单分子免疫检测 PPT
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分子免疫学技术 ppt课件
诱导产生的免疫答应，在免疫学上称之为抗原。从抗原的化学结构
上分析，决定产生免疫答应的不是抗原的整个分子二十分子上的一
些特定的化学基团或结构，这些化学基团称为“抗原决定族”。它
们几十诱导机体产生抗体，有事抗原与抗体结合部位。因此，一个
复杂的蛋白质大分子可以有多个抗原决定族，如：甲状腺球蛋白有
个抗原决定族。具有多个抗原决定族的生物大分子可以诱导产生多
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微量免疫电泳不仅可以用于抗原抗体的定性和纯度鉴定，而且可以 用于临床诊断。 此法的优点是：检测灵敏度高，方法简便
－
＋ 2.5cm
7.5cm
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(4)火箭免疫电泳
火箭免疫电泳(rocket immunoelectrophoresis)又称单向定量免疫电
泳。抗原抗体出现的沉淀线的形状类是于子弹头，故火箭电泳也因
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1.3肌体内的免疫系统 在高等动物体内存在着具有免疫功能的组织主要有： 淋巴组织(中枢淋巴组织的胸腺，外周淋巴组织的淋巴 结，红骨髓，脾脏) 免疫活性细胞（T淋巴细胞,B淋巴细胞） 免疫活性介质（抗体，补体，淋巴因子）
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6
1.4外源抗原物质 组织、器官 细菌、病毒 红细胞 蛋白质、多糖 抗生素类药物 二价重金属离子
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测定抗原的效价是：抗体为原浓度，抗原采用二倍稀释法，沉淀显 出在最稀的一个稀释倍数就是该抗原的效价。 此法的优点是：测定效价时间短，数据准确。
7.5cm
－
＋ 2.5cm
抗抗 抗抗 抗抗 原体 原体 原体
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(3)微量免疫电泳 微量免疫电泳(micro-immunoelecrophoresis)是将免疫双扩 散和免疫电泳技术结合起来的一种检测方法，以此来提高 免疫检测的分辨率和灵敏度。 该方法是，首先将抗原通过琼脂糖凝胶电泳把抗原各个组 分分开，并沿抗原分离的边线开一个小槽，然后在槽内加 满抗体，抗体随琼脂糖凝胶介质的网状结构自由扩散，与 抗原的相应组分相遇出现白色沉淀线。
免疫检验课件ppt
移植免疫监测
器官移植后，患者需要接受免疫抑制治疗以防止排斥反应。通过监测免疫功能和相关抗体，有助于评估患者的免疫状态和移植效果。
02
CHAPTER
免疫检验基础知识
抗原是指能够刺激机体免疫系统产生特异性免疫应答的物质，包括外源性抗原和内源性抗原。
抗原
抗体是指机体在抗原刺激下产生的具有高度特异性的蛋白质分子，能够与相应抗原结合，发挥免疫效应。
通过检测T细胞增殖和转化能力，评估机体的细胞免疫功能。
通过检测细胞因子表达水平，了解机体的免疫应答状态。
通过检测免疫细胞的杀伤、吞噬、释放细胞因子等功能，评估机体的免疫功能。
利用基因芯片等技术对免疫相关基因的表达水平进行检测，了解机体的免疫应答机制。
基因表达谱分析
通过制备针对特定抗原的单克隆抗体，用于免疫学检测和免疫治疗。
通过检测炎症因子（如IL-1、IL-6、TNF等）的水平，了解机体的炎症反应状态。
通过检测自身抗体（如类风湿因子、抗核抗体等）的水平，了解机体的自身免疫状态。
04
CHAPTER
常见免疫检验项目及解读
总结词
乙肝两对半检测是常见的免疫检验项目之一，用于检测乙型肝炎病毒的抗原和抗体。
详细描述
乙肝两对半检测包括乙肝病毒表面抗原（HBsAg）、表面抗体（HBsAb）、e抗原（HBeAg）、e抗体（HBeAb）和核心抗体（HBcAb）的检测。通过检测这些抗原和抗体，可以了解个体是否感染了乙型肝炎病毒，以及感染阶段和免疫状态。
01
免疫组学技术
