras 基因12,13密码子是否存在突变。
用一对K-ras基因特异引物,该引物可扩增12种突变型和野生型的K-ras目标序列,利用标记了FAM荧光基团和淬灭基团的双标记探针一方面抑制野生型基因的扩增,提高突变基因的检测灵敏度,另一方面在扩增后用熔解曲线法实现对扩增产物的分析,荧光探针在未杂交时因荧光基团和淬灭基团相互接近而被淬灭,不发荧光,杂交状态时,二者相互离开而产生荧光。
人类KRAS7种突变检测试剂盒(荧光PCR法)说明书-P4.2-12T-2015.10.09
人类KRAS基因7种突变检测试剂盒(荧光PCR法)说明书【产品名称】通用名称:人类KRAS基因7种突变检测试剂盒(荧光PCR法)英文名称:Human KRAS Gene 7 Mutations Fluorescence Polymerase Chain Reaction (PCR) Diagnostic Kit【包装规格】12测试/盒【预期用途】KRAS基因是人体肿瘤中常见的致癌基因。
该基因的突变常见于多种恶性肿瘤,在肺癌患者中的突变率为15~30%,在结直肠癌患者中的突变率为20~50%。
导致KRAS处于激活状态的突变主要位于第12和13密码子上。
KRAS 基因突变一般会使肺癌患者对EGFR酪氨酸激酶抑制剂产生耐药,使结直肠癌患者对抗EGFR抗体类药物产生耐药。
但是,2010年10月的最新研究发现第13密码子上的Gly13Asp(G13D)突变亦对抗EGFR抗体类药物有治疗反应性(参见:De Roock. W. JAMA. 2010;304(16):1812-1820)。
因此,KRAS基因突变检测能提高肿瘤临床治疗的针对性,降低治疗费用,节省宝贵的治疗时间。
大部分肿瘤的突变都是体细胞突变,突变细胞往往与野生型细胞混杂在一起,因此所提取的DNA常带有大量野生型DNA,所以对体细胞突变检测需要较高的特异性,而目前广泛使用的直接测序法检测能力有限,不能完全满足临床需要。
本试剂盒用于检测人类KRAS基因的12和13密码子上7种热点体细胞突变(见表1),试剂盒以DNA为检测样本,提供突变状态的定性评估。
辅助临床医生筛选出可受益于肿瘤靶向药物的大肠癌等癌症患者。
该产品用于组织中提取DNA的KRAS基因7种突变的检测,为临床医生对大肠癌或肺癌患者选择肿瘤靶向药物治疗提供参考。
表1 人类KRAS基因的12和13密码子上7种热点体细胞突变突变名称氨基酸变化碱基变化Cosmic ID 公司命名Gly12Asp 甘氨酸到天门冬氨酸GGT>GAT 521 12-2-A Gly12Ala 甘氨酸到丙氨酸GGT>GCT 522 12-2-C Gly12Val 甘氨酸到缬氨酸GGT>GTT 520 12-2-T Gly12Ser 甘氨酸到丝氨酸GGT>AGT 517 12-1-A Gly12Arg 甘氨酸到精氨酸GGT>CGT 518 12-1-C Gly12Cys 甘氨酸到胱氨酸GGT>TGT 516 12-1-T Gly13Asp 甘氨酸到天门冬氨酸GGC>GAC 532 13-2-A 【检测原理】本试剂盒基于实时PCR平台结合了特异引物和双环探针两种技术,检测DNA样品中含有的突变基因。
人类Kras基因突变检测试剂盒说明书
人类Kras基因突变检测试剂盒说明书人类K-ras基因突变检测试剂盒(PCR-熔解曲线法)说明书【产品名称】通用名:人类K-ras基因突变检测试剂盒(PCR-熔解曲线法)英文名:Diagnostic kit for Mutations of Human K-ras Gene (PCR-Melting Curve Analysis)【包装规格】20测试/盒【预期用途】K-ras基因位于12号染色体短臂上,是重要的癌基因之一,编码一种21kD 的kras蛋白,参与细胞内的信号传递,主要包括PI3K/PTEN/AKT 和RAF/MEK/ERK信号转导途径,这些转导途径是当前肿瘤靶向药物研究的热点,靶向药物经过抑制这些途径发生药理作用。
