人外周血单核细胞(PBMC)分离及培养
人外周血单核细胞(PBMC)分离及培养
Ficoll是蔗糖的多聚体，呈中性，平均分子量为400,000，当密度为1.2g/ml仍未超出正常生理性渗透压,也不穿过生物膜。红细胞、粒细胞比重大，离心后沉于管底；淋巴细胞和单核细胞的比重小于或等于分层液比重，离心后漂浮于分层液的液面上，也可有少部分细胞悬浮在分层液中。吸取分层液液面的细胞，就可从外周血中分离到单个核细胞。
③取两支15ml离心管，先加入5ml Ficoll溶液。然后将稀释的血液轻轻加到两支离心管的ficoll上层，一定要轻柔，避免两种溶液混合在一起，每只离心管各10ml稀释血液；
④2,000rpm，20min，注意，降速设置中一定要设置成no break，或者只有1-2成的制动。离心完毕将得到如图所示分层；
双抗P/S （Penicillin/ Streptomycin) (GIBCO)
二甲亚砜（DMSO）（SIGMA）
预先装好异丙醇的冻存盒
方法/步骤：
①配制所需的溶液：
a. 细胞培养基：RPMI 1640+10% FBS+1% P/S；
b. 细胞冻存液：FBS中加入10%DMSO；
②将10ml全血转入50ml离心管中，加入10ml PBS溶液稀释，轻轻混匀；
⑤PBMC所在细胞层为白色。此时可以用吸管将该层细胞吸取在另一干净的15ml离心管中。
人外周血单个核细胞的采集、分离和保存标准
人外周血单个核细胞的采集、分离和保存标准全文共四篇示例，供读者参考第一篇示例：人外周血单个核细胞（Peripheral Blood Mononuclear Cells, PBMCs）的采集、分离和保存是在医学研究和临床诊断中非常重要的步骤。
PBMCs是一类具有免疫功能的细胞，包括淋巴细胞、单核细胞和浆细胞，能够在机体的免疫应答中发挥重要作用。
为了保证试验结果的准确性和可靠性，对PBMCs的采集、分离和保存必须按照相应的标准进行操作。
一、采集1. 选择合适的采集方法：一般常用的采集方法包括静脉抽血和手指取血等，静脉抽血常用于采集较多血液量的情况，手指取血则适用于采集少量血液的情况。
2. 确保采集操作标准化：在采集PBMCs的过程中，应该遵守严格的消毒和无菌操作规程，以防止细菌和病毒的污染。
3. 采集完整的血液样本：为了确保PBMCs的纯度和稳定性，应该尽量避免气泡和血细胞破损导致的RNA降解等情况。
二、分离1. 使用适当的分离方法：一般常用的PBMCs分离方法包括密度梯度离心和磁珠分选等，密度梯度离心适用于分离较大量的PBMCs，磁珠分选则适用于分离特定类型的细胞。
2. 选择合适的分离液：密度梯度离心中一般使用的分离液包括Ficoll和Percoll等，磁珠分选中则需要选择特定的磁珠标记物。
3. 保证分离效率和纯度：在PBMCs的分离过程中，应该确保细胞的分离效率和纯度，避免细胞的损失和杂质的混入。
三、保存1. 选择合适的保存条件：PBMCs的保存条件包括温度、储存液和容器等要素，应该选择适合PBMCs存活的条件进行保存。
2. 快速冻存PBMCs：为了避免细胞的降解和失活，应该在采集和分离PBMCs后尽快将其冻存。
3. 定期监测保存效果：在存储PBMCs的过程中，应该定期监测PBMCs的存活率和纯度，以确保PBMCs的质量和稳定性。
对于人外周血单个核细胞的采集、分离和保存，在操作的过程中应该严格按照相应的标准进行，以确保PBMCs的质量和稳定性，为后续的研究和临床应用提供可靠的基础。
外周血单个核细胞的分离
外周血单个核细胞的分离
概述
外周血单个核细胞是一种白细胞。
通过分离单个核细胞，可以进行多种分子生物学实验和临床应用。
本文将介绍两种分离外周血单个核细胞的方法。
方法
密度梯度离心
1.将外周血收集到 EDTA 管中。
2.将 3 毫升 Ficoll-Paque™ PLUS 加入到 15 毫升离心管中。
3.轻轻加入同等体积的外周血到离心管，保持液面平整。
4.以 400g 的速度离心 40 分钟。
在离心温度达到室温前离心室门不得
打开。
5.用温和的力度将上清液吸出到新的离心管中，并在 1200g 的速度下
洗涤 2-3 次。
6.已经分离的单个核细胞可以在非抗凝血样上重悬。
此过程中加入生长
培养基以维持细胞质稳定。
磁性负选择法
1.将外周血收集到 EDTA 管中。
2.加入红细胞淋巴细胞分离液，根据厂家指南染色。
3.加入磁性微珠混合液，使单个核细胞与微珠组合。
4.放入磁场中过滤掉未与微珠组合的细胞及其他血细胞。
5.经过多次洗涤和离心，单个核细胞可以在非抗凝血样上重悬。
此过程
中加入生长培养基以维持细胞质稳定。