利用免疫组学方法，研究免疫细胞和分子的功能和相互作用，为免疫疾病的诊断和治疗提供新思路。
02
生物信息学
结合生物信息学技术，对免疫相关基因和蛋白质进行大数据分析，挖掘免疫相关疾病的发病机制和潜在治疗靶点。
免疫检测技术ppt课件
各实验室操作不规范，质量难以保证。有学者认为ELISA 技术已逐步走向退化，可能会逐步退出临床实验室。
• 化学发光免疫测定法出现于20世纪90年代初，是一种新
型标记免疫测定技术
• 化学发光是在常温下由化学反应产生的光的发射。其机
制为某些化合物（发光剂或发光底物）可以利用一个化
学反应产生的能量使其产物分子或反应中间态分子上升
• 标记物及其类别 • 常见三大免疫标记检测原理
• 随着基础免疫学研究的深入和现代免疫学
理论的建立，使大量免疫学检测技术被不 断地创新、发明；在临床疾病诊治的应用 中也不断地推陈出新。目前应用免疫学原 理检测的检验项目占到三级综合医院检验 科全部检验项目的1／4，医疗收入约占1／
• 三大常使用标记物质
土元素，需要外在的稳定光源照射，光的波长产生stoke位移，并
有一个时间滞后以化便学于发检光测波长改变后的光子时数间量分。辩荧光
标记物 酶-发光底物、发光剂
稀土离子，如铕
稳定性
稳定性非常好
影响被标记物的生物活性与免 疫活性
灵敏度
灵敏
稍高于化学发光
反应体系
接近中性
酸性，易引起蛋白质变性
包被技术
不透明微量孔壁吸附, 提高分析灵敏度,降低
大
• 标准曲线有效期短，必须每次定标，造成浪费 • 操作步骤很难自动化 • 反应时间长，出报告时间长
• 使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，加入酶
标抗原或抗体、酶反应的底物后，底物被酶催化 变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量 直接相关，故可根据颜色反应的深浅刊物定性或 定量分析
1971年Engvall和Perlman建立了固相酶免疫测定方法（ELISA），这种 非放射标记免疫测定在临床检验，特别是感染性疾病的诊断中取得了 广泛应用。 缺点 ➢试剂制备困难 ➢操作步骤复杂，耗时长 ➢影响因素多，质量控制难以保证 ➢最后测定的是颜色的光密度，其精密度、敏感性、可检测范围远不 如发光免疫技术
• 化学发光免疫测定法出现于20世纪90年代初，是一种新
型标记免疫测定技术
• 化学发光是在常温下由化学反应产生的光的发射。其机
制为某些化合物（发光剂或发光底物）可以利用一个化
学反应产生的能量使其产物分子或反应中间态分子上升
• 标记物及其类别 • 常见三大免疫标记检测原理
• 随着基础免疫学研究的深入和现代免疫学
理论的建立，使大量免疫学检测技术被不 断地创新、发明；在临床疾病诊治的应用 中也不断地推陈出新。目前应用免疫学原 理检测的检验项目占到三级综合医院检验 科全部检验项目的1／4，医疗收入约占1／
• 三大常使用标记物质
土元素，需要外在的稳定光源照射，光的波长产生stoke位移，并
有一个时间滞后以化便学于发检光测波长改变后的光子时数间量分。辩荧光
标记物 酶-发光底物、发光剂
稀土离子，如铕
稳定性
稳定性非常好
影响被标记物的生物活性与免 疫活性
灵敏度
灵敏
稍高于化学发光
反应体系
接近中性
酸性，易引起蛋白质变性
包被技术
不透明微量孔壁吸附, 提高分析灵敏度,降低
大
• 标准曲线有效期短，必须每次定标，造成浪费 • 操作步骤很难自动化 • 反应时间长，出报告时间长
• 使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，加入酶
标抗原或抗体、酶反应的底物后，底物被酶催化 变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量 直接相关，故可根据颜色反应的深浅刊物定性或 定量分析
1971年Engvall和Perlman建立了固相酶免疫测定方法（ELISA），这种 非放射标记免疫测定在临床检验，特别是感染性疾病的诊断中取得了 广泛应用。 缺点 ➢试剂制备困难 ➢操作步骤复杂，耗时长 ➢影响因素多，质量控制难以保证 ➢最后测定的是颜色的光密度，其精密度、敏感性、可检测范围远不 如发光免疫技术
单分子免疫检测
