微小组织快速冰冻切片法
医院冰冻切片技术操作规程
冰冻切片技术操作规程
1.接通电源开关，打开箱内照明灯，设定或调整切片温度（-25℃左右）。
将切片刀装入持刀架上固定。
2.将待切样品以OCT包埋在持物托上置于切片机冷冻台冷冻，打开速冻开关。
待切片机箱内温度达到设定温度及样品冻硬后，将样品连同持物托一同置于持物架上，固定。
3.右手转动旋转轮，左手间断按动样品前进开关，使样品徐徐向前推进，直至组织平面完全修出平整。
4.调整好防卷板至刀刃平行，定好欲取切片的厚度标尺（6-10微米），放下防卷板，速度均匀的转动切片机旋转轮，切片。
5.打开防卷板，用玻片吸附切片，切片会自然附贴于玻片上。
以95%乙醇固定1-3分钟即可进行染色。
6.染色完毕后，将持物托上的剩余组织放入有编号的包埋盒内并固定。
将持物托用水洗涤干清、擦干备用。
7.将切片机中的碎组织彻底清理干净，用棉花蘸无水酒精轻轻擦拭防卷板及刀架。
8.关闭箱内照明灯，将切片机温度调至保持温度（-6℃）。
术中快速冰冻切片技术及应用
术中快速冰冻切片技术及应用
术中快速冰冻切片技术是一种在手术过程中对组织进行快速诊断的方法。
这种技术通常用于需要即时诊断的情况，例如判断肿瘤的性质（良性或恶性）或者确定手术切除的边缘是否清晰。
过程如下：
1. 取样: 在手术过程中，医生会选择一个代表性的组织样本。
2. 冷冻: 这个样本会被迅速冷冻，通常使用液氮或者特殊的冷冻剂。
3. 切片: 冷冻后的组织会被切成非常薄的切片，通常厚度在5-10微米之间。
4. 染色: 这些切片会被迅速染色，以便在显微镜下观察。
5. 诊断: 病理医生会在显微镜下观察这些切片，并给出初步诊断。
6. 反馈: 病理医生的诊断结果会迅速反馈给手术医生，以指导后续的手术步骤。
这个技术的优点是可以在短时间内得到诊断结果，有助于医生做出即时的决策。
但也有一些局限性，比如可能会有假阴性或假阳性的结果，或者在某些情况下，冰冻切片的质量不足以做出确切的诊断。
总的来说，术中快速冰冻切片技术是一个非常有用的工具，可以在手术过程中提供即时的诊断信息。
但是，它通常只被视为一个初步的诊断方法，最终的诊断还需要通过常规的病理检查来确认。
微小组织快速冰冻切片法
微小组织快速冰冻切片法自1891年Halsted和Accarty将冰冻切片技术列为正式诊断方法以来,国内外病理同仁在这方面做了大量工作,随着技术的不断完善,冰冻切片已成为病理科的常规工作,这为术中诊断提供了条件。
随着人们生活水平的不断提高和医学科学技术的不断发展,人们对健康越来越重视,临床医生和患者常常要求对直径小于0.3 cm的微小组织作出快速诊断,由于组织小,有时难以制片和诊断,影响了此项工作的全面开展。
为解决这一问题,在实际工作中,我们不断摸索、改进、完善,总结出了一种较实用的微小组织快速冰冻切片法,现介绍如下。
1材料与方法1.1材料①微小组织包括纤维胃镜活检标本,肾穿刺标本,脱落细胞沉淀后剩余物等,均为我院门诊及住院部送检。
②原西德产Leitz 1720型低温恒冷冰冻切片机。
③组织包埋托的改进:找一直径为0.8～1 cm,高约1 cm的圆柱形铜质材料,一端可上螺丝,在机器所配的组织包埋托中央打一小孔,将铜质的圆柱体用螺丝与组织包埋托固定,铜质圆柱体周围缠以3～4圈医用胶布,周围略高于铜质圆柱体。
④包埋剂:取适量甲基纤维素,然后加入适量蒸馏水调成糊状,煮沸,放凉,再加入适量麝香草酚,分装于空的超声耦合剂瓶内,贮存于4℃冰箱待用。
1.2方法①开机预冷:提前开机,将低温恒冷切片机冷台及切片刀冷至-22℃左右。
②滴加包埋剂:在改进后的组织包埋托上滴加包埋剂,待冷冻好后修平,将微小组织平放于修好的平面上,冷冻片刻,修切,若是长条组织,如肾穿刺标本,组织与组织包埋托旋钮呈60°角,若是多块组织则应放置于同一平面,且不互相重叠。
③切片:用手术刀片切去组织周围多余的包埋剂。
使之成为长方形或正方形,然后开始切片,切片厚度3～5 μm。
④固定:95%乙醇或乙醚酒精混合液(乙醚,95%乙醇等量混合)固定5～10 s。
⑤染色:苏木素1～2 min,0.5%盐酸酒精分化1 s,0.25%氨水返蓝,伊红染1 min,95%乙醇3 s,无水乙醇3 s,在烘片机上烤干,封片。
冰冻切片步骤2010.6
1.速冻组织：冰冻切片机的使用需要加强！！将组织块平放于软塑料盖或特制小盒内（直径2cm），如组织块小可适量加OCT包埋剂浸没组织，然后将特制小盒缓缓平放入盛有液氮的小杯内，当盒底部接触液氮时即开始气化沸腾?，此时小盒保持原位切勿浸入液氮内，大约10-20秒组织即迅速冰冻成块。
取出组织冰块立即置入-80℃冰箱储存备用，或置于恒冷切片机冰冻切片。
冰冻切片后如不染色，必须吹干，储存低温冰箱内，或进行短暂预固定后储存冰箱内保存。
2．组织固定与切片：样品托上涂一层OCT包埋胶，将速冻组织置于其上，4℃冰箱预冷5-10min让OCT胶浸透组织。
取下组织置于锡箔或者玻片上，样品托速冻。
组织置于样品托上，其上再添一层OCT胶，以完全覆盖为宜，速冻架（PE）上30min。