密度梯度离心法和磁性负选择法是分离外周血单个核细胞的两种有效方法。
这些方法对于多种分子生物学实验和临床应用都非常有用。
ficoll分离法分离pbmc
ficoll分离法分离pbmcFicoll分离法分离PBMC的介绍PBMC（Peripheral Blood Mononuclear Cell），又称外周血单个核细胞，是人体免疫系统中重要的组成部分。
PBMC中包含淋巴细胞、单核细胞和自然杀伤细胞等，是研究免疫学、血液学和生物学的重要细胞。
对PBMC的分离和纯化对于后续的实验研究有着至关重要的作用。
其中，Ficoll分离法是常用的PBMC分离方法之一，其通过悬浮PBMC在密度梯度上，利用真核细胞和其它细胞在稀释Ficoll溶液中的胶体压差选择性沉降，从而获得纯净的PBMC。
下面，本文将详细介绍Ficoll分离法分离PBMC的步骤和特点。
一、操作步骤1、制备样本：以抗凝剂抗凝的外周血为样品。
2、制备Ficoll-Paque溶液：5ml Ficoll-Paque液加5ml PBS进行混合。
3、样本的悬浮液：将5ml抗凝的外周血加入到50ml 耐酸碱离心管内。
缓慢倒入Ficoll-Paque溶液，避免两种溶液混合。
装好离心管盖，以3000r/min离心30min（制备不同量的悬浮液时离心的时间不同），过程中不能震动，最好在无扰动的条件下离心。
4、取上清液：离心结束后，可以清晰地看到上清液、白膜和红血块。
样品中的细胞被Ficoll在稀释液中的胶体压力亲和力离心到离心管的木纹间。
无线假底离心管是离心过程中压力拍打细胞下沉粘连的机会最小的离心材料。
在冰上开盖依次取出，将悬浮液上清液倒在装有PBS的无菌离心管中。
5、PBS的加入：加入PBS，摇匀，离心1800r/min，10min。
取出，弃上清液。
6、PBS的加入和离心：重复上一步2次。
最后一次离心弃掉PBS，留下沉淀细胞。
二、特点1、相对纯净度高：Ficoll-Paque是一种密度梯度介质，利用细胞的沉降速度和浮力进行分离。
使不同密度的细胞分层，从而实现分离。
使用该分离方法分离PBMC，可获得高度纯净的细胞，最大限度减少不同细胞系之间的干扰。
人外周血内皮祖细胞的分离、培养、扩增和鉴定
人外周血内皮祖细胞的分离、培养、扩增和鉴定目的：研究人外周血内皮祖细胞的分离、培养、扩增和鉴定方法。
方法：采用密度梯度离心法分离人外周血单个核细胞，用EGM-2培养基在多聚赖氨酸包被的培养板中进行诱导培养，动态地观察贴壁细胞的生长状况，免疫组织化学技术检测培养细胞表面标志物的表达。
结果：人外周血单个核细胞经体外培养至第2天，呈贴壁生长，细胞形态为大小相近的圆球体；第4天一些细胞开始出现尾状物，形态呈蝌蚪样改变，部分细胞聚集形成细胞簇；至第7天细胞形态变长，呈梭形改变，细胞间相互围绕呈环形，并有集落出现，免疫组织化学染色CD133、CD34、VEGFR-2和Ⅷ因子表达均呈阳性。
结论：运用本实验方法可以成功实现人外周血内皮祖细胞的分离、培养和扩增。
标签：内皮祖细胞；外周血；细胞培养内皮祖细胞（Endothelial Progenitor Cells，EPCs）是血管内皮细胞的前体细胞，亦称血管母细胞（angioblast），EPCs不仅参与胚胎血管生成，而且也参与出生后的血管新生过程。
近些年来人们对EPCs在血管形成、心脑血管疾病和创伤愈合等方面的作用进行了广泛的研究[1]，EPCs移植技术已成为治疗心脑血管疾病的一种新兴的方法[2]，具有广阔的临床应用前景。
但由于EPCs的来源有限，目前的培养方法尚不能满足基础研究和临床治疗的需要，在本实验中，笔者研究从来源相对广泛的人外周血中分离培养EPCs，为EPCs的应用提供一种便捷有效的分离方法。
1 材料和方法1.1 材料：主要试剂和仪器：内皮细胞培养基（Endothelial Cell Growth Medium-2，EGM-2）（Lonza公司）。
人淋巴细胞分离液（天津灝洋生物制品有限公司）。
鼠抗人CD133单克隆抗体、血管内皮生长因子受体2（Vascular Endothelial Growth Factor Receptor 2，VEGFR-2）（北京博奥森生物技术有限公司）。
免疫实验 人外周血单核细胞分离
淋巴细胞增殖试验
淋 巴细胞增 殖试验 原 增 胞 能 tran的 。加 ，sf作淋o， 称 此r巴m用 同 淋 实a下 验 细t时 巴io，胞细 细 可n细在胞 胞 测te胞有s定t形 转)内丝. 态 化 淋核分转 试 巴酸裂化 验 细和原为 胞蛋或(l原 的y白特mp质异 始 应h合性 母 答o c成抗 细 功yte
