小鼠脾细胞的体外培养及形态观察

小鼠脾细胞的体外培养及形态观察

黄殿玲,李核,何文琴,李霞,杨佩,王纯

摘要：用组织块法和冷消化法对小鼠脾细胞在含血清培养液中进行原代培养,并对正常细胞形态进行观察。结果表明组织块法和消化法培养可获得比较均一、稳定的细胞群,细胞呈典型的成纤维形态。

关键字：脾细胞原代培养形态

多细胞生物的细胞可以分离出来，在适宜的培养液以及培养箱中存活，并在一定的时间内，保持其形态、生理、生化特性，经过一定时间还可以观察到一定量的细胞。直接从身故体内分离的细胞，如小鼠的脾细胞，在体外培养的过程中尚未发生细胞分裂、增殖的细胞即为原代培养细胞；原代培养细胞在一定条件下可以继续增殖，在数量上大量扩增，此时的细胞为继代培养细胞。

在生物体内或体外，正常的细胞只能分裂一定的次数，然后停止分裂，最终死亡。这一过程称为衰老，此为正常的现象。只有细胞被转化后，细胞可以无限增殖，就称为细胞系/株。细胞培养基要满足细胞的生长需要，包括pH、渗透压、营养和生长因子等，已保证细胞的增殖。细胞培养皿是特殊制造的使细胞可以贴壁。这就要为细胞的培养创造适宜的环境，使细胞更容易存活或生长。细胞培养箱常指二氧化碳培养箱。它可以提供合适的温度和二氧化碳浓度。二氧化碳和培养基中的缓冲系统共同作用，保持细胞培养液的酸碱度。

超净台通过将空气进行过滤，为细胞培养的各种操作提供了一个干净的环境，使细胞培养免于细菌和真菌的污染。在细胞原代培养的操作过程中，这个设备是必要的，细胞本来就比较易感染，不易存活，在空气中，以及人体表面存在许多易感染细菌，所以为了提高细胞的存活率，一定要保持操作过程干净，无污染。细胞培养是细胞生物学研究的中心技术。通过细胞培养可以观察研究细胞的某些生理特性，同时在体外进行细胞培养，也打破了以往的细胞只能在生物体内增殖、分裂。其特点包括：大量实验材料；单一、纯粹细胞类型培养基的成分可控，即生长条件可控/全合成、无血清培养基；易于观察；易于操作。

1 材料与方法

1.1 实验材料

取出生一周的小鼠，采用颈椎脱臼的方法牺牲小鼠。取一只小鼠置于解剖盘中，抓住小鼠的尾巴，确保小鼠的前爪在解剖盘中，慢慢的安抚使小鼠安静下来；用剪刀或手术钳紧紧的按住小鼠的颈的后部，用力向后拉小鼠的尾巴；切记不要

只拉小鼠的尾巴的末端，以免损害小鼠的尾巴；慢慢的用力按住小鼠的颈部几分钟，确保小鼠已经死亡；将小鼠浸泡在70%酒精中几分钟。进入实验室，将小鼠放进超净台，.将小鼠平放在解剖盘内，腹部向上。用镊子夹起下腹部毛皮，用剪子剪一个横向小口，然后用手用两边撕开，暴露肌肉层。或者用剪子向斜上方剪一个V字开口。将肌肉层向斜上方剪一个V字开口，向上翻开，暴露腹腔。在腹腔左上方，将胃拨开，暴露出后方的暗红色、扁平、长条状的脾。将脾剪下，放入盛有HANKS液的玻璃平皿中。漂洗脾脏，去掉PBS。继续用PBS漂洗直至清洗液清亮为止。

1.2培养方法

1．2.1 消化法

将脾脏转移至一个小的无菌培养皿中，用新的无菌剪刀小心地绞碎，用Hanks 液漂洗直到清亮为止。在无菌状态下，将绞碎的脾脏转移于一玻璃瓶中, 加入少许 0.25％的无菌胰蛋白酶,置于37 °C培养箱中静置20分钟。让存留的组织块在重力作用下慢慢沉降，后将胰蛋白酶吸干净，加入少许培养液终止消化。让残留的大块未破碎的组织或特殊颗粒物质沉降。可采用数层无菌纱布过滤细胞悬液以去除任何残留的细胞块。按每细胞瓶I x 106细胞的数量接种于10ml组织培养液中，在饱和湿度的37°C培养箱中孵育直至细胞铺满。

