综述-分子标记

分子标记

遗传标记作为识别基因型的表现形式，在生物基因研究方面起到了重要作用，目前通过遗传标记的方法定位基因位置已成为基因定位的常用方法。遗传标记主要有形态标记（morphological marker）、细胞标记（cytological markers）、生化标记（Biochemical marker）和分子标记（molecular marker）四种类型。形态标记、细胞标记因其自身局限性的原因，目前鲜有使用。虽然以同工酶标记为代表的生化标记得到了广泛的发展，但由于其检测的范围狭窄、统计难度大等缺陷，目前仅在少数方面有所应用。从20世纪70年代分子标记出现至今的40年，分子标记因其无比的优越性，使得其成为目前应用最广泛的遗传标记方法。

一、分子标记的概念

分子标记是指以生物大分子的多态性为基础的一种遗传标记。广义的分子标记是指可遗传并能检测的蛋白质或DNA序列。而狭义的分子标记仅仅是指基于DNA分子多态性构建的标记方法。

二、分子标记的特点

理想的分子标记一定要达到以下标准：1、具有高的多态性；2、共显性遗传即利用分子标记可鉴别二倍体中杂合和纯合基因型；3、能明确辨别等位基因；4、遍布整个基因组；5、除特殊位点的标记外要求分子标记均匀分布于整个基因组；6、选择中性即无基因多效性；7、检测手段简单、快速如实验程序易自动化；8、开发成本和使用成本尽量低廉；9、在实验室内和实验空间重复性好便于数据交换。

目前，在现实条件下并没有这种绝对理想的分子标记，但相比形态标记、细胞标记、生化标记，分子标记依旧有着明显的优越性：1、直接以DNA形式表现，在生物体各组织、各时期均可检测，不受环境限制；2、数量多，遍布全基因组，有近乎无限的检测座位；3、多态性高；4、表现为中性，不影响目标性状的表达；5、许多标记为共显性，能区别纯合体与杂合体。

三、分子标记的分类

分子标记技术通常被分为基于分子杂交的分子标记技术（RFLP）（或叫做非PCR基础上的分子标记技术）、基于PCR技术的分子标记技术和同时基于分子杂交和PCR两种技术的分子标记技术三大类型。基于PCR技术的分子标记技术又可分为基于随机引物的PCR分子标记技术（或叫非特异PCR分子标记技术）和基于特异引物的PCR分子标记技术（或叫特异PCR分子标记技术）。随着分子标记技术的不断发展，许多新兴分子标记技术的出现，人们又根据分子标记的基因组来源将分子标记技术分为随机DNA分子标记（Random DNA Markers，RDM）、目的基因分子标记（Gene Targeted Markers，GTM）和功能性分子标记(Functional Markers，FM)。

1、限制性片段长度多态性标记

限制性片段长度多态性（restriction fragment length polymorphism，RFLP）由Grodzicker等人于1974年基于DNA被限制性内切酶酶切后形成特定大小的片段。其优点在于：1、广泛存在；2、共显性，可区分纯合与杂合；3、结果稳定可靠，重复性好。正是有了这些优点，RFLP作为最早出现的分子标记方式，曾被广泛应用。但由于其在使用时需要用放射性同位素标记、酶切时对DNA质量要求高、标记的多态性变异程度偏低等原因，使得RFLP很快就被新的分子标记所替代。

2、随机扩增多态性DNA标记

随机扩增多态性DNA标记（random amplified polymorphic DNA，RAPD）是以基因组DNA 为模板，以人工合成的随机引物，通过PCR 扩增反映扩增片段的DNA片段导入、缺失以及引物结合位点上的碱基突变。RAPD只需合成一套引物，就可可用于不同生物基因组的分析；RAPD技术简便易行，省力省时，并且检测灵敏方便；RAPD分析所需样品DNA量极