二 、 B细胞 增殖 试验
B 细胞 增殖试 验 原 液 养 Td结 ， 中R束 不 对 加 掺溶 入 入前 T细性 不 法胞2溶 检2S小无P性 测A时刺是S加 B激P人 细A入作胞B，细用的3H混胞。增-匀 T的在殖d培高 R淋程，养效巴度采促3天细。用分，胞裂培 3H悬-
酶联免疫斑点法 （En zym e-Link edImm un o spo t,
流式细胞仪工作原理
免疫磁珠分离术
1. 直接法：
抗细胞表面分子抗体+磁性微球
免疫磁珠+细胞悬液 强磁场
与免疫磁珠结合的细胞
2. 间接法：
第二抗体+磁性微粒 第一抗体+细胞
磁场 特定细胞
淋巴细胞分离及检测技术
淋巴细胞的分离
淋巴细胞的功能测定技术
淋巴细胞的功能测定技术
一、体外法 1. 淋巴细胞增殖试验 2. 酶联免疫斑点法 3. 细胞毒试验
4. 计数：将EP管中的细胞液上下颠倒混匀，取出20ml加入新 的EP管中，再加入20ml细胞计数液，混匀后取出10ml，加到 计数板内，显微镜下计数。
示意图
细胞计数方法
4
查出四个大方格的总细胞数(X) 算出每个大方格的平均细胞数：Y=X/4 每个大方格的体积为V=1mm×1mm×0.1mm=0.1mm3=10-4ml 制备的细胞悬液的细胞浓度（/ml)=Y×104×稀释倍数
PBMC的分离培养及处理步骤
刘凤君实验步骤1.采血：抽取初治(初始抗病毒治疗）之前CHB、CHC患者外周静脉血6ml，注入肝素抗凝管中，轻轻摇匀。
2.稀释：室温下加入等体积的PBS，轻轻吹打混匀。
3.加样：取50ml离心管，吸取6ml Ficoll（淋巴细胞分离液）于离心管中，（Ficoll与稀释前血液的体积比为1:1），管倾斜45°，将稀释后的血液在Ficoll液面上方约1cm处沿管壁缓慢加至Ficoll上面。
4.离心：18-20℃,2000rpm，30min，离心后从管底至液面分四层，依次为红细胞和粒细胞层、分层液层、单个核细胞层、血浆层。
5.回收：将移液管直接插入云雾层（或者先吸去上层的血浆），轻轻吸出云雾层，放入新的离心管中。
6.洗涤：加入至少于PBMC（外周血单个核细胞）体积3倍的PBS，18-20℃,2000rpm，10min，两次。
7.细胞计数：弃上清，加1ml RPMI-1640培养基(含10%胎牛血清），吹打混匀，制备成PBMC细胞悬液。
①专用仪器测定：吸取一定量的PBMC细胞悬液于EP管中，取等量2%台盼蓝，吹打混匀后吸取1滴进行细胞浓度测定。
②血细胞计数板：取一滴PBMC悬液与一滴2%台盼蓝染液混匀后加于血细胞计数板中，在显微镜下计数4大格内细胞总数。
细胞数/ml=4个大方格细胞总数/4×104×2（稀释倍数）8.细胞培养：细胞计数后调整细胞浓度为2×105/ml培养基，加于6孔板或24孔板中进行培养。
（我们通常是培养过夜后再进行下一步处理）。
9.干扰素处理：加入500IU/ml（培养基的终浓度）的α-IFN（干扰素），同时设对照组，时间为8小时。
（家族性乙肝、丙肝患者中不准备抗病毒治疗者省去干扰素处理的步骤。
10.细胞收集：将6孔板或24孔板中的培养基吸出弃掉，每孔加200ulTrizol，用移液枪将孔壁吹打数次后，将Trizol转入EP管中。
11.细胞冻存：将收集的细胞放入-80℃冰箱中保存。
外周血单个核细胞的分离
实验二十四外周血单个核细胞的分离(Separation of mononuclear cell in peripheral blood)免疫细胞是一组不均一的细胞群体，它包括T、B淋巴细胞、NK细胞、单核细胞/巨噬细胞以及粒细胞等，这些细胞的生物学特性，如细胞的大小、密度、表面电荷、黏附能力以及细胞表面的分子标志等均存在差异，借助这些差异可区分不同的细胞类别。
外周血单个核细胞(PBMC)的分离主要有两种方法，即聚蔗糖-泛影葡胺(Ficoll-Hypaque)分离法和聚乙烯吡咯烷酮硅胶(Percoll)分离法。
此处只介绍聚蔗糖-泛影葡胺分离法。
【实验原理】血液中单个核细胞的分离常采用密度梯度离心法。
市售淋巴细胞分离液是由聚蔗糖(Ficoll)和泛影葡胺(Hypaque) 按一定比例混合制成，20℃密度为1.077±0.001，单个核细胞包括淋巴细胞和单核细胞，其密度为1.050～1.077，而粒细胞和红细胞的密度为1.080～1.110。
将待分离的细胞悬液小心铺于淋巴细胞分离液上，经离心后单个核细胞悬浮于分离液上层界面，而红细胞与粒细胞沉于管底。
【主要试剂和器材】1.聚蔗糖-泛影葡胺分层液密度为1.077±0.001。
2.5g/L台盼蓝。
3.250U/ml肝素溶液用Hank,s液配制。