K-ras基因第12和13密码子发生突变,将导致kras蛋白变异并处于持续激活状态,使药物失效。
据中国《肿瘤学临床实践指南》,在一项包含101例肺腺癌亚型细支气管肺泡癌患者的回顾性研究中,所有患者均接受厄洛替尼单药一线治疗。
K-ras突变者无一例缓解(0/18),而无K-ras突变者则有20例缓解(20/62,32%),差别有统计学意义(P <0.01)。
因此,指南建议,非小细胞肺癌和结直肠癌患者使用靶向药物前应进行K-ras基因突变状态的检测。
本试剂盒以人非小细胞肺癌、结直肠癌肿瘤组织切片提取的基因组DNA为检测样本,用于检测肿瘤组织K-ras基因第12,13密码子的12种体细胞突变(表1),提供突变状态的定性结果。
为临床肿瘤靶向药物的个体化用药提供辅助诊断依据,本品适用于进入个体化靶向治疗疗程前的患者使用。
【检验原理】本试剂盒基于实时PCR平台,结合了特异引物、荧光探针和熔解曲线技术,定性检测DNA样品中K-ras基因12,13密码子是否存在突变。
用一对K-ras基因特异引物,该引物可扩增12种突变型和野生型的K-ras目标序列,利用标记了FAM荧光基团和淬灭基团的双标记探针一方面抑制野生型基因的扩增,提高突变基因的检测灵敏度,另一方面在扩增后用熔解曲线法实现对扩增产物的分析,荧光探针在未杂交时因荧光基团和淬灭基团相互接近而被淬灭,不发荧光,杂交状态时,二者相互离开而产生荧光。
人类K-ras基因突变检测试剂盒说明书
人类K-ras基因突变检测试剂盒说明书【检验原理】本试剂盒基于实时PCR平台,结合了特异引物、荧光探针和熔解曲线技术,定性检测DNA样品中K-ras基因12,13密码子是否存在突变。
用一对K-ras基因特异引物,该引物可扩增12种突变型和野生型的K-ras目标序列,利用标记了FAM荧光基团和淬灭基团的双标记探针一方面抑制野生型基因的扩增,提高突变基因的检测灵敏度,另一方面在扩增后用熔解曲线法实现对扩增产物的分析,荧光探针在未杂交时因荧光基团和淬灭基团相互接近而被淬灭,不发荧光,杂交状态时,二者相互离开而产生荧光。
该荧光探针分别与突变基因和野生型基因的杂交产物在熔解曲线分析时,表现为熔解曲线导数图中出现不同位置的峰,熔解峰对应的位置即为熔解温度(Tm值),因野生峰的位置较突变峰位置大3℃以上而得到区分,但各种突变峰因Tm值相差较小而不能辨别。
本品可稳定地检出野生型10ng/ul基因组背景下1%含量的体细胞突变,其熔解曲线会出现双峰,其中突变峰较野生峰Tm值明显降低(图1)。
【主要组成成份】本试剂盒包含PCR反应液I、PCR反应液Ⅱ和野生型对照品等3管试剂。
PCR反应液I包含相应的K-ras基因突变检测引物和探针,探针由FAM荧光指示;PCR反应液Ⅱ含有dNTP、Taq酶和MgCl2等。
检测必须但试剂盒中不包含的组分:1.5ml 离心管(用于配制PCR反应液和DNA 提取);0.2ml PCR管或8联PCR管或96孔PCR 板;带滤塞的吸头(1ml、200μl和10μl);DNA提取试剂盒ReliaPrep ™FFPE gDNA Miniprep System(货号:A2352)【贮存条件及有效期】置于-20℃条件下储存,有效期6个月。
4-10℃避光条件下储存或运输不得超过7天。
【适用仪器】适用于ABI7500、Linegene FQD-96A型号的Real-time PCR扩增仪。