修片，切片。
重点步骤室温放置30分钟后，入4℃丙酮固定5~10min，烘箱干燥20min。
PBS洗，5分钟×3。
进行抗原热修复（7-1-5-1-5）微波热修复可以吗，室温自然冷却。
（选做：用3%过氧化氢孵育5~10分钟，消除内源性过氧化物酶的活性）。
3．组织切片免疫荧光染色：冰冻切片室温晾干15min,用组化油笔将待染组织圈好，圈不可太小，太小时若阻水胶粘到组织上，组织便不能染上色。
圈也不宜太大，太大则浪费抗体。
选做：用含10％正常山羊血清的PBS室温封闭切片1 小时（此步可以不洗涤，把封闭液吸干即可）滴加适当比例稀释的一抗或一抗工作液(抗体的量视组织大小而定，原则是可以均匀覆盖组织面，且保证整个过程中不会使组织干涸，我们的胰腺组织一般是加10-20μl)，将切片放在加了PBS的免疫组化湿盒，室温孵育2小时或4℃过夜。
第二天早上，先将湿盒放到37℃回温1h（37℃环境可用二氧化碳培养箱或者分子杂交箱提供），然后吸取片上的一抗进行回收，将切片插入到小染缸PBS冲洗，。
滴加用PBS稀释好的二抗（从此开始所有步骤都在暗房进行）置于分子杂交箱中37℃孵育1小时。
不可错过的【冰冻切片制备】步骤！
不可错过的【冰冻切片制备】步骤！Frozen section01什么是冰冻切片？冰冻切片（frozen section）是一种在低温条件下使组织快速冷却到一定硬度，然后进行切片的方法。
因其制作过程较石蜡切片快捷、简便，而多应用于手术中的快速病理诊断。
02制备步骤将组织在恒温冷冻切片机里切片。
冷冻腔内的温度一般设置为-18至-25℃，根据不同组织调节不同的腔温，平时应将冷冻头放置于冷冻台上。
冷冻切片机应长期处于恒温冷冻状态。
1）当冰冻组织取好后，在冷冻头上放少量的OCT或羧甲基纤维素(可用普通胶水代替)，放上组织，速冻；2）待组织冻结后，将冷冻头装到切片机上；3）粗切，修出切面细切几张，用毛笔刷去刀上组织片；4）放下抗卷板，开始切片，切片厚度一般为5～6微米，切出的片子用载玻片贴附后立即放入甲醇冰醋酸液（97ml甲醇+3ml冰醋酸）中固定，固定时间为10～20秒；03注意事项1）速冻：是冰冻切片的关键，因为只有速冻才能减少组织内的冰晶，最好的办法是将速冻头迅速压在组织上，冻好后就可切片。
特别适用于较脆的组织。
而含有脂肪较多的组织，最好放在液氮里处理。
在液氮里冷冻要注意不要冻过头，2～3秒钟就要拿出来看一下，只要有4/5的组织已经冻住就可以了，待冷冻头拿出后刚好全部冻住，否则就会引起组织发脆，或冷冻头与组织分离。
2）固定：切片后应立即放入甲醇冰醋酸中固定，不能等切片干后再固定，后者容易造成细胞退变。
固定液有很多种，甲醇作用快，收缩小，染色较清晰，是冰冻切片最理想的固定液，而每97ml加入冰醋酸3ml，会减少某些胶质、钙质较多的组织不容易掉片。
3）包埋剂：可用普通胶水代替，但要加入适量的水（胶水与水的比例大约在2：1左右）。
太稀了，容易损伤切片刀；太稠了，粘在切片上不容易洗掉，影响切片的质量。
4）冰冻用切片刀不仅要磨的快，而且要磨的直，否则切出的片子就不会平整，不能进入抗卷板。
最好能使用一次性刀片。
5）如组织发脆，可等几分钟后再切，也可用手在组织上稍稍加温；如果用手去摸组织块，最好戴手套，或用玻片间的纸夹在手与组织之间，以防感染。
冰冻切片制作方法与注意事项
冰冻切片制作方法与注意事项冰冻切片是一种常见的制备生物组织切片的方法，其原理是将生物组织迅速冷冻并切割成极薄的切片，用于研究组织的形态结构和组织学变化。
下面是冰冻切片的制作方法和注意事项。
一、冰冻切片的制作方法：1.组织采集：选择需要研究的组织，如动物器官或植物部位，通常用组织固定剂进行固定处理，以保持组织的形态结构。
2.组织预处理：将固定的组织转移到含有蔗糖或蔗糖与聚乙二醇的冰冻液中，浸泡一定的时间使组织与冷冻液充分均匀接触，便于组织快速冷冻。
3.冰冻：使用液氮或刀片冷冻架等快速冷冻设备，将组织迅速冷冻至-20℃以下，使组织中的水分迅速形成冰晶，避免组织的形态结构变化。
4.切割：将冷冻的组织置于切片机或切片微波机上，用冷冻刀片将组织切割成薄片，通常厚度为10-30μm。
5.将切割好的切片用刷子或微型镊子移至载玻片上，通常用蛋白质固定剂或聚甲醛进行固定处理，以保持切片的形态结构。
6.干燥：将固定好的切片置于干燥器中，用适当的温度和时间干燥切片，使其充分固定在玻片上。
7.染色：根据需要可对切片进行染色处理，常见的染色方法有HE染色、银染色、免疫组化染色等。
二、冰冻切片的注意事项：1.快速冷冻：为了保持组织的形态结构和避免变形，必须采用快速冷冻的方法，将组织迅速冷冻至-20℃以下。
液氮和刀片冷冻架是常用的设备。
2.切片设备：选择适合的切片设备，如切片机或切片微波机。
刀片的选择也十分重要，常见的冰冻刀片有钢刀、玻璃刀和蜡刀，选择合适的刀片可以提高切片质量。
3.切片厚度：切割时要控制好切片的厚度，通常为10-30μm。
切片太薄容易导致组织切面不完整，切片太厚则不能得到清晰的显微镜图像。