4.Hank,s液。
5.注射器、刻度离心管、吸管、滴管、血细胞计数板、载玻片、盖玻片。
6.水平离心机、显微镜。
【操作方法】1.抽取静脉血2ml，注入含有0.2ml肝素溶液的无菌试管中摇匀，作白细胞计数和分类计数。
再加入等量Hank,s液混匀。
2.取2ml分层液置于离心管中，将稀释血液沿管壁缓缓叠加于分层液上，形成清晰界面。
稀释血液与分层液的容积比例以2∶1～3∶1为宜。
3.置水平离心机中，2000r/min离心20min。
4.离心后从离心管的底部到液面分为四层，依次为红细胞和粒细胞层、分层液层、单个核细胞层、血浆层(含血小板和破碎细胞)。
pbmc分离步骤
pbmc分离步骤
PBMC（Peripheral Blood Mononuclear Cells）是外周血单个核细胞的缩写，通常包括淋巴细胞、单核细胞和自然杀伤细胞。
以下是从外周血中分离PBMC的一般步骤，主要采用密度梯度离心法：
1.材料准备：
•外周血样本
•无菌PBS（磷酸盐缓冲液）
•密度梯度分离液（如Ficoll-Paque）
2.密度梯度分离：
•将外周血与相同体积的PBS混合均匀。
•将混合物缓慢地倒在密度梯度分离液上，确保形成一个清晰的界面。
•用无菌技术，将样本与PBS和分离液的混合物轻轻地分层到离心管中。
3.离心：
•使用无菌技术将离心管放入离心机，进行离心。
•设置适当的离心参数，通常是低速度离心，以避免细胞破裂。
•离心结束后，PBMC会沉积在分离液的界面上。
4.PBMC收集：
•使用无菌技术，将PBMC小心地从离心管的界面上吸取出来，放入新的离心管中。
5.洗涤：
•使用PBS或细胞培养基等缓冲液洗涤PBMC，以去除密度梯度分离液的残留。
6.计数和保存：
•使用血细胞计数板或血细胞计数仪等设备，计数PBMC的细胞数。
•根据需要，将PBMC冻存或直接用于后续实验。
注意事项：
•所有步骤应在无菌条件下进行，以避免细菌和其他污染物的引入。
•使用离心管和仪器前后要进行严格的消毒。
•密度梯度分离液的选择要根据实验需要，通常使用Ficoll-Paque 等离子浓度梯度离心介质。
这些步骤是标准的PBMC分离方法，但可能需要根据具体实验的需求进行微调。
PBMC的分离培养及处理步骤
刘凤君实验步骤1.采血：抽取初治(初始抗病毒治疗）之前CHB、CHC患者外周静脉血6ml，注入肝素抗凝管中，轻轻摇匀。
2.稀释：室温下加入等体积的PBS，轻轻吹打混匀。
3.加样：取50ml离心管，吸取6ml Ficoll（淋巴细胞分离液）于离心管中，（Ficoll与稀释前血液的体积比为1:1），管倾斜45°，将稀释后的血液在Ficoll液面上方约1cm处沿管壁缓慢加至Ficoll上面。
4.离心：18-20℃,2000rpm，30min，离心后从管底至液面分四层，依次为红细胞和粒细胞层、分层液层、单个核细胞层、血浆层。
5.回收：将移液管直接插入云雾层（或者先吸去上层的血浆），轻轻吸出云雾层，放入新的离心管中。
6.洗涤：加入至少于PBMC（外周血单个核细胞）体积3倍的PBS，18-20℃,2000rpm，10min，两次。
7.细胞计数：弃上清，加1ml RPMI-1640培养基(含10%胎牛血清），吹打混匀，制备成PBMC细胞悬液。
①专用仪器测定：吸取一定量的PBMC细胞悬液于EP管中，取等量2%台盼蓝，吹打混匀后吸取1滴进行细胞浓度测定。
②血细胞计数板：取一滴PBMC悬液与一滴2%台盼蓝染液混匀后加于血细胞计数板中，在显微镜下计数4大格内细胞总数。
细胞数/ml=4个大方格细胞总数/4×104×2（稀释倍数）8.细胞培养：细胞计数后调整细胞浓度为2×105/ml培养基，加于6孔板或24孔板中进行培养。
（我们通常是培养过夜后再进行下一步处理）。
9.干扰素处理：加入500IU/ml（培养基的终浓度）的α-IFN（干扰素），同时设对照组，时间为8小时。
（家族性乙肝、丙肝患者中不准备抗病毒治疗者省去干扰素处理的步骤。
10.细胞收集：将6孔板或24孔板中的培养基吸出弃掉，每孔加200ulTrizol，用移液枪将孔壁吹打数次后，将Trizol转入EP管中。
11.细胞冻存：将收集的细胞放入-80℃冰箱中保存。
人外周血单个核细胞的采集、分离和保存