---------------------------------------------------------------最新资料推荐------------------------------------------------------单分子免疫检测单分子免疫检测11/ 28IVD领域的7大技术创新√ 检测精准度√ 检测便利性√ 检测效率1、三代测序技术：纳米孔单分子测序：Pacific Biosciences和Oxford Nanopore2、单分子免疫检测：Quanterix的Simoa系统和Merck的SMC系统3、数字PCR：ABI（Applied Biosystems）和Bio-Rad4、流式液相芯片：透镜生命和旷博生物5、微流控技术：理邦血气、微点生物、天津微纳芯、博晖创新、博奥生物6、光激发光化学发光技术：科美诊断、爱兴生物7、质谱检测：迪安诊断、金域医学、安图生物2---------------------------------------------------------------最新资料推荐------------------------------------------------------ 蛋白生物标志物的开发速度仍显缓慢年均仅有1-2个新的生物标志物进入临床应用现有技术的瓶颈极大限制了蛋白生物标志物的发展33/ 28检测水平达到pg/mL或fg/mL级别,甚至单分子?生物分析检测领域，最小极限尺寸-------单分子水平?见“微”知著突破极限 ?超高灵敏蛋白检测：助力揭示微妙生物学事件。
?检测对象：细胞因子等，因浓度极低，pg/mL或fg/mL级别。
4---------------------------------------------------------------最新资料推荐------------------------------------------------------ 区分健康，风险与疾病个体突破检测极限，不但能诊断疾病，还能预知风险。
免疫功能检查PPT课件
免疫功能检查ppt课件
• 免疫系统概述 • 免疫功能检查的方法与技术 • 常见免疫功能异常疾病 • 免疫功能检查的临床意义与价值 • 未来免疫功能检查的发展方向
01
免疫系统概述
免疫系统的定义与功能
免疫系统的定义
免疫系统是人体内的一个复杂的 网络系统，由多个器官、组织和 细胞组成，负责抵御外来病原体 入侵，维持内环境稳定。
免疫系统在组织损伤后能够促进修复和再 生，帮助身体恢复健康。
免疫系统具有自我调节功能，能够根据不 同的抗原刺激产生相应的免疫应答，防止 过敏反应和自身免疫疾病的发生。
02
免疫功能检查的方法与技术
血液免疫检测
血液免疫检测是通过采集患者的血液样本，检测其中的免疫细胞数量、免疫分子水 平以及免疫细胞活性等指标，以评估患者的免疫状态。
免疫系统的功能
免疫系统具有识别、清除外来抗 原，促进组织修复和再生，以及 调节免疫应答等重要功能。
免疫系统的组成
01
02
03
免疫器官
骨髓、胸腺、淋巴结、脾 脏等是免疫系统的主要器 官，负责产生和存储各种 免疫细胞。
免疫细胞
淋巴细胞、巨噬细胞、树 突状细胞等是免疫系统的 主要细胞，负责执行免疫 应答和防御功能。
免疫分子
抗体、细胞因子、补体等 是免疫系统产生的生物活 性物质，参与免疫应答和 炎症反应。
免疫系统的重要性
抵御病原体入侵
维持内环境稳定
免疫系统能够识别和清除外来病原体，如 细菌、病毒、真菌等，防止感染发生。
免疫系统能够清除体内异常细胞，如肿瘤 细胞，维持内环境的稳定和健康。
促进组织修复和再生
调节免疫应答
常见的血液免疫检测方法包括血常规检查、免疫球蛋白检测、补体检测、细胞因子 检测等。
• 免疫系统概述 • 免疫功能检查的方法与技术 • 常见免疫功能异常疾病 • 免疫功能检查的临床意义与价值 • 未来免疫功能检查的发展方向
01
免疫系统概述
免疫系统的定义与功能
免疫系统的定义
免疫系统是人体内的一个复杂的 网络系统，由多个器官、组织和 细胞组成，负责抵御外来病原体 入侵，维持内环境稳定。
免疫系统在组织损伤后能够促进修复和再 生，帮助身体恢复健康。
免疫系统具有自我调节功能，能够根据不 同的抗原刺激产生相应的免疫应答，防止 过敏反应和自身免疫疾病的发生。
02
免疫功能检查的方法与技术
血液免疫检测