4.切片技巧：切片技巧也很重要，需要稳定的手部技巧和耐心。
在切割时要保持刀片的稳定，避免划伤或碎裂组织。
5.切片保存：切好的切片需要妥善保存，可以用普通干燥器或冷冻干燥器进行干燥，避免切片变形和水分损失。
6.染色方法：根据需要选择合适的染色方法。
微小组织冰冻快速制片技术分析
微小组织冰冻快速制片技术分析【摘要】目的：试验分析微小组织冰冻快速制片技术。
方法：选取200例微小组织，针对其冰冻快速制片过程常常出现冰晶、染色不均、切片多粒组织不全等问题，建立普通对照组与3个相应实验组（n=50），分别采用普通处理对照组和预冷冻平铺包埋处理、吸水纸处理、速冷冻方法，进行冰冻快速制片，对比其制片问题发生几率。
结果：预冷冻平铺包埋处理切片多粒组织不全发生几率远低于普通处理；经过预冷冻平铺包埋处理、吸水纸处理出现冰晶问题大幅降低，后行速冷冻处理下，制片质量大幅提高。
结论：微小组织冰冻快速制片技术中，采取预冷冻平铺包埋处理、吸水纸处理、速冷冻处理相结合是提高其制片质量的关键手段。
【关键词】微小组织；冰冻快速制片病理的诊断过程中，随着各类疾病的治疗制作穿刺活检标本的需求量的增多，对于微小组织的冰冻快速制片技术运用越来越广泛[1]。
微小组织的快速制片过程由于纤维内镜、穿刺组织相对细小，且存在多黏液、多纤维成分的情况，常会出现制片问题冰晶、染色不均、切片多粒组织不全等，面对此类问题，为探究合理的解决方法，本研究选取300例微小组织开展相关对比试验，探究提高冰冻切片质量的有效方法，现报道如下[2]。
1一般材料与方法1.1一般资料本研究运用的200例微小组织来源自我院临床穿刺获得的活检标本，主要分为多粒新生组织和长条形组织[3]。
200例微小组织中，100例新生组织包括喉镜、胃肠镜、膀胱镜等穿刺标本，100例长条形组织包括肝穿、乳腺、肾穿等穿刺标本。
建立1个普通处理对照组和A.预冷冻平铺包埋、B.吸水纸处理、C.速冷冻方法3个阶段步骤实验组（只进行A步骤，进行A+B步骤、进行A+B+C三个步骤），每组各50例活检标本，其中包括多粒新生组织和长条形组织各25例。
研究一般资料不存在明显差异性（P>0.05），见表1。
表1 各组一般资料对比1.2仪器与试剂300例微小组织均采用冰冻切片机进行切片，机器工作前工作环境温度设置在-20°~-25°之间[4]。
冷冻切片法流程
冷冻切片法流程冷冻切片法可是个很有趣的实验方法呢！让我来给你讲讲它的流程吧。
一、准备工作。
咱得先把要用的东西都准备好。
像冷冻切片机得提前检查好，确保它能正常工作。
还有载玻片、盖玻片，这些小物件可不能少。
冷冻剂也得备足了，这就像是给咱们的切片准备的“小冰箱”呢。
另外，取材工具也很重要，像手术刀之类的，要锋利又干净。
标本也是关键，要选取合适的组织，这个组织得具有代表性，就像选演员一样，得挑个能把整个故事讲清楚的“主角”组织。
二、取材。
这一步可不能马虎。
要快速地把组织取出来，为啥要快呢？因为时间一长，组织可能就会发生变化啦。
就像新鲜的水果放久了会烂一样，组织放久了结构可能就不那么准确了。
取出来的组织大小也要合适，不能太大也不能太小。
太大了放不进切片机，太小了又可能切不到想要的结构，就像穿衣服一样，得不大不小刚刚好。
而且在取材的时候，要尽量减少对组织的损伤，这组织可是很“娇弱”的呢。
三、冷冻。
把取好的组织放到冷冻切片机里面冷冻。
这个过程就像是把食物放进冰箱速冻一样。
冷冻的温度得调好，不能太冷也不能不够冷。
太冷了可能会让组织变得太硬，容易碎掉，就像冰块掉地上容易裂一样。
不够冷呢，组织又切不好，软趴趴的怎么能切出漂亮的切片呢。
在冷冻的时候还要注意观察组织的状态，就像看着锅里的菜有没有熟一样。
四、切片。
等组织冷冻好了就可以切片啦。
切片的时候手要稳，就像绣花一样。
切片的厚度也很有讲究，太厚了看不清楚细胞结构，太薄了又容易切坏。
这就需要不断地练习，找到那种恰到好处的感觉。
而且切出来的切片要完整，不能缺边少角的，不然就像漂亮的拼图少了几块，多可惜呀。
五、贴片。
切好的片子要贴到载玻片上。
这个时候要小心操作，就像把小宝贝轻轻地放在床上一样。
要确保片子贴得平平整整的，不能有褶皱，要是有褶皱就像衣服没熨平一样，看着就不舒服，而且还会影响观察呢。
六、染色。
贴片完成后就可以染色啦。
染色剂就像给组织穿上不同颜色的衣服，这样我们就能更清楚地看到不同的结构啦。
冰冻切片法详细步骤
冰冻切片法详细步骤冰冻切片法是组织化学，特别是酶组织化学最常用的切片技术，固定或未固定的组织样品均可进行冰冻切片，新鲜组织冰冻切片对组织细胞内酶类保存最佳，尤其对热、酸、碱、有机溶剂等耐受能力弱的酶和化学物质更加适用。
冰冻切片也是免疫细胞化学研究中常用的切片方法，能够较完好地保存多种抗原，尤其是表面抗原的抗原性。
在冰冻切片中，组织中水分易形成冰晶，往往影响酶和抗原的定位。
一般认为冰晶少而大时，影响较小；冰晶小而多时，对组织结构损害较大，在含水量较多的组织脏器如脑、心肌、骨骼肌中上述现象更易发生。
