有机溶剂沉淀法分离与纯化蛋白质

有机溶剂沉淀法分离与纯化蛋白质

摘要：有机溶剂能降低溶液的电解常数，从而增加蛋白质分子上不同电荷的引力，导致溶解度的降低；另外，有机溶剂与水的作用，能破坏蛋白质的水化膜，故蛋白质在一定浓度的有机溶剂中的溶解度差异而分离的方法，称“有机溶剂分段沉淀法”，它常用于蛋白质或酶的提纯。

关键词：有机溶剂沉淀分离与纯化

正文

一、有机溶剂沉淀法

1.有机溶剂沉淀法的概念

利用与水互溶的有机溶剂(如甲醇、乙醇、丙酮等)能使蛋白质在水中的溶解度显著降低而沉淀的方法，称为有机溶剂沉淀。

2.有机溶剂沉淀法的原因

有机溶剂引起蛋白质沉淀的主要原因是加入有机溶剂使水溶液的介电常数降低，因而增加了两个相反电荷基团之间的吸引力，促进了蛋白质分子的聚集和沉淀。有机溶剂引起蛋白质沉淀的另一种解释认为与盐析相似，有机溶剂与蛋白质争夺水化水，致使蛋白质脱除水化膜，而易于聚集形成沉淀。

3.有机溶剂沉淀法的影响因素

(一)有机溶剂的选择在实际生产中，常用的有机溶剂有乙醇、丙酮、异丙醇、氯仿等。丙酮的介电常数小，沉淀能力强；而乙醇无毒，广泛应用于药品生产中。

(二)温度的控制有机溶剂沉淀时，温度是重要的控制指标。根据沉淀对象不同，采用的温度不同，为防止生物大分子在较高温度时发生变性，一般要求在低温下进行，同时还要考虑有机溶剂与水混合时的放热现象。

(三)pH值等电点时，蛋白质的溶解度最低。在有机溶剂沉淀时，应选择pH值在等电点附近，但是pH值的控制还必须考虑目的药物的稳定性条件，一般生产中常用缓冲液来控制溶液的pH值。

(四)离子强度在有机溶剂和水的混合液中离子强度是一个特别重要的因素。因为盐在一定的浓度范围内能增加蛋白质或酶在有机溶剂中的溶解度，使有机溶剂沉淀收率降低，因此当采用盐析沉淀法得到蛋白质或酶后，如需进一步用有机溶剂沉淀法纯化，一定要先透析除盐。

4.有机溶剂沉淀法的溶剂选择原则

溶剂的选择原则就是：与水可以混溶，不与蛋白反应，沉淀效应良好，无毒等。一般就是乙醇丙酮。方法就是调节适当的pH ，pH 调节适当会使沉淀效果好很多，等电点附近比较好。加入前将有机溶剂低温处理，缓慢加入，边加边缓慢搅拌（可以冰浴），静置15min 后离心。蛋白溶液浓度不要太低，否则蛋白容易变性，5mg/ml 以上吧。一般加丙酮的话，体积百分含量20~50%即可。至于加盐的话，可以在加有机溶剂前加入，浓度不要太大，否则如你所说，沉淀太猛，失去分级的效果。如果加NaCl ，浓度0.05mol/L 左右即可。［3］

5.有机溶剂沉淀法的主要机理

向水溶液中加入一定量亲水性的有机溶剂，降低溶质的溶解度，使其沉淀析出的分离纯化方法。

主要机理：

（1)亲水性有机溶剂加入溶液后降低了介质的介电常数，使得溶质分子之间的静电引力增加，聚集形成沉淀。

(2)水溶性有机溶剂本身的水合作用降低了自由水的浓度，压缩了亲水溶质分子表面原有水化层的厚度，降低了它的亲水性，导致脱水凝集。

二、 有机溶剂沉淀法分离与纯化的实例

以乙醇为溶剂，2RNH 为沉淀剂，采用有机溶剂沉淀法对湿法磷酸进行净化，在乙醇与预处理酸体积比为2. 0、溶剂沉淀剂用量为3. 5%、反应温度40 ℃、反应时间100 min 条件下，脱氟率可达到96%以上，磷收率为86%以上.

1.实验方法

取一定量的原料磷酸于250 mL 烧杯中，置于恒温水浴中进行搅拌，恒温之后加入一定量的复合脱氟剂对原料酸进行预处理［2］，经反应、静置、过滤分离后得预处理酸. 取一定量的预处理酸于三口烧瓶中，加入一定量的溶剂沉淀剂，置于恒温水浴中，同时用搅拌器进行搅拌，恒温后加入一定体积的乙醇，于给定温度下反应一定时间后将物料进行过滤分离，滤液经蒸馏分离回收溶剂后得净化磷酸，净化酸取样分析［1］

2.试验结果

（一） 原料酸预处理实验条件:原料酸500 mL ，复合脱氟剂用量17. 2 g ，反应温度30 ℃，搅拌速度300 r /min ，反应时间2 h ，静置时间2 h ，经预处理后的磷酸脱氟率达到65. 60%，磷酸磷收率为92.80%.

（二）单因素实验影响反应的因素主要包括:溶剂沉淀剂种类及用量、溶剂用量、反应温度、反应时间等，先以单因素实验分别考察各因素对脱氟率的影响以初步确定实验条件范围.

1．不同溶剂沉淀剂对脱氟效果的影响实验条件:预处理酸与乙醇体积比为1∶ 2，沉淀剂用量为预处理酸质量的2. 5%，搅拌速度300 r /min ，反应温度25 ℃，反应时间90 min ，乙醇均匀缓慢加入. 分别以液氨、2RNH 和复合沉淀剂(2RNH + 液氨)为溶剂沉淀剂。

2． 乙醇用量对脱氟效果的影响实验条件: 2RNH 用量为预处理酸质量的2.

5%，搅拌速度300r /min，反应温度25 ℃，反应时间90 min，乙醇均匀缓慢加入. 于不同溶剂用量时对脱氟率进行考察，

实验结果如图下图所示

由图可见，随乙醇用量的增加，脱氟率逐渐增大，这是因为当乙醇用量增加时，不溶于乙醇的铵盐及含氟铵盐被析出，脱氟率增加，当乙醇与磷酸体积比为2∶ 1 时，脱氟率最高，之后脱氟率随乙醇用量的进一步增加而略有下降，此时磷被同时析出. 因此乙醇用量以乙醇与磷酸体积比2∶ 1 左右为宜.［4］

3．溶剂沉淀剂RNH2用量对脱氟效果的影响实验条件:预处理酸与乙醇体积比为1∶ 2，搅拌速度300 r /min，反应温度25 ℃，反应时间90 min，乙醇均匀缓慢加入，于不同溶剂沉淀剂用量时进行实验研究，结果如下图所示.

由图可知，当溶剂沉淀剂RNH2用量小于3. 0%时，脱氟率随着溶剂沉淀剂RNH2用量的增加而增大，这是因为当溶剂沉淀剂RNH2用量增加，杂质形成的铵盐相对增加，而这些铵盐又不溶于乙醇，所以随着溶剂沉淀剂RNH2用量的增加，脱氟率增大;当溶剂沉淀剂RNH2用量大于3%时，脱氟率变化不明显，所以选择溶剂沉淀剂RNH2用量为3. 0%进行后续实验研究。［5］

3 结论

该工艺对湿法磷酸进行预处理后，以乙醇为溶剂，RNH2为沉淀剂，采用溶剂沉淀法对湿法磷酸进行净化，在乙醇与预处理酸体积比为2∶ 1、溶剂沉淀剂用