ICS 07.080C40 CMBA 团体标准T/CMBA 011—2020人外周血单个核细胞的采集、分离和保存 Collection, separation and preservation of PBMC from human peripheral blood2020-12-28发布2020-12-28 实施86 中国医药生物技术2021年2月第16卷第1期Chin Med Biotechnol, February 2021, V ol. 16, No. 1中国医药生物技术协会团体标准·DOI: 10.3969/j.issn.1673-713X.2021.01.016·T/CMBA 011—2020目 次前言 (87)1 范围 (88)2 规范性引用文件 (88)3 术语和定义 (88)4 总则 (89)5 实验原理 (89)6 实验方法 (89)7 质量控制 (92)参考文献 (93)中国医药生物技术2021年2月第16卷第1期Chin Med Biotechnol, February 2021, V ol. 16, No. 1 87T/CMBA 011—2020前 言本文件按GB/T 1.1-2020 给出的规则起草。
本文件由中国医药生物技术协会归口。
本文件起草单位：中国医药生物技术协会组织生物样本库分会、生物芯片上海国家工程研究中心、上海芯超生物科技有限公司、广州中医药大学第二附属医院（广东省中医院）。
本文件主要起草人：郜恒骏、沈晓莹、杜莉利、亓垚、张小燕、许靖曼、陈明敏、陈曲波、叶扬、李迪。
88 中国医药生物技术2021年2月第16卷第1期Chin Med Biotechnol, February 2021, V ol. 16, No. 1 T/CMBA 011—2020人外周血单个核细胞的采集、分离和保存1 范围本文件规定了采集、分离和保存人外周血单个核细胞的实验原理、实验方法和质量控制。
外周血单个核细胞分离方法
测定细胞免疫功能首先要从人或动物外周血或组织中获取有活性的细胞,如淋巴细胞、巨噬细胞、粒细胞等;取得有活性的细胞应根据不同目的,采用不同方法,考虑1细胞纯度；2细胞获得量；3细胞活力；4使用方法的简易程度和本室条件等;目前常用Ficoll密度梯度离心法直接分离和纯化外周血单个核细胞;一原理:常用来分离人外周血单个核细胞PBMC的分层液比重是±的聚蔗糖Ficoll-泛影葡胺UrografinF／H分层液;Ficoll是蔗糖的多聚体,呈中性,犌W水性高,平均分子量为400,000,当密度为1.2g／ml仍未超出正常生理性渗透压,也不穿过生物膜;红细胞、粒细胞比重大,离心后沉于管底；淋巴细胞和单核细胞的比重小于或等于分层液比重,离心后漂浮于分层液的液面上,也可有少部分细胞悬浮在分层液中;吸取分层液液面的细胞,就可从外周血中分离到单个核细胞;二方法:1.在短中管中加入适量淋巴细胞分离液;2.25000rpm离心5-10分钟,吸取上清,取肝素抗凝静脉血与等量Hank"s液或RPMI1640充分混匀,用滴管沿管壁缓慢叠加于分层液面上,注意保持清楚的界面;水平离心2000rpm×20分钟;3.离心后管内分为三层,上层为血浆和Hank"s液,下层主要为红细胞和粒细胞;中层为淋巴细胞分离液,在上、中层界面处有一以单个核细胞为主的白色云雾层狭窄带如下图,单个核细胞包括淋巴细胞和单核细胞;此外,还含有血小板;4.用毛细血管插到云雾层,吸取单个核细胞;置入另一短中管中,加入５倍以上体积的Hank"s液或RPMI1640,2000rpm×20分钟,洗涤细胞两次;5.末次离心后,弃上清,加入含有10％小牛血清的RPMI1640,重悬细胞;取一滴细胞悬液与一滴％台盼兰染液混合,于血球计数板上,计数四个大方格内的细胞总数;单个核细胞浓度细胞数／1毫升细胞悬液＝4个大方格内细胞总数──────────×10４×2稀释倍数46.细胞活力检测：死的细胞可被染成兰色,活细胞不着色;计数200个淋巴细胞;计算出活细胞百分率;活细胞数活细胞百分率＝──────×100％总细胞数用本法分离PBMC,纯度在90％以上,收获率可达80～90％,活细胞百分率在95％以上; %DMSO胎牛血清冻存;。
外周血单个核细胞分离方法
外周血单个核细胞分离方法外周血单个核细胞（Peripheral blood mononuclear cells，PBMCs）是一类重要的免疫细胞，包括淋巴细胞、单核细胞和自然杀伤细胞等。
它们在免疫反应、炎症、感染和肿瘤等过程中起着重要作用。
因此，从外周血中分离出单个核细胞对于许多研究项目非常重要。
本文将介绍几种常用的外周血PBMCs分离方法，并详细描述它们的步骤和应用。
方法一：梯度离心梯度离心是最常用的PBMCs分离方法之一、它利用了外周血中不同细胞的密度差异，通过离心使PBMCs在浓度梯度上进行分离。
以下是具体步骤：1.收集外周血样本，将其加入离心管中。
2. 向离心管中缓慢加入等体积的稀释液，常用的等体积稀释液有Ficoll-Paque、Lymphoprep等。