冰晶形成的主要原因是冷冻速度缓慢，温度偏高，细胞内冷冻不均匀所致，常采取以下措施以减少冰晶的形成。
1. 骤冷通常采用骤冷、速冻(1~10°C/s 的冷冻速度）的方法可减少冰晶形成。
(1) 干冰－丙酮（乙醇）法。
将150~200 ml 丙酮（乙醇）装入小保温杯内，逐渐加入干冰，直至饱和呈黏稠状，再加干冰不再冒泡时，温度可达-70°C ，用一小烧杯(50~100 ml) 装上异戊烧约50 ml, 再将烧杯缓慢置入干冰－丙酮（乙醇）饱和液内，至异戊烧温度达-70°C 时即可使用。
将组织块（大小为1 cmX0. 8 cmX0. 5 cm) 投入异戊烧内速冻30~60s 后取出，或置恒冷箱内以备切片，或置-80°C低温冰箱内贮存。
(2) 液氮法。
将组织块平放于软塑瓶盖或特制小盒内（直径约2 cm) ，如组织块小可适抵加 OCT 包埋剂浸没组织，然后将特制小盒缓缓平放入盛有液氮的小杯内，当盒底部接触液氮时即开始气化沸腾，此时小盒保待原位切勿浸入液氮中， 10~20 s 组织即迅速冰结成块。
取出组织冰块立即置入-80°C 冰箱贮存备用，或置入恒冷箱切片机冰冻切片。
2. 冷冻保护加入冷冻保护物质以防止冻害，并在冷冻情况下保持细胞和组织的活性。
防止冻害的物质有甘油、二甲亚砜(DMSO) 、蔗糖、甘露糖、聚乙烯吡咯烧酮(PVP) 等。
甲状腺微小癌快速冰冻切片的病理分析
厚 切 片 ，光 镜 观 察 。３ ０例 Ｔ ＭＣ均 行 Ｃ ９、Ｔ Ｋ１ Ｇ、Ｐ ３免 疫 ５ 组 化 染 色 。抗 体 为 单 抗 ，按 说 明 书要 求 操 作 。
２ 结 果
２ １ 肉 眼 巨检 ．
１ 一 般 资 料 ． １ 收集建德市第一人 民医院和临安人 民医院 ２０ ０ ５年 １月 至 ２０ ０ ９年 １ ２月 甲状 腺 手 术 标 本 ５ ６例 ，均 术 中冰 冻 切 片 ， ９ 发 现 甲状 腺 微 小 癌 ２ ６例 （ 大 径 ０ １ ０ ９ ｃ ， 占 总 数 的 最 ．～ ． ｍ）
［ 中图 分 类 号】Ｒ ０ ［ 献标 识 码 】Ｂ 【 章 编 号】１０ － ６Ｘ ２ １ ）９ ０ ９ － ２ ６２ 文 文 ０ １５ ８ （０ １ — ０ ７ ０ ０
甲状 腺 微 小 癌 （ ｙｏ ｃｏ ａｃ ｏ ａ Ｔ ｔ ｒ ｉ ｍｉ ｃ ｒｉ ｍ ， ＭＣ） 指 直 径 ｈ ｄ ｒ ｎ 是
肿 物 大 多 数 为 灰 白色质 偏 硬 或 质 较 脆 区 域 ，与周 围组 织
无 明 显 界 限 ，或 呈 星芒 状 ，放 射 状 瘢 痕 ；部 分 有 砂 粒 感 。 １
例 肉 眼见 结 节 有 完 整包 膜 ：肿 物 大 多 数 位 于 组织 边 缘 ，被 膜 附近 （ ７例 ） １ ，位 于 实 质 内 ７例 ；２例 在 钙 ，２例 靠 近 被 膜 ，最 大 径 为 ０１ ～ ． ｃ ． ０３ ｍ， ５
１ｃ 或 更 小 的 甲 状 腺 癌 ，是 乳 头 状 癌 肿 的 一 种 亚 型 。 由于 ｍ 癌 肿 微 小 ．若 缺乏 经 验 或 观 察 不 仔 细 ，受 基 础 病 灶 的影 响 ，
在 常 规体 检 时 常被 漏 掉 ，特 别 在 冰 冻 切 片 、取 材 有 限 的情 况 下 。更 易 漏 诊 Ｉ 。 近 几 年 我 科 应 用 快 速 冰 冻 切 片 病 理 学 检 ］ 查 ，共 诊 断 Ｔ ２ ＭＣ ６例 ， 常规 石 蜡 切 片 和 免 疫 组 化 进 一 步 证 实为 ３ ０例 ，漏 诊 ４例 。 现 结 合 工 作 体 会 和 文 献 进 行 讨 论 ， 以总 结 经 验 ，提 高 检 出 率 ，减 少 漏 诊 。
冰冻切片的步骤要求和作用
冰冻切片的步骤要求和作用环境要求：冰冻切片是一种常用的实验技术，在生物学研究、组织学以及免疫组织化学等领域中广泛应用。
它的作用是在保持组织的形态和结构的同时，为后续的研究提供高质量的样品。
下面是冰冻切片的步骤要求和作用的详细介绍。
步骤要求：1.样本选择：选择适合冰冻切片的样本，例如组织的大小适中且不易破裂的组织。
2.固定样本：使用适当的固定剂对样本进行固定，以保持组织的形态和结构。
3.处理样本：用缓冲液对样本进行洗涤处理，去除细胞液和外源性污染物。
4.冻结样本：将样本在低温条件下冻结，最常用的方法是使用液氮或酒精浴。
5.切片样本：使用切片机将冻结的样本切成薄片，通常为10-50微米的厚度。
6.挂片或贴片：将切片移至载玻片或切片笼中，并在玻片上做相应的标记。
作用：1.保持组织形态和结构：冰冻切片可以保持组织的天然形态和结构，避免固定和染色等过程对组织产生的变性和变形。
2.提供高质量的样品：因冰冻切片的快速切割过程，可以获得高质量、无伤害的组织样品，适合各种形态和形状的组织切片。
3.便于固定和染色：冰冻切片可以便于进一步固定和染色处理，以进行组织学、免疫组织化学等研究。
4.保存组织信息：冰冻切片可以有效保存组织的蛋白质、核酸和其他生物大分子的信息，保留了研究的全面性和综合性。
5.实时观察组织结构：冰冻切片可以随时进行观察和实时分析，不需要特殊的染色处理，有利于实验结果的快速获取。
