苦荞具Kelch基序的F-box蛋白在次生代谢调控中的功能探究

苦荞具Kelch基序的F-box蛋白在次生代谢调控中的功能探究苦荞具Kelch基序的F-box(KFB)蛋白是E3泛素连接酶家族成员

SCF(Skp1-Cullin-F-box)复合物的组分之一,其通过特异性识别靶蛋白使其泛素

化降解,从而调节细胞活动。研究报道KFB蛋白通过控制次生代谢相关酶的稳定

性影响代谢产物的产生,以实现对次生代谢途径的调控。

本研究对本课题组苦荞转录组数据库中的15种苦荞KFB基因(命名为FtKFB1、FtKFB 2、FtKFB 3、FtKFB 4、FtKFB 5、FtKFB 6、FtKFB 7、FtKFB 8、FtKFB 9、FtKFB 10、FtKFB11、FtKFB 12、FtKFB 13、FtKFB 14、FtKFB15)进行实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析苦荞中KFB基因的组织特异性表达。将Uniprot 蛋白数据库中的两种具有次生代谢调控功能的拟南芥KFB蛋白(At1g80440、

At2g44130)与FtKFB1-FtKFB15的氨基酸序列进行比对,因FtKFB7、FtKFB14分别与At1g80440、At2g44130具有44%和41%的一致性,推测FtKFB7、FtKFB14可能与次生代谢调控有关。

通过酵母双杂交系统及GST pull-down实验对FtKFB7、FtKFB14与苦荞苯丙氨酸解氨酶(FtPAL)及苦荞芦丁降解酶(FtRDE)之间的相互作用进行验证。构建植物表达载体,在烟草中实现FtKFB7和FtKFB14基因的过表达,检测转基因阳性植株的总黄酮含量,以进一步探究FtKFB蛋白在次生代谢途径中的调控机制。

研究结果表明:(1)对苦荞不同组织(根、茎、叶、花、种子)中FtKFB1-FtKFB15的qRT-PCR分析表明FtKFB4、5、6、7、8、9、10、11在叶中表达量最高,分别为根中表达量的10.0、7.1、21.3、7.7、13.4、18.4、1.5、2.4倍;FtKFB2、3、13、14的表达量在种子中最高,分别为根中的 1.3、8.5、7.0、10.1倍;FtKFB12在茎中有着最高的表达水平,约为根的2.1倍;FtKFB1在根中表达量最高,而

FtKFB15在茎和根中的表达水平接近。表明在苦荞各组织中不同FtKFB基因存在表达差异。

(2)分别构建诱饵载体pGBKT7-FtKFB7、pGBKT7-FtKFB14和猎物载体

pGADT7-FtPALB、pGADT7-FtPALN、pGADT7-FtRDE,共转化酵母Y187感受态细胞,以pGBKT7-Lam+pGADT7-T作为阴性对照,pGBKT7-53+pGADT7-T作为阳性对照。经验证该酵母双杂交系统无自激活效应。

X-α-Gal显色结果表明FtKFB7与FtRDE、FtPALN、FtPALB之间都存在相互作用,而FtKFB14只与FtPALB之间有相互作用。通过酵母双杂交实验初步证实了FtKFB与FtPAL、FtRDE之间的相互作用,为后续研究奠定了基础。

(3)构建重组表达载体pGEX-6p-1-FtKFB7、pGEX-6p-1-FtKFB14,经GST亲和层析纯化得到FtKFB7、FtKFB14蛋白;通过钴离子螯合柱层析成功纯化得到PALB 蛋白;从苦荞籽粒中纯化得到FtRDE酶粗提液。GST pull-down实验及Western Blot检测结果表明在pull-down洗脱液中成功检测到FtKFB7与FtPALB或FtRDE 蛋白,进一步证实了FtKFB与FtPAL、FtRDE在体外的相互作用。

(4)为了进一步研究FtKFB蛋白在植物次生代谢中的功能,构建了植物表达

载体pCAMBIA3301-eGFP-FtKFB7和pCAMBIA3301-eGFP-FtKFB14,通过农杆菌转化烟草品种SR-1(Nicotiana tabacum cv.Petit Havana SR-1)以实现FtKFB7、FtKFB14在烟草中的过表达。本实验经Basta抗性筛选及PCR检测得到FtKFB7、FtKFB14、pCAMBIA3301-eGFP的T0代转基因阳性植株,并初步测定了T0代pCAMBIA3301-eGFP和FtKFB14转基因植株中的总黄酮含量,结果表明FtKFB14的过表达可能对黄酮含量起负调节作用,但仍需进一步验证。

该实验为深入了解苦荞KFB蛋白对植物次生代谢产物的影响创造了条件。