猪胎儿成纤维细胞制作方法的改进及应用2002

一，酶消化法制备猪胎儿成纤维细胞猪胎儿成纤维细胞制作方法的改进及应用20021. 3. 1剪切猪妊娠35 d，剖腹手术取出子宫，用75% 的酒精浸泡消毒，无菌取出胎儿，用含双抗的PBS ( 137mmol /L NaCl2. 7 mmol /L KCl 10 mmol /L Na2HPO4 2 mmol /L KH2 PO4 1 mmol /L CaCl20. 5mmol /L MgCl2 ) 漂洗2 遍，放入含双抗的PBS 中，分离2 个胎儿,放于塑料平皿中, 用无Ca 2+、Mg2+，含有双抗的PBS 缓冲液洗涤3次, 洗至无色, 备用。

将洗涤好的胎儿转移到另一平皿中,用无菌剪子剪掉头,四肢, 尾,去掉内脏, 继续用无Ca2+、Mg2+- PBS 缓冲液洗涤数次, 洗至无色, 将剩余的部分放入到100mm 的平皿中，然后用剪子将胚胎剪切成2～3 mm 小块, 将碎块转移到50ml离心管中。

1. 3. 2消化向放有组织块的离心管中加入二分之一离心管体积的0.25% Trypsin-0.04%EDTA 消化液（胰蛋白酶常用浓度为0.25%，PH为8.0。

也有用胶原酶的，因为此酶消化温和，但是价格高，如果用胶原酶则为胶原酶+DMEM+Antibiotic-antimycotic，小鼠多用10ml离心管，因此加入胰酶消化液5ml即可）然后在室温下轻轻吹打组织块(或者，在37℃水浴摇床内消化)。

室温消化15～20 min 左右（如果在37摄氏度最好在5min 内消化完）。

可以边消化边吹打组织块, 也可以每隔5 min 吹打一次。

消化结束后, 加入等体积的终止液10% 胎牛血清的DMEM 培养液(即吸出来细胞上层液如果多则放于到5ml 离心管中，如果少则放于1.5ml离心管中）,并轻轻吹打。

1. 3. 3离心、接种和培养800 r·min 离心5 min, 弃上清液, 然后加入5ml（或1ml) 的含20%胎牛血清的低糖DMEM 培养液培养基, 轻轻吹打重新悬浮细胞, 按常规方法进行细胞计数（1ml离心沉淀的细胞数=5个中方格中细胞个数X 5 X10 X1000 X稀释倍数，此时的计算值为体细胞的密度即个/ml. 大约徘徊在1-3 x 106个/ml）。

以2×105个细胞/ mL(此值因为离心后又加入5ml,即稀释倍数为5.）的浓度接种于25 mL 预先2小时涂有0.1%明胶（来源：猪胎儿成纤维细胞建系影响因素与脂质体介导转染法的研究）的培养瓶中(根据具体情况加入4-5ml培养基，但是加入的培养基要求细胞的最终浓度为2 ×105个/ml)(或者转入到10mm平皿中，在38.5℃，5%CO2和饱和湿度培养）于39℃、5%CO2、95%空气、饱和湿度的培养箱中培养。

12小时候观察细胞贴壁生长状况，（原代培养24 h 后，可见细胞贴壁生长，来源：借助慢病毒将EGFP 基因导入西藏小型猪胎儿成纤维细胞）一般在第二天换液，随后隔天换液，逐天观察，待细胞将80%-90%培养瓶铺满后即形成细胞单层，开始进行传代。

一般消化1 个猪胎儿获得的细胞可接种 2 个50 ml的培养瓶。

如下图为传代培养第一代的西藏小型猪胎儿成纤维细胞图：（来源：借助慢病毒将EGFP 基因导入西藏小型猪胎儿成纤维细胞）1.3.4传代培养及纯化（来源：猪胎儿成纤维细胞建系影响因素与脂质体介导转染法的研究）清洗：先吸出旧培养液，再用无钙，镁离子的PBS缓冲液冲洗胚胎成纤维细胞3遍，去除血清和脱落的组织块及死细胞的PBS。