【样本要求】1. 适用样本为非小细胞肺癌、结直肠癌石蜡包埋病理组织切片,切片厚度10μm,数量1片,所用切片样品保存不超过3年。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性,平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益,请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间:9:00-18:30)。
人类K-ras基因突变检测试剂盒(PCR-熔解曲线法)说明书【产品名称】通用名:人类K-ras基因突变检测试剂盒(PCR-熔解曲线法)英文名:Diagnostic kit for Mutations of Human K-ras Gene(PCR-Melting Curve Analysis)【包装规格】20测试/盒【预期用途】K-ras基因位于12号染色体短臂上,是重要的癌基因之一,编码一种21kD 的kras蛋白,参与细胞内的信号传递,主要包括PI3K/PTEN/AKT 和RAF/MEK/ERK信号转导途径,这些转导途径是当前肿瘤靶向药物研究的热点,靶向药物通过抑制这些途径发生药理作用。
K-ras基因第12和13密码子发生突变,将导致kras蛋白变异并处于持续激活状态,使药物失效。
据中国2010版《肿瘤学临床实践指南》,在一项包含101例肺腺癌亚型细支气管肺泡癌患者的回顾性研究中,所有患者均接受厄洛替尼单药一线治疗。
K-ras突变者无一例缓解(0/18),而无K-ras突变者则有20例缓解(20/62,32%),差别有统计学意义(P <0.01)。
因此,指南建议,非小细胞肺癌和结直肠癌患者使用靶向药物前应进行K-ras基因突变状态的检测。
本试剂盒以人非小细胞肺癌、结直肠癌肿瘤组织切片提取的基因组DNA为检测样本,用于检测肿瘤组织K-ras基因第12,13密码子的12种体细胞突变(表1),提供突变状态的定性结果。
为临床肿瘤靶向药物的个体化用药提供辅助诊断依据,本品适用于进入个体化靶向治疗疗程前的患者使用。
表1 本品可检测的K-ras基因突变K-ras基因12密码子突变K-ras基因13密码子突变Gly12Ser GGT > AGT Gly13Ser GGC > AGCGly12Arg GGT > CGT Gly13Arg GGC > CGCGly12Cys GGT > TGT Gly13Cys GGC > TGCGly12Asp GGT > GAT Gly13Asp GGC > GACGly12Ala GGT > GCT Gly13Ala GGC > GCCGly12Val GGT > GTT Gly13Val GGC > GTC【检验原理】本试剂盒基于实时PCR平台,结合了特异引物、荧光探针和熔解曲线技术,定性检测DNA样品中K-ras 基因12,13密码子是否存在突变。
用一对K-ras基因特异引物,该引物可扩增12种突变型和野生型的K-ras目标序列,利用标记了FAM荧光基团和淬灭基团的双标记探针一方面抑制野生型基因的扩增,提高突变基因的检测灵敏度,另一方面在扩增后用熔解曲线法实现对扩增产物的分析,荧光探针在未杂交时因荧光基团和淬灭基团相互接近而被淬灭,不发荧光,杂交状态时,二者相互离开而产生荧光。
该荧光探针分别与突变基因和野生型基因的杂交产物在熔解曲线分析时,表现为熔解曲线导数图中出现不同位置的峰,熔解峰对应的位置即为熔解温度(Tm值),因野生峰的位置较突变峰位置大3℃以上而得到区分,但各种突变峰因Tm值相差较小而不能辨别。
本品可稳定地检出野生型10ng/ul基因组背景下1%含量的体细胞突变,其熔解曲线会出现双峰,其中突变峰较野生峰Tm值明显降低(图1)。