总结：冰冻切片是一种常用且重要的实验技术，在生物学研究中发挥着重要的作用。
它的步骤要求和作用都与保持组织形态和结构、提供高质量样品、便于进一步处理和观察等方面密切相关。
通过冰冻切片技术，我们可以更好地理解和研究生物体内部的结构和功能，为生物学研究的进展提供有力支持。
冷冻切片方法及注意事项
冷冻切片方法及注意事项冷冻切片是一种常用的组织学研究方法，它能够帮助研究人员观察和分析生物组织的结构和功能。
下面将详细介绍冷冻切片的方法及注意事项。
1.组织采集：首先需要选择适当的生物组织样本，可通过手术切取、尸检或动物献体等方式获得。
2.组织处理：取出组织样本后，应立即进行处理，以防止样本脱水和坏死。
可将组织放入理化盐水或生理盐水中，避免干燥、坍塌或变形。
3.固定组织：使用适当的固定剂对组织进行固定，以保持组织结构的完整性。
常用的固定剂有福尔马林、戊二醛、乙醛等。
固定时间应根据组织大小和厚度进行调节，较小的组织可以固定2-4小时，而较大的组织可能需要24小时以上。
4.预冷冻：固定后的组织应在冷冻前进行预冷冻处理，以提高冷冻切片的质量。
预冷冻的方法包括放入冷冻剂中（如液氮、干冰等）或将其放入冰盒中进行冷藏，使组织完全冷却。
5.冷冻切片：使用冷冻切片机将预冷冻的组织切成薄片。
为了获得更好的切片结果，刀片的角度和厚度需要进行适当的调整。
同时，切制时需要快速而轻柔地移动切片机，以防止组织被拉伸或损坏。
6.切片收集：将切片收集在玻片上，通常使用细长形的切片夹或切片板来收集切片。
确保切片不受损并保持平整。
7.切片保存：将切片放入适当的保存溶液中，如PBS（磷酸盐缓冲液）或甘油等，以防止切片干燥和变形。
可以根据需要选择冷藏或冷冻保存。
冷冻切片需要注意以下事项：1.样本质量：选择新鲜、完整的组织样本，避免坏死、变性或损伤的组织。
2.固定剂选择：选择适当的固定剂进行组织固定，以保持组织结构的完整性。
3.冷冻速度：组织应尽快冷却，以避免组织脱水或破坏。
冷冻速度过慢可能会导致晶体形成，影响切片质量。
4.切片机状态：保持切片机的良好状态，定期检查刀片的锋利度和调整角度，以确保切片的质量。
5.切片技巧：需要轻柔、均匀地切片，避免组织被拉伸或扭曲。
同时，切片过程中需要快速操作，以减少冰晶对组织的破坏。
6.切片收集：收集切片时要避免切片叠加或悬浮，以免影响切片的观察和分析。
冷冻切片操作指南
冷冻切片操作指南在医学、生物学和食品科学等领域中，冷冻切片是一种重要的技术，用于将样品冷冻固化后，切割成薄片以供进一步观察和研究。
本文将为读者提供一份冷冻切片操作指南，介绍冷冻切片的基本原理、实验室操作步骤和注意事项。
一、冷冻切片的基本原理冷冻切片是将样品通过快速冷冻技术使其迅速固化，然后使用切片机或显微切片机将固化的样品切割成薄片。
冷冻切片的目的是保留样品的形态和结构，避免切片过程中的伤害和变形。
冷冻切片一般适用于需要保留细胞和组织结构的实验。
二、实验室操作步骤1. 样品准备：将待切割的样品准备好，可以是细胞、组织或食物等。
样品处理过程中需要注意保持样品的完整性和活性。
2. 冷冻固化：将样品放置在冷冻剂中，例如液氮或冷冻盒中的冰水混合物中，进行快速冷冻固化。
冷冻时间需要根据不同样品的特性进行优化，一般在几分钟至数小时之间。
3. 选用切片仪器：根据实验需求，选择合适的切片仪器，可以是手动的切片机或半自动/全自动的显微切片机。
4. 切片调整：根据实验需求，调整切片仪器的切割参数，例如切片厚度和速度等。
通常，薄片的厚度在几微米至数十微米之间。
5. 切片过程：将冷冻固化的样品放置在切片仪器的切片台上，固定好，并且调整好切割参数。
使用手动或电动操作切片仪器，将样品切割成所需的薄片。
6. 切片收集：将切割好的薄片收集起来，可以使用切片刷或显微镊子等工具进行操作。
注意保持薄片的完整性和干燥，避免受到污染和损坏。
7. 切片处理：根据实验需求，进行切片的进一步处理，例如染色、免疫组化等。
三、注意事项1. 样品处理过程中需要注意保持样品的完整性和活性，避免样品受到损伤和变性。
在样品处理过程中，可以使用缓冲液或甘油等物质进行保护。
2. 冷冻固化的时间和温度需要根据不同样品的特性进行优化。
过长或过短的冷冻时间都可能导致样品质量下降。
3. 在选择切片仪器时，需要根据实验需求和预算等因素进行权衡。
手动切片机相对便宜，但操作较为繁琐；半自动/全自动的显微切片机操作更为方便，但价格较高。
组织冰冻切片步骤
组织冰冻切片步骤冰冻切片是一种常见的实验技术，用于获取生物样品的细胞或组织的薄片，以便进行进一步的研究和分析。
下面将介绍组织冰冻切片的步骤。
1. 材料准备首先，准备好所需的材料，包括冷冻剂（如液氮或干冰）、组织样品、切片刀、切片刀床、切片刀片、切片缓冲液（如磷酸盐缓冲液）和载玻片。
2. 固定组织样品将待切割的组织样品用适当的方法进行固定，比如使用福尔马林或其他适合的固定剂。
固定的目的是保持组织的形态结构和细胞的染色质形态。
3. 冷冻组织样品将固定后的组织样品置于冷冻剂中，使其迅速冷冻。
