验一 半数致死量的测定

验一半数致死量的测定

半数致死量（LD 50 ）是药物、毒物及病原微生物等毒力水平的一个标志。它表示能使全部实验对象死亡半数的剂量或浓度。

由于生物间存在个体差异性，因此LD 50 需用一批相当数量的实验对象进行实验方能测得，并且每种药物不同实验对象的LD 50 值不相同。

测定LD 50 的方法很多，如目测机率单位法、直线回归法、累计法及序贯法等。由于寇氏法较常用，

并有计算简便，结果较准确等特点，故专门介绍之。

[ 目的] 用寇氏法测定敌百虫对小白鼠的经腹腔注射的LD 50 和95 ％可信限。

[ 方法] 寇氏法（K ?rbar氏法）

[ 条件]

1 剂量必须按等比级数（剂量对数按等级数）分组。

2 各组动物数应相等。

3 “反应”应大致呈正态分布。最小剂量组的死亡率（P n ）应为0% ，最大剂量组的死亡率（P m ）应为100% ；

如果P n <20% 或P m >80% 需用校正公式计算；如P n >20% 或P m <80%

则不能用此法计算。

[ 步骤]

1 预备实验

（ 1 ）摸索上下限：即用少量动物逐步摸索出使全部动物死亡的最小剂量（D m ）和一个动物也不死亡的最大剂量（D n ）。

方法是据经验或文献定出一个估计量，观察2~3 只动物的死亡情况。如全死，则降低剂量；如全不死，则加大剂量再行摸索，

直到找出P m =100% 和P n =0% 的剂量，此两量分别为上下限。

（ 2 ）确定组数，组距及各组剂量

①组数：一般 5 ～8 组，可根据适宜的组距确定组数，如先确定5 组，若组距过大，可再增加组数以缩小组距。

有时也可根据动物死亡情况来决定增减组数。

②组距：指相邻两组剂量对数之差，常用“ d ”来表示。D 不宜过大，因过大可使标准误增大；也不宜过小，因过小则组数增多，

各组间死亡率重叠造成实验动物的浪费。组距大小主要取决于实验动物对被试因素的敏感性。敏感性大者，死亡率随剂量增加（或减少）

而增加（或减少）的幅度大，组距可小些；反之，敏感性小者，死亡率随剂量变化的幅度小，则组距应大些。上下限之间的距离可作为

敏感性大小的标志。距离大，说明敏感性小；距离小，则说明敏感性大。一般要求d 应小于0.155 ，多在0.08 ～0.1 之间。

③确定组距方法：把上下限的剂量换算成对数值，设上限剂量的对数值为X k ，下限剂量的对数值为X 1 ，组数为G ，则：

d ＝（X k -X 1 ）/ （G-1 ）

④确定各组剂量：由X 1 逐次加 d （或由X k 逐次减 d ），得出各组剂量的对数值，再分别查反对数，

即得出各组剂量（呈等比级数排列）。

（ 3 ）配制等比药液，并使每只动物在给药容量上相等（如0.5ml/20g ）。

⒉正式实验

（ 1 ）实验动物的选择与分组

①选择原则：可根据不同实验而选取动物，应选择对被试因素敏感的动物。同时也应考虑动物来源，经济价值及操作简便等条件。

LD 50 常用小白鼠进行实验来测得。

②分组原则：每组动物数必须多于组数。因为每组动物数如少于组数，就不能充分反映各组死亡率的差别。（如共8 组，

每组10 只动物，高剂量三个组的死亡数分别为6 、9 、10 ，但如果每组只用6 只动物，则高剂量三个组的死亡数可能都是6 。）

③分组方法：见附录，实验对象分组法。首先，按性别将动物雌雄分开或各半混合编组，然后按体重分群，再随机分组，

为求使各组平均体重相等。

（ 2 ）给药、观察死亡数、求出死亡率

①给药途径：可据不同药物及动物而定，小白鼠多用腹腔注射或灌胃法；也可静脉注射。

②给药顺序：宜采取间隔跳组方法。如共7 组，先按2 、 4 、 6 组顺序给药，然后逆行按7 、 5 、 3 、 1 组的顺序给药。

这样可避免药物放置过久或动物饥饿造成的偏向性误差。而且当第3 组给药后，如第2 组动物已经全死，则可省下第1 组动物及

1 号药液。如第7 组已死亡，可补做第8 组，争取做出0 ﹪死亡率的组来。每只动物的给药容量可按个体体重或平均体重确定。

③观察时间：直到动物不再因药物作用而死亡为止。在观察期间应注意保证食、水、温度等生活条件，严防非被试因素引起的死亡。

最后将死亡情况及各种数据填入下表中。

3. 计算公式

①基本公式㏒LD 50 ＝X K －d( ∑ P-0.5)

式中：X K 死亡率为100 ﹪组的对数剂量

d 对数组距

∑ P 各组死亡率之和

②校正公式

当Pm>0.8 或Pn<0.2 时可用下公式计算

3-Pm-Pn

㏒LD 50 ＝X K －d( ∑ P - ───── )

4

③LD 50 ＝㏒-1 ㏒LD 50 ，单位应换算成mg ∕ kg 或g ∕ kg 表示。

④95 ％可信限：

LD 50 ± 4.5S ㏒LD50 .LD 50

S ㏒LD50 ＝d√∑p（1-p）/（n-1）

式中：S ㏒LD50 ㏒LD 50 的标准误

P 各组死亡率

n 每组动物数

[ 测定LD 50 的原理及公式来源]

为了解LD 50 测定原理，首先需了解剂量与反应的关系。某被试因素对动物的毒性也是一种反应，

其大小往往以其使动物致死的量表示。致死量小说明毒性大，反之说明毒性小。根据剂量与反应的关系，

可绘出剂量反应曲线（量效曲线）。图中表示的是以死亡频数和死亡率为反应指标的质反应量效曲线，它们具有如下特点：

1. 剂量与死亡频数的关系：是一条中间高，两侧低，右侧延长较远的曲线（图5-a ）

2. 对数剂量与死亡频数的关系：是正态分布曲线（图5-b ）

3. 剂量与死亡率的关系：是一条长尾“ S ”形曲线（图5-d ）

4. 对数剂量与死亡率的关系：是一正“ S ”形曲线（图5-c ）

从对数剂量与死亡频率的正态分布中（5-b ）可见，㏒LD 50 恰在正态曲线中点所对应的横轴上，按此剂量给药动物恰好死亡一半。

因在正态曲线中，其中点恰是均数所在处，所以㏒LD 50 就是全部实验动物最小致死剂量对数的算术平均值（也是真数剂量的几何平均值）。

从对数剂量与死亡率关系的正S 形曲线（图5-c ）中可见，㏒LD 50 恰为正S 形曲线中点所对应的横轴上的对数值，

因此正S 形曲线中点对应的纵轴（死亡率）恰为50 ％。这条曲线的特点是：①死亡率为50 ％（即LD 50 ）时的斜率最大，

由于其位于曲线中央，故灵敏度最高。②曲线两端平坦，接近0 ％或100 ％附近灵敏度最差，剂量不易确定，而且即使确定了也常不可靠。

所以采用半数致死量做为判定某因素毒性大小的指标是恰当的。总之，如果求出正态曲线中点所对应的横轴上的对数值或正S 形曲线

中点所对应的横轴上的对数值，即可求出㏒LD 50 及LD 50 。

公式推导：根据对数剂量与死亡率关系的量数曲线，通过面积法可得出公式：