图1 系列阳性样本的检测结果注:左峰为突变峰,右峰为野生峰【主要组成成份】本试剂盒包含PCR反应液I、PCR反应液Ⅱ和野生型对照品等3管试剂。
PCR反应液I包含相应的K-ras 基因突变检测引物和探针,探针由FAM荧光指示;PCR反应液Ⅱ含有dNTP、Taq酶和MgCl2等。
表2 试剂盒组成主要成分试剂组分体积PCR反应液Ⅰ350μl25-125pM的引物和探针0.1U/μl Taq酶和30nM dNTP、PCR反应液Ⅱ100μl750nM Mg2+等野生型对照品20μl10ng/μl野生型基因组DNA 检测必须但试剂盒中不包含的组分:1.5ml 离心管(用于配制PCR反应液和DNA提取);0.2ml PCR管或8联PCR管或96孔PCR板;带滤塞的吸头(1ml、200μl和10μl);DNA提取试剂盒ReliaPrep? FFPE gDNA Miniprep System(货号:A2352)【贮存条件及有效期】置于-20℃条件下储存,有效期6个月。
4-10℃避光条件下储存或运输不得超过7天。
【适用仪器】适用于ABI7500、Linegene FQD-96A型号的Real-time PCR扩增仪。
【样本要求】1.适用样本为非小细胞肺癌、结直肠癌石蜡包埋病理组织切片,切片厚度10μm,数量1片,所用切片样品保存不超过3年。
2.由于肿瘤的复杂性,所采集的临床样品往往会混有正常组织细胞,石蜡包埋病理切片样品肿瘤病变细胞应不低于%,所取部分应尽量在蜡块中部;3.使用商业化的试剂盒来提取人类基因组DNA,推荐使用Promega公司的ReliaPrep? FFPE gDNAMiniprep System(A2352)提取石蜡包埋组织切片样品,所提DNA需用紫外分光光度计测定浓度和纯度,其DNA OD260/OD280的值应在 1.8~2.0,浓度应在3~300ng/μl之间,样本DNA质量不合格者不得用于检测,建议重新取切片进行核酸提取,提取完的DNA建议立即进行检测,否则请于-20℃以下保存,保存时间不要超过6个月。
【检验方法】一、核酸提取(样本处理室)使用ReliaPrep? FFPE gDNA Miniprep System进行核酸提取,提取步骤如下。
1.用矿物油去除石蜡加矿物油500μl到装有组织切片样本的 1.5ml离心管内,80℃孵育1min,振荡混匀;2.组织样本裂解,消化组织蛋白质1)离心管内加入200μl裂解液,室温10,000g离心15s,形成水油两相溶液,下层为水相,上层为油相;2)向离心管水相加入20μl蛋白酶K, 用移液枪吸打混匀;3)56℃孵育1h;4)80℃孵育1h;5)冷却到室温,离心15s;3.去除RNA向离心管水相加入10μl RNase A,吸打混匀。
室温(20-25℃)孵育5min;4.用核酸提取柱提取基因组DNA1)加入220μl BL Buffer到含裂解样品的离心管中,再加入240μl乙醇(95-100%),震荡混匀,室温10,000g离心15s,形成水油两相溶液,下层为水相,上层为油相;2)将结合柱置于收集管内,小心吸取离心管下层水相(包括可能形成的沉淀)转移到结合柱内,盖上管盖,将离心管丢弃。
3)收集管室温10,000g离心30s,弃去管中的滤出液。
4)把柱子重新装入收集管中,加入500μl 1 洗涤液至柱内,室温10,000g离心30 s,弃去滤出的洗涤液。
5)重复步骤4)再洗涤一次;6)打开结合柱盖子,室温条件下16,000g离心 3 min以甩干柱内残余的液体;7)把柱子转移至一个干净的自备 1.5ml离心管中,向柱内加入50μlElution Buffer,室温16,000 g 离心 1 min洗脱基因组DNA,丢弃提取柱。