常见的冷冻剂包括液氮和干冰，其温度低于零下80摄氏度。
冷冻过程应尽量迅速，以避免组织样品的结构和细胞的形态发生变化。
4. 制备切片刀床和刀片在切片刀床上放置适当大小的切片刀片，确保刀片干净锋利。
切片刀片的角度和刀片的锋利度会影响切片的质量，因此需要定期检查和更换刀片。
5. 切割组织样品将冷冻的组织样品取出，迅速放置在切片刀床上，并用切片刀沿着组织的纵向或横向切割，制备薄片。
切割时要保持手的稳定和力度的均匀，以获得均匀且薄的切片。
6. 收集切片使用切片刀片或刷子将切割好的组织切片收集到切片缓冲液中。
切片缓冲液可以保持组织切片的湿润和形态结构。
7. 制备载玻片在载玻片上涂抹一层适当的胶水或明胶溶液，将收集好的组织切片均匀地放置在载玻片上。
确保组织切片的平整和分布均匀。
8. 干燥和固定切片将载玻片放置在室温下或烘箱中，使其干燥。
干燥后，可以使用染色剂或其他化学试剂对切片进行染色或固定，以便后续的显微镜观察和分析。
9. 显微镜观察和分析将制备好的组织切片放置在显微镜下，观察和分析组织的形态结构、细胞的类型和分布等信息。
可以使用不同的显微镜技术，如光学显微镜、荧光显微镜或电子显微镜，以获得更详细和精确的数据。
10. 结果记录和分析根据显微镜观察和分析的结果，记录和分析组织切片的特征和变化。
可以使用统计学方法对数据进行处理和分析，以得出科学结论和研究结果。
冰冻切片制备 实验步骤
冰冻切片制备实验步骤冰冻切片制备是一种常用的实验技术，用于制备生物样品的切片，以便进行显微镜观察和分析。
下面将按照实验步骤的顺序进行详细介绍。
1. 样品的准备选择合适的样品进行制备。
样品可以是细胞、组织或生物体的一部分。
根据实验的需要，样品可以是新鲜的或者固定的。
2. 样品的固定如果选择的样品是新鲜的，需要先进行固定以保持其形态和结构。
常用的固定剂有福尔马林、戊二醛等。
将样品放入固定剂中，根据样品的大小和种类，固定的时间可以从几分钟到几小时不等。
3. 样品的冰冻将固定后的样品进行冷冻以减少切片时的变形。
可以使用液氮或冰冻机将样品迅速冷冻至零下20摄氏度以下。
冷冻的时间要尽量短，避免冰晶的形成对样品造成损伤。
4. 切片仪的准备将切片仪调整到适当的工作状态。
切片仪的刀片需要保持锋利，切片盒需要清洁干净。
5. 样品的切片将冷冻的样品取出，迅速放入切片盒中。
使用切片仪将样品切片，切割的速度和厚度根据需要进行调整。
切片时要保持手稳定，避免切出的切片变形或损坏。
6. 切片的收集将切下的样品片收集到盛有PBS（磷酸盐缓冲液）的培养皿中。
这样可以避免切片的干燥和变形。
7. 样品的染色根据实验需要，可以对切片进行染色以便于观察。
常用的染色方法有荧光染色、组织学染色等。
染色后的切片需要进行洗涤以去除多余的染料。
8. 切片的保存将染色后的切片放入玻片盒中，用透明胶带密封。
存放在适当的温度和湿度条件下，避免切片的变形和腐败。
通过以上步骤，我们可以得到冰冻切片制备的样品，以供显微镜观察和分析。
冰冻切片制备技术可以用于各种生物学研究，如细胞生物学、组织学和病理学等领域。
它可以帮助我们观察样品的细节结构，了解其功能和病理变化，为科学研究和临床诊断提供重要的依据。
冰冻切片法
贴片中常见问题及处理
• 载玻片粘不上切片。此情况多见于准备片 染的载玻片温度过低，只要使载玻片与切 片间有一定温度差，切片即可贴到载玻片 上，一般将载玻片置于常温即可。’, ( 贴 片时切片易碎。排除固定不充分等因素外 ，漂片处理贴片时应注意动作轻、稳、准 。根据切片大小，选用笔尖软硬适中、大 小合适的毛笔，将笔尖伸入片下水中，往 上轻轻将切片挑起，并展开。
冷冻切片的种类
• 冰冻切片的种类较多，有低温恒冷箱冰冻 切片法，二氧化碳冰冻切片法，甲醇循环 制冷冰冻切片法等。这些方法，随着时代 的变迁，科技的发展，许多年前被认为是 非常重要的技术，现在也逐步被淘汰了。 当然有些技术，如低温恒冷箱冰冻切片法 ，正在受到青睐。
冰冻切片的制作
• 取材，未能固定的组织取材，不能太大太厚，厚者冰冻费时，大者难以切完 整，最好为24×24×2mm。 • 取出组织支承器，放平摆好组织，周边滴上包埋剂，速放于冷冻台上，冰冻 。小组织的应先取一支承器，滴上包埋剂让其冷冻，形成一个小台后，再放 上细小组织，滴上包埋剂。 • 将冷冻好的组织块，夹紧于切片机持承器上，启动粗进退键，转动旋钮，将 组织修平。 • 调好欲切的厚度，根据不同的组织而定，原则上是细胞密集的薄切，纤维多 细胞稀的可稍为厚切，一般在5～10um间。 • 调好防卷板。制作冰冻切片，关键在于防卷板的调节上，这就要求操作者要 细心，准确地将其调较好，调校至适当的位置。切片时，切出的切片能在第 一时间顺利地通过刀防卷板间的通道，平整地躺在持刀器的铁板上。这时便 可掀起防卷板，取一载玻片，将其附贴上即可。 • 应视不同的组织选择不同的冷冻度。冷冻箱中冷冻度的高低，主要根据不同 的组织而定，不能一概而论。如：切未经固定的脑组织，肝组织和淋巴结时 ，冷冻箱中的温度不能调太低，在-10- -15℃左右，切甲状腺、脾、肾、肌肉 等组织时，可调在-15～20℃左右，切带脂肪的组织时，应调至-25℃左右， 切含大量的脂肪时，应调至-30℃。