消化：加入0.1%胰酶消化液（或者1ml0.25%胰酶+1mmol/lEDTA 4Na)约2ml作用1-3min,(37℃培养箱中消化约5min),倒置显微镜下观察细胞质收缩变圆，（然后立即加入2ml 消化终止液（DMEM+10%FBS)终止消化，然后仔细吹打细胞悬液，将细胞悬液收集至15ml 离心管中，700r/min离心10min,弃去上清液后，再用培养液DMEM+20%FBS重悬浮细胞，并轻轻吹打使细胞分散均匀，传入新的培养皿中继续培养。

本内容来源：借助慢病毒将EGFP 基因导入西藏小型猪胎儿成纤维细胞）即可倒掉消化液，继续作用约1分钟。

分瓶：轻敲瓶底使成纤维细胞脱落瓶壁，加入STO培养液（STO培养液的配置：FCS (fetal calf serum)10 ml; L-glutamine 1 ml; No-AA 1 ml;β-mercaptoethanol 100μl;DMEM 88 ml。

）终止消化。

充分吹打使细胞团成为单细胞悬液，以1×105个/ml的密度传入25ml（或50ml)传入新鲜培养瓶中继续培养，一般一瓶细胞可以传2-3瓶。

1.3.4细胞的冻存和复苏（来源：猪胎儿成纤维细胞建系影响因素与脂质体介导转染法的研究）消化：猪胚胎成纤维细胞培养2代后，选择长至80~90%汇合生长的旺盛的细胞，弃去培养瓶中的原DMEM培养液，用无Ca，Mg PBS缓冲液洗3次，加入胰酶消化液，作用约1~3分钟，弃去胰酶消化液，再稍微作用约1分钟，直到轻敲瓶底细胞层出现断裂，加入培养液终止消化液的作用。

计数：用红细胞计数板计算冻存细胞总数。

收集细胞：用吸管将其吹打成单细胞悬浮液并将其转移到离心管，1000rpm/min离心10分钟。

分装：弃去上清液，用冻存液（含10%DMSO的培养液）约1 ml收集细胞，分装于冻存管中。

一般一个50ml培养瓶的细胞可以冷冻两管。

冷冻过程：将冷冻管中的细胞在4℃冰箱冷冻半个小时后在-20℃冰箱冷冻2~3小时，然后转入-80℃超低温冰箱中过夜保存，第二天转入液氮中长期保存。

细胞悬液的冷冻速度对冷冻效果的影响很大，多数细胞以每分钟下降1℃的速度降至﹣20℃，冻结均可获得满意效果。

解冻：从液氮中取出冻存管，立即放入40℃温水中不停搅动，令其快速解冻，时间控制在一分钟内。

接种细胞：将细胞悬液移入离心管中，加入等体积STO培养液，立即放入离心机中，1000 rpm/min离心10分钟，弃去上清液，加入新鲜培养液，充分吹打接种到预先2小时涂有明胶的培养瓶中，37℃、饱和湿度、5%CO2培养箱培养。