血液免疫检测是通过采集患者的血液样本，检测其中的免疫细胞数量、免疫分子水 平以及免疫细胞活性等指标，以评估患者的免疫状态。
免疫系统的功能
免疫系统具有识别、清除外来抗 原，促进组织修复和再生，以及 调节免疫应答等重要功能。
免疫系统的组成
01
02
03
免疫器官
骨髓、胸腺、淋巴结、脾 脏等是免疫系统的主要器 官，负责产生和存储各种 免疫细胞。
免疫细胞
淋巴细胞、巨噬细胞、树 突状细胞等是免疫系统的 主要细胞，负责执行免疫 应答和防御功能。
免疫分子
抗体、细胞因子、补体等 是免疫系统产生的生物活 性物质，参与免疫应答和 炎症反应。
免疫系统的重要性
抵御病原体入侵
维持内环境稳定
免疫系统能够识别和清除外来病原体，如 细菌、病毒、真菌等，防止感染发生。
免疫系统能够清除体内异常细胞，如肿瘤 细胞，维持内环境的稳定和健康。
促进组织修复和再生
调节免疫应答
常见的血液免疫检测方法包括血常规检查、免疫球蛋白检测、补体检测、细胞因子 检测等。
免疫检测法PPT课件
质。
缺点
01
02
03
04
交叉反应
有时会出现交叉反应，导致假 阳性结果。
抗体依赖
免疫检测法依赖于抗体的质量 和特异性，因此抗体制备的难
度和成本较高。
样品处理要求高
对于某些生物样品，需要进行 复杂的预处理才能进行检测。
检测时间较长
相对于一些快速检测方法，免 疫检测法可能需要更长时间才
能获得结果。
改进方向
分类
根据检测原理和应用领域，免疫 检测法可分为酶联免疫吸附试验 、放射免疫分析、荧光免疫分析 、化学发光免疫分析等。
免疫检测法的应用领域
01
02
03
医学诊断
用于检测人体内的肿瘤标 志物、激素、病毒抗原、 药物残留等，辅助医生进 行疾病诊断和病情监测。
食品安全
用于检测食品中的农药残 留、兽药残留、毒素等有 害物质，保障食品安全。
情监测。
激素水平检测
性激素检测
通过检测性激素水平，有助于评估男性和女性的生殖健康状况，如 睾酮、雌二醇、孕酮等激素的检测。
甲状腺激素检测
甲状腺激素对人体的新陈代谢和生长发育具有重要作用，通过检测 甲状腺激素水平，有助于甲状腺功能亢进和减退的诊断和治疗。
肾上腺激素检测
肾上腺激素与人体应激反应、免疫功能等方面密切相关，通过检测肾 上腺激素水平，有助于相关疾病的诊断和治疗。Fra bibliotek传染病检测
结核病检测
性病检测
通过检测结核病抗体，有助于早期发 现和诊断结核病，为预防和治疗提供 依据。
免疫检测法在性病检测中发挥着重要 作用，如梅毒、淋病、尖锐湿疣等， 通过检测相关抗体和抗原，及时发现 和治疗性病。
肝炎检测
缺点
01
02
03
04
交叉反应
有时会出现交叉反应，导致假 阳性结果。
抗体依赖
免疫检测法依赖于抗体的质量 和特异性，因此抗体制备的难
度和成本较高。
样品处理要求高
对于某些生物样品，需要进行 复杂的预处理才能进行检测。
检测时间较长
相对于一些快速检测方法，免 疫检测法可能需要更长时间才
能获得结果。
改进方向
分类
根据检测原理和应用领域，免疫 检测法可分为酶联免疫吸附试验 、放射免疫分析、荧光免疫分析 、化学发光免疫分析等。
免疫检测法的应用领域
01
02
03
医学诊断
用于检测人体内的肿瘤标 志物、激素、病毒抗原、 药物残留等，辅助医生进 行疾病诊断和病情监测。
食品安全
用于检测食品中的农药残 留、兽药残留、毒素等有 害物质，保障食品安全。
情监测。
激素水平检测
性激素检测
通过检测性激素水平，有助于评估男性和女性的生殖健康状况，如 睾酮、雌二醇、孕酮等激素的检测。
甲状腺激素检测
甲状腺激素对人体的新陈代谢和生长发育具有重要作用，通过检测 甲状腺激素水平，有助于甲状腺功能亢进和减退的诊断和治疗。
肾上腺激素检测
肾上腺激素与人体应激反应、免疫功能等方面密切相关，通过检测肾 上腺激素水平，有助于相关疾病的诊断和治疗。Fra bibliotek传染病检测
结核病检测
性病检测
通过检测结核病抗体，有助于早期发 现和诊断结核病，为预防和治疗提供 依据。
免疫检测法在性病检测中发挥着重要 作用，如梅毒、淋病、尖锐湿疣等， 通过检测相关抗体和抗原，及时发现 和治疗性病。
肝炎检测
单分子免疫检测技术
单分子免疫检测技术摘要：单分子免疫检测技术是近年来免疫学研究的热点之一。
该技术采用单分子水平的检测技术，即通过检测单个免疫分子的信号，实现对生物分子的高灵敏度检测。