3. 将稀释液中的血液离心，离心速度和时间根据样品的要求而定。
一般来说，1200rpm离心10分钟即可。
4.离心过程中，PBMCs会沉积在离心管的界面上，分离出上清液。
5.使用移液器或玻璃毛细管，将上清液移至新的离心管中。
6.向新的离心管中加入如PBS等缓冲液，使细胞沉淀。
7.用离心将细胞沉淀下来，并去除上清液。
8.向细胞沉淀中加入培养基，使其重悬。
这种方法的优点是简单、快速，可以同时分离出不同类型的免疫细胞。
缺点是离心的条件需要根据具体实验要求进行调整，有些细胞如自然杀伤细胞可能会受到损伤。
方法二：抗凝血液管离心另一种常用的PBMCs分离方法是使用抗凝血液管。
以下是具体步骤：1.收集外周血样本，将其加入含有抗凝剂的抗凝血液管中，常用的抗凝剂有EDTA、肝素等。
2.轻轻颠倒血液管使血液与抗凝剂充分混合。
3.将血液离心，离心速度和时间根据样品的要求而定。
4.离心过程中，PBMCs会沉积在离心管的底部，分离出上清液。
5.使用移液器或玻璃毛细管，将上清液移至新的离心管中。
6.向新的离心管中加入如PBS等缓冲液，使细胞沉淀。
7.用离心将细胞沉淀下来，并去除上清液。
外周血单个核细胞的分离注意事项
外周血单个核细胞的分离注意事项外周血单个核细胞（Peripheral Blood Mononuclear Cells, PBMCs）是常见的实验材料，在许多免疫学、细胞生物学等实验中扮演着重要的角色。
然而，PBMCs分离过程中存在许多注意事项。
本文将从实验前准备、样本处理及分离步骤中列举几点需要注意的事项。
1. 实验前准备安全标准PBMCs的分离涉及血液样本采集和处理，需要保证操作人员的安全，防止血液污染。
为此，实验前需要使用防护手套、口罩、护目镜等器材，并制定相关血液样本处理的实验室安全操作规范。
试剂采购PBMCs分离需要许多慢速离心管、离心机、PBS等试剂，需要提前预置备足够的试剂和设备。
2. 样本处理血液处理PBMCs分离需要血液样本。
在血样提取过程中需要注意消毒操作，以及遵循血样相关的法律法规，根据实验需要动物实验和人类样本需要进行严格的伦理、道德审查手续。
推迟凝固血液采样后需要将血液样本尽快抽入慢速离心管中，加入分离液等样品处理操作。
尽可能的避免血液凝固、变质，以保证分离的单核细胞数量和质量。
3. 分离步骤慢速离心PBMCs分离需要慢速离心。
慢速离心的转速和时间是影响分离效果的重要因素。
理论上，慢速离心时间越长，分离效果越好，但是过长的离心时间会影响细胞的活性。
合适的离心强度和离心时间是需要事先确定的。
分离液制备PBMCs分离的关键是分离液制备。
分离液的配方、pH值、浓度等是影响单核细胞分离效果的关键因素。
不同样本需要不同的分离液组合。
为了保证分离效果，同时避免细胞受损，可以在实验前进行样品处理的优化。
总结本文总结了外周血单个核细胞分离的注意事项，包括试剂的准备、血样的处理、慢速离心的参数控制、分离液的配方等。
在实验前，科研人员应制定严格的安全检查标准，并确保实验操作人员的安全、细胞处理质量与数量的稳定。
PBMC的分离培养及处理步骤
刘凤君实验步骤1. 采血：抽取初治（初始抗病毒治疗）之前CHB CHC患者外周静脉血6ml ，注入肝素抗凝管中，轻轻摇匀。
2. 稀释：室温下加入等体积的 PBS,轻轻吹打混匀。
3. 加样：取50ml离心管，吸取6ml Ficoll （淋巴细胞分离液）于离心管中，（ Ficoll 与稀释前血液的体积比为 1:1 ），管倾斜 45°，将稀释后的血液在Ficoll 液面上方约1cm 处沿管壁缓慢加至Ficoll 上面。
4•离心：18-20 C ,2000rpm , 30min，离心后从管底至液面分四层，依次为红细胞和粒细胞层、分层液层、单个核细胞层、血浆层。
5. 回收：将移液管直接插入云雾层（或者先吸去上层的血浆），轻轻吸出云雾层，放入新的离心管中。
6. 洗涤：加入至少于PBMC （外周血单个核细胞）体积3倍的PBS, 18-20C ,2000rpm , 10min，两次。
7. 细胞计数：弃上清，加 1ml RPMI-1640 培养基（含 10%胎牛血清），吹打混匀，制备成 PBMC细胞悬液。
①专用仪器测定：吸取一定量的PBMC细胞悬液于EP管中，取等量2% 台盼蓝，吹打混匀后吸取 1 滴进行细胞浓度测定。
②血细胞计数板：取一滴 PBMC悬液与一滴2%台盼蓝染液混匀后加于血细胞计数板中，在显微镜下计数 4大格内细胞总数。