1．2.1 组织块法

将消毒好的脾脏在无菌平皿内用剪刀剪成2~5 mm2的小块,反复用Hanks冲冼,然后用镊子将组织块送入培养瓶中,在底部放均匀,小块间的相互距离以0·5 cm 为宜,轻轻翻转培养瓶,拧好瓶盖,置37℃培养箱中20min。后取出培养瓶,向培养瓶中加入适量的培养液,使液体缓缓地覆盖组织小块(勿过速),以防把组织块冲掉,再于温箱中继续培养。

1.2.3 细胞形态学观察

原代培养的细胞生长形态与体内基本上相似,从开始培养的第二天起，每天在第一次实验完成的同一时间进行观察并记录。细胞培养液的颜色为浅紫色，则需更换培养液。

2 结果分析

2.1.1 在未行细胞培养时，在显微镜下观察细胞的形态结构。如图1(×200)。

图1(左图为消化，又图为组织块)

以上即为在没有进行细胞培养时细胞形态比较稳定，而且可见细胞的数量比较多。几乎看不见单独的细胞，细胞大都聚集在一起。

2.1.2 细胞培养2天后，在显微镜下观察细胞的形态结构。如图2(×200)。

图2(左图为消化，又图为组织块)

培养一天后，可见细胞已开始生长，只是数量比较少。

2.1.3 细胞培养3天后，在显微镜下观察细胞的形态结构。如图3(×200)。

图3(左图为消化，又图为组织块)

培养3天后，可以明显的观察到细胞的数量增多，尤其是组织块周围的细胞已经开始成片向外延伸。

2.1.4 培养4天后，细胞生长的趋势更明显。，培养至第7天还是可以看到某些活的细胞，一般都是贴壁生长。但与一周前相比，明显的细胞数目减少，还可

以看到单独的细胞。同时细胞培养液的颜色为浅紫色，但是细胞培养过程中因为没有换培养液而使细胞存活率很低。

2.2 小鼠脾细胞生长曲线

图4小鼠脾细胞生长曲线

3 讨论

能够影响体外培养的细胞生长的因素很多,例如营养条件、培养温度、培养液的酸碱度等。营养条件是细胞体外生长的基本条件,体外培养细胞的营养条件主要通过培养液来供给。本实验中脾细胞的原代培养需要严格的无菌环境，通过本实验要进一步加强无菌环境的概念，只有无菌条件下，细胞才能不被污染而死亡，包括所用的仪器清洁灭菌，以及手的清洁；操作过程尽量不要用手直接接触一些接触培养液或细胞悬液的仪器，例如，枪头，针头等。还有可以一只手完成的不要用两只手同时操作。消化过程中，酶浓度过高或处理时间过长,细胞易破损死亡,剩余未损伤的细胞也不易贴壁生长;反之,酶浓度过低或处理时间过短,则细胞产量很低，因此酶浓度、处理温度和处理时间很重要。因此一定要掌握好酶的用量及消化时间

组织块法培养过程中，组织块应该剪的尽量小一些，便于组织块贴壁。同时将组织块送入培养瓶的过程也要避免镊子或手接触瓶口，以防污染。开始培养后，培养箱的温度控制也是实验的关键。在实验结果中可以看到，如果因为操作不当，最后细胞几乎全部死亡，培养液呈现浑浊状，而正常情况下，可以看到细胞液呈澄清的浅紫色，或偏黄（细胞代谢产物）。

参考文献：

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2003．13

[2]《分子细胞生物学》第三版韩贻仁主编高等教育出版社；

[3] 陈瑞铭.动物组织培养技术极其应用[M].北京:科学出版社,1998

[4] 李桂芳,李岩,赵宗胜等.绵羊耳成纤维细胞的体外培养[J].中国草食动

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