本文介绍了单分子免疫检测技术的原理、方法和应用，并探讨了该技术在生物医学研究中的前景。
关键词：单分子、免疫检测、高灵敏度、生物医学研究1. 简介单分子免疫检测技术作为当前生物医学研究的前沿技术，近年来备受关注。
该技术采用高灵敏度的免疫检测方法，能够在单分子水平对生物分子进行检测，有很大的潜力在生物医学领域得到广泛应用。
2. 原理在单分子免疫检测技术中，一般采用分子间距离的检测方法。
这种方法利用特定的荧光标记对目标物质进行标记，然后将标记后的物质压缩到纳米尺度的玻璃管中，实现单分子尺度的检测。
3. 方法（1）样品制备：将待测物质与免疫特异性分子结合，标记待测物质，制备标记物质浓度一定的样品。
（2）玻璃管制备：制备玻璃管并将标记过的待测物质注入玻璃管中，其中玻璃管的内径与样品分子尺寸相当，以便形成单分子水平的检测。
（3）荧光显微镜检测：利用荧光显微镜等高灵敏度的检测设备检测待测物质与特定分子识别物的相互作用，并将其转化成荧光信号。
4. 应用（1）疾病诊断：单分子免疫检测技术可以在高灵敏度下检测生物分子，例如病毒、癌症等生物标志物，有助于疾病的早期诊断。
（2）药物研发：单分子免疫检测技术可以在单分子水平对药物和生物分子之间的相互作用进行检测，有助于快速研发出更加高效的药物。
（3）生物学研究：单分子免疫检测技术在分子生物学、细胞生物学等领域中有着很广泛的应用，例如检测细胞内各种分子的运动、互作等。
5. 展望单分子免疫检测技术具有高灵敏度、高精度等显著优点，因此在生物医学研究中有着广泛的应用前景。
未来，该技术有望应用于更多领域，例如早期癌症筛查、药物研发等领域，同时还有望提高生物医学的研究水平和治疗效果。
随着近年来免疫学的不断发展，单分子免疫检测技术也得到了更多的研究和应用。
免疫检测技术ppt课件
(RIA)
示
测定Ag*-Ab和游离Ag*放射性
意
图
从标准曲线上读知含量
33
RIA法原理Leabharlann 标准曲线/结 合75
未
结 合 50
的
放 射
30
活
性 10
（
0
）
Ag*-Ab Ag*
1
10
100
未标记抗原浓度（ng/mL)
1000
34
%
2. 免疫荧光技术
将荧光素（异硫氰酸荧光素或罗丹明等）标记抗体， 制成荧光抗体诊断试剂。 用荧光显微镜观察荧光的产生或荧光强度，以此判断 抗原的存在、定位和分布情况。 免疫荧光技术有直接法和间接法等。
52
ABS-ELISA法
①：固相支持物； ②：样品； ③：特异性IgG； ④：生物素化抗小鼠IgG （Biotin）； ⑤：辣根过氧化物酶HRP-酶标链亲和素（Avidin）； ⑥：DAB显色液； ⑦：显色；
53
35
免疫荧光技术——直接法
荧光素标记的 特异性抗体
Ag 组织切片
36
免疫荧光技术——间接法
待测抗体
荧光素标记 的抗抗体
Ag 组织切片
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免疫荧光染色显示细胞骨架
人皮肤角化细胞免疫荧光染色
免疫荧光染色是利用抗原－抗体特异性结 合的原理，用经荧光染料标记的抗体对细胞 或组织内的蛋白质进行定性或定量研究的方 法。该技术与荧光显微镜观察相结合，可对 特定的蛋白质进行细胞或组织内的精确定位。
①特异性：抗原抗体反应具有高度的特异性。 ②可逆性：抗原抗体反应所形成的复合物较稳定，
但在一定条件下可解离。（低酸、高盐） ③比例性：抗原抗体的比例合适，才可出现可见的
第三章免疫学检测技术精品PPT课件
第二节 免疫组织化学检测技术
抗原＋抗体（特异性）＋酶标记抗体，通过酶与 底物作用生成有色反应物，定位组织或细胞内抗 原的一门技术。 免疫组织化学：用带标记物的抗体或抗原在组织细 胞原位通过抗原抗体反应或组织化学反应，对相 应抗或抗体进行定性、定量、定位测定的技术。
免疫组化分类
免疫组织化学技术按照标记物的种类可分为： 免疫荧光法 免疫酶法 免疫铁蛋白法 免疫金法 放射免疫自显影法 按标记抗体的方式分： 标记抗体IHCT法 非标记抗体IHCT法
抗原（多价）抗体（2价或以上）不等价性，使 抗原抗体反应时存在比例关系，生成物的量与 反应物的量（浓度）有关。
比例性：抗原抗体结合生成复合物的量与反应 物浓度的关系。