细胞数 /ml=4个大方格细胞总数/4 X 104 X 2 （稀释倍数）8. 细胞培养：细胞计数后调整细胞浓度为 2X 105/ml培养基，加于6 孔板或24 孔板中进行培养。
（我们通常是培养过夜后再进行下一步处理）。
9. 干扰素处理：加入500IU/ml （培养基的终浓度）的a -IFN （干扰素），同时设对照组，时间为 8 小时。
（家族性乙肝、丙肝患者中不准备抗病毒治疗者省去干扰素处理的步骤。
10. 细胞收集：将 6 孔板或 24 孔板中的培养基吸出弃掉，每孔加200ulTrizol，用移液枪将孔壁吹打数次后，将 Trizol转入EP管中。
实验6_人外周血单个核细胞的分离及活力测定1
Ficoll/Hypaque (2:1)
1500rpm, 20 min
水平离心
血小板
⒈ 简述补体的概念、分泌细胞及激活途径。 ⒉ 简述补体的经典激活途径的具体过程。 ⒊ 补体结合反应为什么需分两阶段进行？如果将 几种成分反应顺序颠倒，结果会如何？ ⒋ 参加补体结合反应的各已知成分，为什么须预 先滴定？试验中所设计的四种对照管有何意义？
细胞存活率(%)＝无色细胞数/细胞总数×100%
计数200个细胞，一般活性应在95％以上
注意事项
1. 与血液样品接触时应注意安全防护，避免血源性 传染病传染。 2. 操作应轻柔，细胞悬液应充分混匀，避免损伤细 胞活性及细胞丢失。 3.细胞分层液在室温下比重为l.077±0.001g/L；应 避光 4 ℃下保存，取出后逐渐升至室温后混匀， 方可使用。使用中应避免细菌污染。 4. 稀释血液可降低红细胞的凝集，提高淋巴细胞收 获量，但如果要保留血浆成分作其他实验用时， 则不能稀释血液，以免影响血浆成分。
用毛细吸管轻轻插入灰白色层，沿管壁轻
轻吸出该层的单个核细胞，盛入另一支离
心管中。
将所得到的PBMC悬液用5倍体积的Hanks液
洗涤2次，1500 rpm 5min。
台盼蓝染色测定细胞存活率
台盼蓝（trypan blue）染色法是测定细胞活力的 最简便的方法。 台盼蓝又称锥蓝，是一种阴离子型染料，它不能 透过活细胞正常完整的细胞膜，故活细胞不着 色，但死亡细胞的细胞膜通透性增加，可使染 料通过细胞膜进入细胞内，使死细胞着色呈蓝 色。
人血液中各种细胞的密度如下： 红细胞：1.093 白细胞：1.092 淋巴细胞和单核细胞：1.075-1.090 血小板：1.030-1.035
F/HБайду номын сангаас 1.077±0.001
人外周血单个核细胞分离液 说明书
分离后分离前 水平离心血浆层 单个核细胞层 分离液层红细胞层人外周血单个核细胞分离液说明书：P9010/P9011200mL本产品是一种用于分离人外周血单个核细胞的无菌、低内毒素水平的密度梯度分离液。
外周血中单个核细胞（PBMC ）包括淋巴细胞和单核细胞，其体积、形态和密度与其他细胞不同，红细胞和粒细胞密度较大，为1.090 g/mL 左右，淋巴细胞和单核细胞密度为1.075~1.090 g/mL ，血小板为1.030~1.035 g/mL 。
为此利用一种密度介于1.075～1.092之间而近于等渗的溶液做密度梯度离心，使一定密度的细胞按相应密度梯度分布，从而将各种血细胞加以分离。
密度 1.077±0.001g/mL渗透压 290~350 mOsm/kg H2O无菌 0.1μm 滤膜过滤本产品对光敏感，应该室温避光储存，保质期2年。
无菌开封后，保存于室温。
1. 取新鲜抗凝全血（EDTA 、枸橼酸钠或肝素抗凝均可）或者去纤维蛋白血液，用等体积的全血及组织稀释液或者PBS 稀释全血。
2. 在离心管中加入适量分离液（当稀释后血液体积小于3mL 时，加入3mL 分离液；大于等于3mL ，加入等体积分离液。
但二者的总体积不能超过离心管的三分之二，否则会影响分离效果），将稀释后的血液平铺到分离液液面上方，注意保持两液面界面清晰。
（可以使用巴氏德吸管吸取血液，然后将血液小心的平铺于分离液上，因为两者的密度差异，将形成明显的分层界面。
如果样品较多加样时间较长，在离心之前出现红细胞成团下沉属正常现象。
）3. 室温，水平转子500~1000g ，离心20~30min （血液的体积越大所需的离心力越大，离心时间越长，最佳的分离条件需摸索，离心转速最大不超过1200g ）。
4. 离心后将出现明显的分层：最上层是稀释的血浆层，中间是透明的分离液层，血浆与分离液之间的白膜层即为单个核细胞层，离心管底部是红细胞与粒细胞。
pbmc分离关键
pbmc分离关键PBMC（Peripheral Blood Mononuclear Cells，外周血单个核细胞）是一种重要的免疫细胞类型，对于研究免疫学、细胞治疗和药物筛选等领域具有重要意义。