少；RAPD标记可以对那些RFLP难以区分的基因组区域作出遗传连锁图。正是有了以上优点，使得RAPD在可靠性比其他主要分子标记差的同时依旧被广泛使用。

3、任意引物PCR标记

任意引物PCR标记（arbitary primer PCR，AP-PCR）是利用PCR扩增原理，用一个随机核苷酸序列的寡核苷酸引物指导PCR扩增，对PCR产物做电泳分析获得DNA指纹图谱，从而提供DNA多态性信息的标记方法。

4、简单序列重复标记

简单序列重复标记（simple sequence repeat，SSR）是一类由几个(多为1~6个)碱基组成的基序串联重复而成的DNA序列，广泛分布于基因组的不同位置，长度一般在200 bp以下。研究表明，微卫星在真核生物的基因组中的含量非常丰富，而且常常是随机分布于核DNA中。通过对拟南芥、玉米、水稻、小麦等的研究表明微卫星在植物中也很丰富，均匀分布于整个植物基因组中，但不同植物中微卫星出现的频率变化是非常大的。SSR标记的特点为：1、SSR标记技术一般检测到的是一个单一的多等位基因位点；2、微卫星呈共显性遗传，可鉴别杂合子和纯合子；3、SSR标记技术仅需微量DNA，即便DNA降解，其亦能有效地分析鉴定；4、SSR标记位点专化性；5、SSR标记数量丰富，标记覆盖整个基因组，而且分布均匀；6、实验重复性好，结果可靠性高；7、SSR序列两侧顺序长较保守，在同种而不同遗传型间多相同；8、多数SSR无功能作用，增减重复序列的频率高，因而在品种间具广泛的位点变异，比RFLP及RAPD分子标记具多态性；9、实验成本中等且技术难度低。正是因为以上众多优点，使得SSR成为目前使用相对广泛的一种分子标记方法。

5、简单序列重复间区标记

简单序列重复间区标记（inter-simple sequence repeat，ISSR）也称作锚定简单序列重复（anchored simple sequence repeat，ASSR）或微卫星引物PCR（microsatellite-primed PCR，MP-PCR）。该技术是在SSR技术上改进而来的，通过在SSR标记的引物3’端或5’端加上2~4个随机核苷酸，使得引物可以锚定在目标DNA片段上。ISSR的特点为：快速、高效不需构建基因组文库；扩增基因组DNA适用于任何富含SSR重复单元和SSR广泛分布的物种，可同时提供多位点信息和提示不同卫星座位个体间变异的信息；遗传多态性高，重复性好；标记为显性标记；无需知道任何靶序列的SSR背景信息；耗资少，模板DNA用量少。尽管ISSR的引物相比SSR的引物更具有通用性，但由于其标记为显性标记，因此在育种方面没有SSR使用的广泛。

6、扩增片段长度多态性标记

扩增片段长度多态性标记（amplified fragment length polymorphism，AFLP）技术是基于PCR 反应的一种选择性扩增限制性片段的方法。由于不同物种的基因组DNA大小不同，基因组DNA经限制性内切酶酶切后，产生分子量大小不同的限制性片段。使用特定的双链接头与酶切DNA片段连接作为扩增反应的模板，用含有选择性碱基的引物对模板DNA进行扩增，选择性碱基的种类、数目和顺序决定了扩增片段的特殊性，只有那些限制性位点侧翼的核苷酸与引物的选择性碱基相匹配的限制性片段才可被扩增。扩增产物经放射性同位素标记、聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，然后根据凝胶上DNA指纹的有无来检验多态性。进行AFLP分析时，双酶切产生的DNA片段在AFLP反应中可被优先扩增，扩增产物可被很好地分离，因此一般多采用稀有切点限制性内切酶与多切点限制性内切酶相搭配使用的双酶切。该标记的特点是：1、分析所需DNA 量少；2、可重复性好；3、多态性强；4、分辨率高；5、不需要Southern杂交，且不需要预先知道被分析基因组DNA的序列信息，是一种半随机的PCR；

6、样品适用性广；

7、标记在后代中的遗传和分离中符合孟德尔遗传规律，种群中标记位点遵循Hardy－Weinberg 平衡。目前AFLP标记技术常被用在高密度基因图谱构建或对某个基因所在区域精细作图。