只有2者分子比例合适，结合价相互饱和，才生 成可见的复合物。
在等价带区的溶液中几乎不存在游历的抗原和 抗体。
滴度（效价）指抗原或抗体与一定量的对应物 产生明显可见的反应所需的最小量。
• 可作为抗原的物质有 酶、 受体、 抗体、 细 胞外基质 激素、 细胞结构蛋白、病原体。
二、免疫标记物显色原理
① 免疫酶测定法 ② 免疫荧光技术 ③ 放射免疫测定法 ④ 免疫胶体金技术
①免疫酶测定法
a) 夹心法ELISA
b) 间接ELISA
a）
c) BAS—ELISA 利用生物
素和抗生物素蛋白为桥梁
单向免疫扩散 Ab in gel
用于确定 抗原浓度
Ag
Ag
Ag
Ag
免疫比浊
过量Ab Ab
Ab
Ab
双向免疫扩散
Ag1 Ag2
Ag3
Ag4
Ab
鉴定多种抗原是完全相同、 部分相同或完全不同
沉淀反应—免疫电泳
免疫学检测技术PPT课件
单核细胞（monocyte）。 Ficoll分离液法主要用于分离外周血中的单个核细
胞，是一种单次差速密度梯度离心的分离法。
41
细胞分离基本原理
不同细胞密度不同 不同细胞表面生物学特性不同 不同细胞表面分化抗原不同
42
不同细胞密度不同
人的红细胞密度为1.093 粒细胞密度为1.092 单个核细胞（淋巴细胞和单核细胞）的密度为 1.075-1.090
将发光分析系统和免疫测定相结合而建立的一种新的超微量 免疫分析技术。
优点：该方法既具有免疫反应的高度特异性又有发光分析的 高灵敏度。
30
化学发光免疫测定 吖啶酯、鲁米诺 生物发光免疫测定 萤火虫、发光水母
化学发光酶免疫测定 辣根过氧化物酶（HRP） 碱性磷酸酶（AP） 电化学发光免疫测定
37
第三节 免疫细胞功能的检测
38
39
免疫细胞的分离
外周血单个核细胞分离 淋巴细胞的分离 T细胞和B细胞的分离 T细胞亚群的分离
40
(一)外周血单个核细胞分离
外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells, PBMCs）包括淋巴细胞和
66
应用与方法学评价：
该方法既可检测抗体分泌细胞，又可检 测抗体分泌量。 优点：
稳定、特异、抗原用量少； 可同时检测不同抗原诱导的不同抗体分泌，并可定量； 可检测组织切片中分泌抗体的单个细胞。
67
ELISPOT技术简介
酶联免疫斑点试验( Enzyme linked immunospot assay) 80 年代，国外的科研工作者根据 ELISA 技术的基本原理，
非遗传控制的的意外的细胞 坏死（accidental cell death）
胞，是一种单次差速密度梯度离心的分离法。
41
细胞分离基本原理
不同细胞密度不同 不同细胞表面生物学特性不同 不同细胞表面分化抗原不同
42
不同细胞密度不同
人的红细胞密度为1.093 粒细胞密度为1.092 单个核细胞（淋巴细胞和单核细胞）的密度为 1.075-1.090
将发光分析系统和免疫测定相结合而建立的一种新的超微量 免疫分析技术。
优点：该方法既具有免疫反应的高度特异性又有发光分析的 高灵敏度。
30
化学发光免疫测定 吖啶酯、鲁米诺 生物发光免疫测定 萤火虫、发光水母
化学发光酶免疫测定 辣根过氧化物酶（HRP） 碱性磷酸酶（AP） 电化学发光免疫测定
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第三节 免疫细胞功能的检测
38
39
免疫细胞的分离
外周血单个核细胞分离 淋巴细胞的分离 T细胞和B细胞的分离 T细胞亚群的分离
40
(一)外周血单个核细胞分离
外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells, PBMCs）包括淋巴细胞和
66
应用与方法学评价：
该方法既可检测抗体分泌细胞，又可检 测抗体分泌量。 优点：
稳定、特异、抗原用量少； 可同时检测不同抗原诱导的不同抗体分泌，并可定量； 可检测组织切片中分泌抗体的单个细胞。
67
ELISPOT技术简介
酶联免疫斑点试验( Enzyme linked immunospot assay) 80 年代，国外的科研工作者根据 ELISA 技术的基本原理，
非遗传控制的的意外的细胞 坏死（accidental cell death）
免疫学检测技术(课堂PPT)
.