正确高效地分离PBMC是进行这些研究的基础步骤之一。
本文将介绍PBMC的分离关键技术和步骤，以期为相关研究提供参考。
一、材料准备在进行PBMC分离前，需要准备以下材料：1. 外周血样品：获取血样需要经过伦理审批，并且操作人员需要具备相应的培训和防护措施。
2. 无菌离心管：用于收集血样和分离PBMC。
3. 无菌PBS缓冲液：用于稀释血样和洗涤PBMC。
4. Ficoll-Paque密度梯度离心液：用于分离PBMC和其他血细胞。
5. 离心机：用于离心操作，选择适当的离心机型号和转速。
二、PBMC分离步骤步骤一：稀释和混匀将外周血样品放入无菌离心管中，并用无菌PBS缓冲液稀释样本。
稀释比例通常为1:1或1:2，可根据实验需求进行调整。
然后，轻轻反复混匀，确保血液和缓冲液充分混合。
步骤二：制备密度梯度离心液将适量的Ficoll-Paque密度梯度离心液放入另一个无菌离心管中。
具体用量需要根据血液样本的体积进行计算，通常为血液样本体积的一半或三分之二。
制备好后，将离心管轻轻摇晃来均匀混合。
步骤三：层析离心将混匀后的外周血样品缓慢倾倒至含有Ficoll-Paque离心液的无菌离心管中，确保两者不混合。
注意避免气泡的产生。
倾倒完成后，离心管中会出现明显的三个层次：上层为血浆，中间层为白细胞和单核细胞，下层为红细胞。
步骤四：离心将离心管放入离心机中，调整适当的离心参数。
常规情况下，离心速度为400×g，离心时间为20分钟。
离心过程结束后，离心管中的PBMC将沉淀在管底。
步骤五：收集PBMC将上层血浆和下层红细胞倒出，只留下中间层的PBMC。
尽量避免将红细胞和离心液残留物带到PBMC中。
三、注意事项1. 操作要严格遵循无菌操作规范，保证样品的纯度和可靠性。
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⑤PBMC所在细胞层为白色。此时可以用吸管将该层细胞吸取在另一干净的15ml离心管中。
⑥加入PBS至10-15ml，1,500rpm，10min离心后去掉上清，再加入培养基进行相同操作的清洗；
⑦加入5-10ml培养基重悬细胞，进行后续计数培养或者铺板；
⑧细胞冻存：将细胞离心收集之后，用细胞冻存液重悬。取1-1.5ml细胞至冻存管中，放入冻存盒（冻存盒可事先在4℃冰箱预冷）。再将冻存盒放置于-80℃冰箱过夜。第二天将细胞转入液氮中长期保存。
双抗P/S （Penicillin/ Streptomycin) (GIBCO)
二甲亚砜（DMSO）（SIGMA）
预先装好异丙醇的冻存盒
方法/步骤：
①配制所需的溶液：
a. 细胞培养基：RPMI 1640+10% FBS+1% P/S；
b. 细胞冻存液：FBS中加入10%DMSO；
②将10ml全血转入50ml离心管中，加入10ml PBS溶液稀释，轻轻混匀；
PBMC（peripheral blood mononuclear cell），外周血单个核细胞，顾名思义，其主要细胞类型为血液里边具有单个核的细胞，主要包括淋巴细胞（Ｔ＼Ｂ），单核细胞，吞噬细胞，树突状细胞和其他少量细胞类型。其中淋巴细胞占很大一部分。分离ＰＢＭＣ的主要目的是为了将多核细胞和红细胞去除，从而能够很方便地模拟体外的血液免疫环境。
注意事项
全血溶液可以加在Ficoll上层或者下层，但是最终都必须保证两种溶液分层清晰。
分离PBMC第一步离心的时候，一定不能设置或设置低水平的制动。否则将分层混乱。
Ficoll是蔗糖的多聚体，呈中性，平均分子量为400,000，当密度为1.2g/ml仍未超出正常生理性渗透压,也不穿过生物膜。红细胞、粒细胞比重大，离心后沉于管底；淋巴细胞和单核细胞的比重小于或等于分层液比重，离心后漂浮于分层液的液面上，也可有少部分细胞悬浮在分层液中。吸取分层液液面的细胞，就可从外周血中分离到单个核细胞。
工具/原料：
全血 （以10ml为例）
无菌PBS溶液(pH7.4) 或者生理盐水
蔗糖溶液（Ficoll Pague PLUS) (GE Healthቤተ መጻሕፍቲ ባይዱare Life Sciences #17-1440-02)
RPMI 1640培养基 （Invitrogen）
胎牛血清（FBS）（GIBCO）
③取两支15ml离心管，先加入5ml Ficoll溶液。然后将稀释的血液轻轻加到两支离心管的ficoll上层，一定要轻柔，避免两种溶液混合在一起，每只离心管各10ml稀释血液；
④2,000rpm，20min，注意，降速设置中一定要设置成no break，或者只有1-2成的制动。离心完毕将得到如图所示分层；