快速冷冻病理切片技术
四、不易应用范围
快速冷冻病理切片技术慎用范围： （1）疑为淋巴瘤 （2）过小的标本 （3）手术前易进行常规活检者 （4）脂肪组织骨组织和钙化组织 （5）需要根据核分裂象计数判断良恶性软 组织肿瘤 （6）根据肿瘤生物学行为特征而不能依据 组织形态判断良恶性的肿瘤 （7）已知具有传染性标本。
Hale Waihona Puke 五、操作流程快速冷冻病理切片技术
****中医院检验科
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2018.10.19
目录
一、定义 二、适用范围 三、慎用范围 四、不易应用范围 五、操作流程 六、冷冻切片所需器材耗材
一、定义
快速冷冻病理切片技术定义： 指在低温条件下使组织冷却到一定的硬 度，冷冻后组织中的水分起着包埋剂的支撑 作用。因此组织可以切成很薄的切片（410um）应用于各项检查，与石蜡切片相比， 冷冻切片不需要脱水处理，因此制片速度快 ，是为术中提供快速病理诊断的良好方法。
快速冷冻病理切片技术操作流程： （5）手术中快速活检诊断主持人必须是经 过有关训练的主治医师以上病理医师。 （6）不具备条件病理科不应该勉强开展手 术中快速活检诊断。
六、冷冻切片所需器材耗材
快速冷冻病理切片技术所需器材耗材：
冷冻切片机 免维护的十字交叉滚柱轴承 一次性窄刀片刀架 一次性宽刀片刀架 C 型刀架 可拆卸的切片废物托盘等
二、适用范围
快速冷冻病理切片技术适用范围： （1）需要确定病变性质是否肿瘤或非肿 瘤，良性肿瘤或恶性肿瘤。 （2）了解肿瘤扩散情况，肿瘤是否浸润 相邻组织有无区域淋巴结转移等。 （ 3 ）确定手术部位的手术切缘有无肿瘤 残留。
三、慎用范围
快速冷冻病理切片技术慎用范围： 涉及截肢或其它严重致残的根治手术 切除标本，需要此类手术治疗的患者其病 变性质宜于手术前通过常规活检确定。
冷冻切片快速免疫组化检测癌微小转移灶概要
冷冻切片快速免疫组化检测癌微小转移灶关键词冷冻切片；免疫组织化学；肿瘤转移中分类号R446.8 文献标识码 A文章编号1001-7399(2000)02-0164-01编者按：为了推动病理新技术的开展，福州迈新公司有志赞助本刊《技术交流》栏目，支持学术交流，促进病理新技术的普及和应用，凡其客户在本栏发表的优秀论文一律给予奖励，欢迎投稿。
在日常的术中快速病理诊断工作中，当淋巴结仅有小巢或单个癌细胞发生转移时，不容易与组织细胞等相区别。
通常可加作组织化学如网状纤维和爱先蓝等染色，但这些方法既费时，灵敏度和特异性又都不高。
为此，介绍一种在冷冻切片上利用微波炉进行免疫组化染色快速检测癌微小转移灶的方法。
1 材料与方法1.1 材料所有的免疫组化试剂均购自福州迈新公司，且都是即用型（便于操作和节省时间）。
使用微波炉时均选在低火档。
1.2 染色方法(1) 在低温冷冻切片机上作常规冰冻切片；(2) 固定：在固定液（95%乙醇和乙醚按1∶1的体积比混合而成）中浸泡1 min；(3) 滴加3%的H 2O2,微波炉2 min；(4)PBS冲洗1 min；(5) 滴加胰酶消化液，微波炉2 min（仅需要用胰酶修复的抗原才进行本步和下一步操作）；(6)PBS冲洗1 min；(7)滴加正常血清，微波炉3 min；(8)滴加一抗（如 AACT、CEA、EMA、keratin、LCA、L26、lysozyme、Mac387、UCHL-1等），微波炉15 min；(9)PBS冲洗1 min；(10)滴加二抗，微波炉5 min；(11) PBS冲洗1 min；(12)滴加S-P复合物，微波炉5 min；(13)PBS冲洗1 min；(14) DAB显色，苏木精复染，电吹风吹干，中性树胶封片。
2 结果整个染色过程约需时间40～45 min。
我们主要将本法用于术中检测乳腺癌患者腋窝无明显增大的哨兵淋巴结有否发生了微小癌的转移，在检测的 39例中，除2例因染色结果欠佳而不能确诊外，其余 37例均能准确判断，未出现假阳性或假阴性（1，2）。
快速冰冻切片组织的固定冻切与新鲜冻切的比较汇总
快速冰冻切片组织的固定冻切与新鲜冻切的比较【关键词】快速冰冻切片；固定冻切；新鲜冻切手术中快速病理诊断以往在没有冷刀设备，尤其是没有恒冷低温切片机的条件下，都采用先将送检组织固定而后冷冻切片方法。
近年来我们采用德国Leica冰冻切片机对50例送检标本分别进行加温煮沸固定冻切与新鲜冻切做快速切片作了比较。
1 方法取材与固定取材组织不能水洗，以免发生冰晶，取组织块 1 cm×1 cm×0.2 cm 2块。
放入三合一固定液(95%乙醇150 ml＋10%甲醛40 ml+冰醋酸10 ml，加热煮沸固定1 min左右，使组织迅速固定至白色变硬时，再用冷水冲洗后，用干纱布沾干。
1．2 速冻与切片将固定后的组织块与新鲜组织分别用甲基纤维素作包埋剂，置切片机箱内按下PE键10 min左右开始切片。