注意事项:1.操作提取柱和收集管时应戴好一次性手套;2.收集基因组DNA前的16,000g离心 3 min操作必须开盖,以除净乙醇,乙醇残留过量将严重影响基因组的收集质量。
二、试剂准备(试剂准备室)将试剂从冰箱取出,室温融化,混匀,1000rpm快速离心20秒,备用;三、反应体系配制(试剂准备室)1.根据检测样本数计算所需反应数,如样本数为n,则需做n+2个反应(包含一个阴性对照反应和一个无模板对照反应);2.根据表3计算所需各反应液的体积,并配制反应体系,反应体系混匀后3000rpm快速离心30秒,分装至PCR管中,每管18μl;表3 加样表组分1反应(μl)N个反应(μl)PCR反应液I 14 14×NPCR反应液Ⅱ 4 4×N总体积18 18×N四、加样(样本处理室)取2μl提取的样品DNA加入PCR反应管,盖上管盖,1000rpm离心或轻甩,排除管底气泡;阴性对照反应所用模板为试剂盒中野生型对照品,空白对照反应所用模板为超纯水(自备)。
五、上机检测(扩增室)1.将PCR管按顺序放入PCR仪,设置反应程序(1)LineGene FQD-96A荧光定量PCR仪程序设置图2 LineGene FQD-96A PCR仪反应参数设置图在52℃时收集荧光,荧光检测通道选择FAM检测通道,获得扩增曲线及Ct值,实时监测反应进程。
Melt分析时,目标温度65℃,起始温度39℃,台阶温度1℃,台阶温度维持30s,荧光采集方式为“台阶”。
荧光检测通道选择FAM检测通道。
(2)ABI7500荧光定量PCR仪图3 ABI7500 PCR仪反应参数设置图Melt分析时,选择StepAndHold模式,温度39~65℃,每个步骤升高0.3℃,在每个温度都收集荧光。
荧光检测通道选择FAM检测通道。
2.运行PCR反应程序,保存文件。
六、结果获取荧光定量PCR仪运行结束后,使用配套软件对本次试验的结果进行熔解曲线导数图(-dF/dT)分析。
【参考临界值】以野生型对照品反应管为参照,以野生型对照峰峰高的1/5划定阈值线。
【检验结果的解释】1.空白对照在Linegene FQD-96A中应无明显熔解峰,若分析后出现明显熔解峰,可能为试剂受到污染或操作过程中的污染,请排除污染源后重新检测;在ABI7500中,空白对照荧光变化曲线(Normalized Reporter)应为逐渐上升的一条斜线(如图4),若出现荧光值下降的熔解特征曲线,可能为试剂受到污染或操作过程中的污染,请排除污染源后重新检测;2.野生型对照管在熔解曲线分析后应有单独熔解峰,若野生型对照管无熔解峰,或出现2个或2个以上熔解峰,该批次样本需重新检测。
请确认所使用的试剂是否仍在有效期内,确定操作是否严格按照说明书进行。
3.若满足1和2要求,表明此次实验成功,对样品管进行分析:(1)样品管只出现单独熔解峰,且Tm值在野生型对照管熔解曲线峰Tm±1范围内,该样本判定为阴性(野生型),如图5野生峰;(2)样品管只出现单独熔解峰,且Tm值小于野生型对照管熔解曲线峰Tm值3℃以上,则该样本判定为阳性(突变型),如图5突变峰;(3)样品管出现两个熔解峰,且两个熔解峰分别符合(1)和(2)的要求(如图6A),或样品管出现一个宽峰(左右各有一个高点,可以判为峰值,但两峰间平缓过渡,凹陷不明显,见图6B、C和D),则该样本判定为阳性(突变型);(4)一般情况下不会出现突变峰与野生峰位置相差3℃以内或单一突变峰与野生型对照管的野生峰位置相差1~3℃的情况,如确实发生此种情况,考虑仪器温度控制和传感系统是否发生故障;(5)样品管在熔解曲线分析中无明显熔解曲线峰,可能为DNA样本中存在PCR抑制剂或DNA量不够,请确认样本质量以及前处理过程是否规范,必要时再行检测。