42
二、沉淀反应
抗原抗体为单一体系时，抗原浓度不同， 沉淀弧的特征不同：
抗原抗体为多体系时，出现的沉淀弧
有多条，彼此互不干.扰。
43
• 二、沉淀反应
4、单向免疫扩散：又称单向琼脂扩散，是定 量抗原的一种检测方法。与双向扩散不同的 是在琼脂中含有一定量的抗体，孔内加入未 知量的相应抗原。在37度保温过程中，孔内 的抗原向周围扩散，与抗体形成沉淀圈。根 据沉淀圈的大小确定抗原的含量
.
63
第三节 免疫酶技术在食品检测中的应用
ELISA 基本原理
碱
性
磷
酸
酶
或
过
氧
化
物
酶
.
64
第三节 免疫酶技术在食品检测中的应用
酶联免疫吸附剂测定 enzyme linked immunosorbent assay，ELISA
二、ELISA的种类 P320 直接法测定抗原 间接法测定抗体 双抗体夹心法测定抗原 双抗原夹心法测定抗原 竞争法测定抗原
• 抗原或抗体检测原理：
抗原抗体的结合具有高度专一性
借助抗原和抗体在体外特异结合后出现的各种
现象，对标本中的抗原或抗体进行定性或定量的
检测。
.
31
对抗原或抗体进行定性或定量的检测的原理
Ab excess
Ag excess
Equiv.alence – Lattice formation 32
对抗原或抗体进行定性或定量检测的原理
.
8
免疫的功能： 1. 抵抗感染（Defense）：机体能抵抗病原微生物 侵袭的能力。又称免疫防御。
抗菌、抗病毒、抗真菌、抗寄生虫免疫
2. 自身稳定（Homeostasis）：机体在新陈代谢过 程中，产生大量的衰老死亡细胞，免疫的第二个功能 就是清除这些细胞，维持机体的生理平衡。
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Simoa技术参数
反应体系：2.7 μm抗体包被磁珠+生物素化的检测抗体+链霉亲和素半乳糖甘酶
1个磁珠包被250000个捕获抗体，靶点分子极少的时候，1个磁珠仅补获1个蛋白分子
检测体系： 加入底物的磁珠转移到 Simoa 光盘上。 每个光盘有24个芯片（Array）， 每个芯片 有238000个直径为4.25 μm 的小孔，1个小孔仅能容纳一个磁珠 小孔体系仅有50 fL，在芯 片表面推一层油，一方面除去多余磁珠，另一方面将信号密 封在小孔中。 信号CCD 成像。
4、流式液相芯片：透镜生命和旷博生物
5、微流控技术：理邦血气、微点生物、天津微纳芯、博晖创新、博奥生物
6、光激发光化学发光技术：科美诊断、爱兴生物
7、质谱检测：迪安诊断、金域医学、安图生物
蛋白生物标志物的开发速度仍显缓慢 年均仅有1-2个新的生物标志物进入临床应用
现有技术的瓶颈极大限制了蛋白生物标志物的发展
SMC系统原理
SMC系统检测灵敏度
SMC系统检测灵敏度
单分子免疫检测技术发展瓶颈
（1）稳定性及效率 操作复杂，不稳定。 SiMoA检测时长1小时， SMC检测时长4小时。
（2）成本； 耗材昂贵。
（3）替代的必要性。 作为生物检测技术的极限尺子，单分子检测技术取代现有诊断技术成为市场的主流 是将来体外诊断市场发展的趋势。
2. Simoa可以通过加大稀释倍数，检测房水、玻璃体、眼泪等微量样品 中的炎症因子；
3. Simoa可以在单个细胞中定量蛋白，实现单个胚胎细胞培养上清中的 蛋白检测；
4. Simoa可以在外泌体等稀少样品类型中检测PD1、PD-L1等蛋白；
5. Simoa可以在阿尔兹海默症初期（提前16年），在接近正常人的患者 血清中检测到蛋白标志物NfL
单分子免疫检测
IVD领域的7大技术创新
√ 检测精准度 √ 检测便利性 √ 检测效率
1、三代测序技术：纳米孔单分子测序 ：Pacific Biosciences和 Oxford Nanopore
2、单分子免疫检测：Quanterix的Simoa系统和Merck的SMC系统