组织进行速冻是为避免组织因缓慢冷冻形成大的冰晶造成组织变性而产生人为假象。
固定后组织与新鲜组织冰冻切片温度-18℃~20℃。
切片时，进刀要慢，缓慢摇转使切片平整。
2 体会固定组织的冰冻切片，因组织的黏液性物质己凝固，需用蛋白甘油附贴烤片，否则染色时易脱落，所以浪费时间。
新鲜组织冰冻切片无需用蛋白甘油粘贴，组织本身的组织液等粘性物质就能粘贴牢固，而且不用烤干，仅在常温下就很快凝固。
不但节省时间，而且组织的物质成分很少受到影响，不易出现人为假象。
固定后的组织冷冻慢或混进水分等原因，易产生有害的粗大冰晶。
新鲜组织冰冻切片或切片融化后再行固定，则冰晶很小甚至无显著影响。
我们配制的三合一固定液用于冰冻切片可提高染色效果，但固定取材的组织块时，其穿透力，即固定的速度满足不了紧急的要求。
加温煮沸固定虽然可以加快固定速度，减少固定时间，但往往造成组织严重收缩和硬脆等人为改变。
所以，在条件有限的单位采用组织固定后冻切是非常必要的。
具备了恒冷低温切片机的单位应尽量采用新鲜组织直接冻切。
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微小组织快速冰冻切片法
自1891年Halsted和Accarty将冰冻切片技术列为正式诊断方法以来,国内外病理同仁在这方面做了大量工作,随着技术的不断完善,冰冻切片已成为病理科的常规工作,这为术中诊断提供了条件。
随着人们生活水平的不断提高和医学科学技术的不断发展,人们对健康越来越重视,临床医生和患者常常要求对直径小于0.3 cm的微小组织作出快速诊断,由于组织小,有时难以制片和诊断,影响了此项工作的全面开展。
为解决这一问题,在实际工作中,我们不断摸索、改进、完善,总结出了一种较实用的微小组织快速冰冻切片法,现介绍如下。
1材料与方法
1.1材料①微小组织包括纤维胃镜活检标本,肾穿刺标本,脱落细胞沉淀后剩余物等,均为我院门诊及住院部送检。
②原西德产Leitz 1720型低温恒冷冰冻切片机。
③组织包埋托的改进:找一直径为0.8～1 cm,高约1 cm的圆柱形铜质材料,一端可上螺丝,在机器所配的组织包埋托中央打一小孔,将铜质的圆柱体用螺丝与组织包埋托固定,铜质圆柱体周围缠以3～4圈医用胶布,周围略高于铜质圆柱体。
④包埋剂:取适量甲基纤维素,然后加入适量蒸馏水调成糊状,煮沸,放凉,再加入适量麝香草酚,分装于空的超声耦合剂瓶内,贮存于4℃冰箱待用。
1.2方法①开机预冷:提前开机,将低温恒冷切片机冷台及切片刀冷至-22℃左右。
②滴加包埋剂:在改进后的组织包埋托上滴加包埋剂,待冷冻好后修平,将微小组织平放于修好的平面上,冷冻片刻,修切,若是长条组织,如肾穿刺标本,组织与组织包埋托旋钮呈60°角,若是多块组织则应放置于同一平面,且不互相重叠。
③切片:用手术刀片切去组织周围多余的包埋剂。
使之成为长方形或正方形,然后开始切片,切片厚度3～5 μm。
④固定:95%乙醇或乙醚酒精混合液(乙醚,95%乙醇等量混合)固定5～10 s。
⑤染色:苏木素1～2 min,0.5%盐酸酒精分化1 s,0.25%氨水返蓝,伊红染1 min,95%乙醇3 s,无水乙醇3 s,在烘片机上烤干,封片。
2结果
组织切片完整,可连续切片,HE染色组织结构清晰,色彩鲜艳,细胞核、细胞质对比明显。
3讨论
快速低温恒冷冰冻切片是手术中病理诊断的方法之一,具有较广泛的应用,在很大程度上决定了手术的方式和治疗方案的确定,因此质量较好的冰冻切片,对病理医生和临床医生都至关重要。
对于大块组织的冰冻切片基本不成问题,既可用一块组织多切,又可再次取材,然而,对于直径小于0.3 cm的微小组织来说,材料显得尤为珍贵,要作出正确的诊断,就必须要有一张高质量的冰冻切片。
笔者将原组织包埋托进行改进,使切片刀与组织包埋托的接触面缩小,这样便于观察组织,又不至于损伤刀口,修切时防止将组织切完,有利于切片。
冰冻切片的包埋剂大致有以下几种:OCT包埋剂、纯胶水、稀释胶水(普通办公用胶水2份,加1份蒸馏水混合)、水等。
目前比较常用的是OCT包埋剂,但价格昂贵,我们用甲基纤维素做包埋剂,甲基纤维素广泛用做增稠剂、医学胶粘剂和保护胶体等,由于在低温下极易固化,在固定和染色过程中即溶于水,对组织和细胞结构无影响,且价格低廉,经过20余年的应用,取得了满意的效果。
笔者认为,甲基纤维素包埋剂不仅可用于微小组织的冰冻包埋,而且适用于所有的组织的冰冻切片,完全可以替代其他包埋剂。
微小组织由于直径一般小于0.3 cm,在放置多块组织时,速度要快,使多块组织在同一平面上,且不互相重叠,修切时进刀要慢,防止将组织修完,防卷板要调节合适,切片刀和防卷板要保持清洁,当切片刀上有霜时,用有机玻璃片刮除,这样便于连续冰冻切片,有利于病理医生观察不同切面,利于病理诊断。
本文介绍的方法有以下几个特点:①冰冻切片迅速及时,整个过程仅需几分钟。
②将组织包埋托进行改进,不易损伤切片刀,不易将组织修完。
③切片质量好,染色鲜艳。
④用甲基纤维素代替OCT做包埋剂,节约大量经费。