对状态良好的细胞要及时冻存、编号。

低代细胞由于避免了长期体外传代引起的基因不稳定和细胞表型变化，可保持原细胞的特征。

但当细胞离开活体开始体外培养后，它的各种生物学特性都将逐渐发生变化，并随着传代次数的增加和体外培养条件的变化而不断有新的变化。

因此，及时冻存低代细胞是很必要的。

细胞冻存及复苏的基本原则是慢冻快融。

细胞冻存效果的好坏还与细胞在冻存液中的分散程度密切相关，细胞分散得越好，冻存效果越好，分散细胞时以冻存液中肉眼看不见细胞沉淀为标准。

胎儿成纤维细胞贴壁前呈圆形,一般2~ 3 h 即出现贴壁现象, 12 h 后即可增殖。

细胞生长时呈放射状、火焰状或旋涡状走行, 生长旺盛的细胞之间连接紧密,一般4~ 5 d即可形成细胞单层( 达到70%~ 80%细胞汇合) 。

倒置相差显微镜下观察,可见细胞透明,细胞颗粒少, 大多数细胞胞质形成2 个突起, 呈长梭形, 一般胞体的中心部,即核存在的位置稍稍隆起, 立体感强。

1.3.5细胞存活率计算在细胞培养工作中，常需要了解细胞生活状态和鉴别细胞死活，如果酶消化制备的细胞悬液中细胞活力检测等。

常用活体染料台盼兰（Trypan blue）对细胞进行染色。

染色：用微量加样器吸取0.5 ml细胞悬液于一小试管中（无菌操作），再加入0.5 ml 0.4%台盼兰染液，用吸管轻轻打匀，染色1～2分钟。

计数：取一滴染色后的细胞悬液滴入计数板，计数每毫升细胞悬液中死亡细胞数（被染色的细胞）。

由于在细胞悬液中加了等量的台盼兰染液，所以计数出的细胞数要再乘以2（稀释倍数）才是正确的死细胞数。

细胞存活率计算：细胞存活率＝（细胞总数－死细胞数）/细胞总数×100%1.3.6胎儿成纤维细胞生长曲线的绘制（猪胎儿成纤维细胞建系影响因素与脂质体介导转染法的研究）（1）细胞悬液制备：选择生长状态良好的成纤维细胞，用常规消化法消化细胞，制成细胞悬液，红细胞计数板计数。

（2）接种：24孔培养板内分别接种1×104个细胞/ml（细胞分散程度对结果影响很大，尽量制成单细胞悬液），于37℃、饱和湿度、5%CO2培养箱培养。

（3）计数检测：从接种时间算起，每一天对3个孔中的细胞进行计数，算出平均值。

（4）绘图：以培养时间（d）为横坐标、细胞密度为纵坐标，作图。

常规的细胞操作是包括分瓶的传代（passage），每次传代以1：3到1：5的比例分瓶，具体的传代间隔时间以细胞的生长周期来决定。

同时转染时机的把握也很重要。

一般，细胞铺满瓶底50%～60%为宜，注意在转染时培养瓶内细胞不能长满。

血清中的载脂蛋白与脂质体的相互作用会导致脂肪酸链运动的自由度降低，双分子层堆积特性改变和脂质从脂质体转移到载脂蛋白上，使脂质体膜的通透性增加，最终破裂。

其次血清白蛋白、抗磷脂抗体和可溶性脂交换蛋白也可引起脂质体膜的不稳定。

DNA-脂质体复合物同细胞通常是在无血清环境下作用的。

1.3.6pEGFP-N3转染猪胎儿成纤维细胞的研究（1）材料：G418（Sigma）、Fugene-6（Roche）、pEGFP-N3（Clontech，此公司的载体质粒）、EcoO1094与超纯质粒提取试剂盒（天为时代，此公司的限制性内切酶和质粒提取试剂盒）（pEGFP-N3载体的简介：作为为真核细胞表达载体。

）pEGFP-N3 - 特点pEGFP-N3①从结构上看，该质粒具有很强的复制能力，可以满足随宿主细胞分裂时跟随胞质遗传给新生的子细胞，这是保证目的基因稳定表达的因素之一；②含有高效的功能强大的启动子SV40和PCMV，可以使目的基因在增殖的细胞中稳定表达；③具有多克隆位点，便于目的基因的插入；④该载体具有neo基因，可以采用G418来筛选已成功转染了该载体的靶细胞。

这些特殊的结构可以实现目的基因在靶细胞内的稳定表达。

pEGFP-N3载体上携带有EGFP蛋白表达基因，如上图质粒图谱所示。

pEGFP-N3 - 相关知识pEGFP-N3绿色荧光蛋白(Green Fluorescent Protein，GFP)基因来源于Jellyfish Aequorea Victoria，是Shimomura等于1962年发现的蛋白质，由238个氨基酸组成，分子量约为27Kd。

GFPGFP 在包括热、极端PH和化学变性剂等苛刻条件下都很稳定，用甲醛固定后会持续发出荧光，但在还原环境下荧光会很快熄灭。

与以往常用的报告基因相比，GFP具有以下优点：①在荧光显微镜下，用波长约490 nm的紫外线激发后，即可观察到绿色荧光，直接、简捷、便于检测；②无需任何的作用底物或共作用物,检测的灵敏度不受反应效率的影响，保证了极高的检出率；③蛋白本身性质稳定；④可在多种异源生物中表达且无细胞毒性；⑤其基因片段长度较小(约717 bp)，易于构建融合蛋白，且融合蛋白仍能保持荧光激发活性，为研究其他基因表达产物的分布提供了方便。