3、数字PCR：ABI（Applied Biosystems）和Bio-Rad
商品化单分子免疫检测的技术平台 Quanterix公司的SiMoA系统和Merck的SMC系统
美国Quanterix公司的创始人是David Walt，大学化 学系的教授，美国国家科学院和工程院的双料院士 ，基因测序龙头企业Illumina公司的创始人之一。 2007年，David Walt在美国创立Quanterix Corporation，首次推出SiMoA技术。 2013年推出科研系列产品——基于SiMoA技术的检 测设备。 2015年推出第二代基于SiMoA技术的检测设备。
Simoa检测内容
Simoa检测内容
Simoa实测灵敏度范围
SiMoA系统的投融资
2016年乐普（北京）医疗器械股份有限公司第一期1100万美元的募资将全 额投给Quanterix公司，参与其D轮投资，以增资方式获得5.35%股权。
2017年12月Quanterix在美国纳斯达克上市，目前全球已有200+装机用户。 2018年1月，杭州蓝科技有限公司成为美国quanterix公司中国区总代理
50 fL 的反应体系比ELISA 100 μL 的体系小了20亿倍。灵敏度提高1000倍。 已开发120多个相关试剂盒，同时 Simoa 是开放平台。 兼具蛋白检测与核酸分子检测的通用技术平台。
Simoa检测内容
1. Simoa可以在血清/血浆中检测NfL、Tau、pTau、Aβ40、Aβ42等超低 丰度神经因子；
星童医疗的Pylon 3D循环增强荧光免疫技术接近单分子检测水平
研发药物的代谢动力学和药物效应动力学分析
治疗性抗体与抗凝全血孵育后细胞因子释放检 测
监测及预防肿瘤免疫治疗并发症：细胞因子释放综合征
大家学习辛苦了，还是要坚持
继续保持 安静
单抗治疗前后细胞因子水平: 100% 可被检测 TNF-α：0.1 pg/mL ，IL-2：0.2 pg/mL
数字PCR对单分子免疫的启示
检测水平达到pg/mL或fg/mL级别,甚至单分子
➢生物分析检测领域，最小极 限尺寸-------单分子水平
➢见“微”知著突破极限
➢超高灵敏蛋白检测：助力揭 示微妙生物学事件。
➢检测对象：细胞因子等，因 浓度极低，pg/mL或fg/mL级 别。
区分健康，风险与疾病个体
突破检测极限，不但能诊断疾病，还能预知风险。
单分子免疫检测SMC系统
SMC（SingleMolecule Counting）系统最早由Singulex公司开发。Erenna系统 是SMC第一代单分子检测设备。通过流式分子扫描检测的方法，实现分子计数 功能。 2015年由Merck Life Technology收购其使用权。
2018年，Merck公司推出第二代单分子免疫检测设备SMCxPRO。
血清心肌肌钙蛋白cTnI本底高，未来风险也较高
血液中的cTnl都可被精确检测，并且99%个 体的表达水平都在10.19pg/mL以下，大多 数个体的实测值在1-2pg/mL之 间。
cTnI 大多数个体的实测值在1-2pg/mL之间
助力单抗药物研发
Pfizer辉瑞哮喘候选药物IMA638和IMA026 哮喘诱发因 素IL-13的动态监测
Illumina是由David Walt博士、CW 集团的Larry Bock 、兽医学博士John Stuelpnagel、 Anthony Czarnik博 士及Mark Chee博士于1998年4月共同组建。
SiMoA系统原理
微孔（3μm左右）
SiMoA系统原理
蛋白生物标志物的开发速度仍显缓慢
国内单台设备售价超过20万美元，96人份的试剂盒市场售价均超过2000美元， 研发用试剂盒更是高达6000美元（30test）。
截至目前为止，该设备国内销量已超过6台。
Merck SMCxPRO™单分子免疫检测仪
“艾里斑” 逐个扫描荧光标记的检测抗体
单分子免疫检测仪
蛋白质定量检测进入----飞克级时代!